1、临床生化干扰实验批准指南作 用 对厂商来说,通过EP7EP7程序能够筛选潜在干扰物质,量化干扰效应,证实病人样本中的干扰,确认分析方法对干扰物质的敏感性,评估潜在的风险,并将有意义的干扰声明提供给用户。关于临床实验室来说,通过EP7EP7的调查策略,规定数据收集和分析要求,确认干扰声明,研究明确的干扰物质带来的结果差异,确保分析方法符合临床要求 。主要内容n干扰相关概念与理论n适用范围 n干扰实验的判断标准 n干扰分析前的质量保证 n干扰测定n用病人标本评价干扰 n建立、确认和验证干扰声明 n调查分析与临床不一致的病人结果 术 语分析物(Analyte)(Analyte):实验室测试的物质或者
2、成分 干扰物(Interferent)Interferent):样本中不同于分析物并能引起测量偏倚的成分 干扰:在临床生化中,由于另一成分影响或样本的特性,待测一定浓度的被分析物出现有临床意义的偏倚 干扰标准:干扰物所允许的最大结果偏倚干扰敏感度:某一分析方法对来自其他成分或者样本特性的干扰引起误差的敏感性 术 语干扰声明:一种物质影响分析方法结果效应的陈述干扰筛选:分析系统评价中,利用高浓度样品进行一系列能鉴别有估计发生干扰的物质差异结果/异常结果/假性结果(Discrepant Discrepant result/Anomalous results/Spurious results)res
3、ult/Anomalous results/Spurious results):一种与临床不一致的结果,或同一标本的另一个不同结果,或与其他方法不同结果,或与已确定的临床诊断不相符的结果 术 语内源性干扰:样本中的一些生理物质(例如胆红素、血红蛋白),),可对另一些物质分析时引起干扰。外源性干扰:一种源自体外的物质(例如,药物或其代谢物,防腐剂,污染物),),可对样本中另一物质的分析引起干扰。术 语验证(validationvalidation):):通过调查及提供客观证据,证实能够满足某期望用途的特定要求。(users(usersrequirements have been met(ereq
4、uirements have been met(e、g g、,accuracy requirements for patients,accuracy requirements for patients results)results)确认(verification)(verification):通过调查及提供客观证据,确认满足了特定的要求。(specified criteria have been(specified criteria have been met(emet(e、g g、,interference criteria or interference,interference cri
5、teria or interference claims)claims)适用范围 1 1、适用大部分析方法和仪器,特别方法估计需要必要的调整,如分离技术和免疫学分析方法在附录A A中被讨论。2 2、血清、血浆、全血、脑脊液、尿和其它大多数体液等标本类型都可用本指南评估 3 3、适用以下干扰物质:n病理情况下的代谢物,如胆红素、脂肪、蛋白质、血红蛋白等;n病人治疗期间引入的物质,如药物、肠外营养、血浆代用品、抗凝剂等;n病人吸收的物质,如药品滥用、营养补充等;n标本准备引入的物质,如抗凝剂、防腐剂等;n标本处理过程中引入的污染物,如手霜、滑石粉、促凝剂等;n标本自身的基质效应,其理化性质跟理想的
6、新鲜标本不同。适用范围1 1、干扰对不准确度的影响 不准确度(总分析误差)包括不周密度、方法特异性偏倚和样本特异性偏倚(干扰),),对干扰物质的敏感性能够引起系统误差和随机误差。基本概念2 2、分析前效应 分析前分析物或者它的浓度的改变通常称为“分析前效应”,这些作用估计会影响实验结果的临床应用,但不能视作“分析干扰”。这些作用:n体内药物作用,如使用药物后因生理响应使激素浓度变化n标本处理,由于蒸发、溶血或者血清长时间不分离使电解质、蛋白、水含量改变n标本收集,如在静脉滴注时(内含分析物)取样 基本概念3 3、绝对干扰与相对干扰 干扰作用可看成是绝对的或相对的p 绝对干扰:一般病人标本中含有
7、某物质,一 旦它的存在即会引起干扰。p 相对干扰:一般病人标本中含有某物质,其含量相关于混合样品中的平均浓度,不同病人样品中含有该物质的浓度变化引起干扰作用的变化,相对干扰作用在临床实验中更有意义。基本概念基本概念相对干扰 一些方法能够校正干扰物的平均浓度做补偿,以使病人标本中的干扰效应减小到最低,有代表性的方法包括样品前处理、设置空白对比、标准血清校准和数学校正,当干扰物的浓度大于或者小于病人样本中的 平 均 浓 度 时 将 引 起 误 差。基本概念4 4、干扰机制 由于某干扰物的存在以多种方式影响分析过程,主要机制:u物理作用 干扰物具有的物理性质,使它与分析物一样被检测出来,如颜色、光散
8、射(光吸收)、洗脱位置、电极响应等。干扰物估计会改变标本的物理特性,如表面张力、黏度、浊度、离子强度等,干扰检测结果。基本概念4.4.干扰机制u化学作用 n干扰物估计会影响酶活力,例如,阻止金属激活剂结合到活性中心上去,氧化必须的巯基等。n干扰物也可破坏或阻止反应,例如,破坏试剂或抑止指示反应。n干扰物也可改变分析物的形式,例如,形成复合物或沉淀。基本概念4 4、干扰机制u非特异性 干扰物估计和分析物以同样的方式参与反应,例如,苦味酸肌酐方法中酮酸干扰,重氮胆红素方法重吲哚酚硫酸盐的干扰。在免疫化学方法中干扰物和抗体发生交叉反应。例如,茶碱方法中咖啡因的干扰。基本概念4 4、干扰机制u水取代作
9、用 非水物质(蛋白质、脂质),),由于取代了血浆中部分水体积,影响了一些分析物的测定。这些作用考虑或不考虑为干扰作用,取决于要求的结果是以总体积的浓度表示,依然以血浆水的浓度来表示。干扰实验的判断标准 n为保证客观性,可接受标准必须在评价实验操作之前就确定。n建立可接受标准时,必须考虑临床意义和统计学意义两者之间的差别。1 1、临床可接受标准p基于生理变异p源于临床经验p基于被分析物变异干扰实验的判断标准 2 2、统计学意义n在确定一个物质是否存在干扰前,首先确定所得到的结果是否有统计学意义。3 3、分析物检测浓度 干扰应该在两种医学决定浓度被评估,假如在一种浓度上进行测试,要注意有估计漏过在
10、其他分析物浓度水平上有临床意义的干扰。干扰实验的判断标准 干扰实验的判断标准4 4、干扰物检测浓度 决定一种物质在“最坏情况”的条件下是否会产生干扰,干扰筛选应该在实验室期望观察到的最高浓度水平的病人样本中进行。5 5、潜在的干扰物质干扰分析前的质量保证在进行一个干扰实验之前,必须进行:n培训和熟悉n周密度确认-EP5-EP5临床生化设备性能的周密度评价 n准确度确认 -EP9-EP9 利用病人样本进行方法学比较和偏倚评估 n携带污染评价n质量控制-C24-C24 内部质量控制实验:原理和定义 n标准化防范M29 M29 实验室工作人员幸免职业感染 n安全性和废物处置-参照厂商的标签和材料安全
11、数据表(MSDSMSDS)干扰测定(Determination of interference Determination of interference characteristics)characteristics)第一种方法:评价潜在的干扰物添加到样本后的干扰效应(干扰筛选)第二种方法:评价个别有代表性的病人结果与高特异性的比较方法的结果偏倚(用病人标本评价干扰)干扰筛选 将阳性干扰物加入测定样品中,与不加的对比组比较有无偏移,称为“配对差异”实验。一般最有效的方法是在较高浓度下对系列估计的干扰物作初步筛选,假如临床显著意义,则该物质不是干扰物,无须进一步实验。反之,具有临床显著意义的,
12、应进一步评价以确定干扰物浓度与干扰程度间的关系,这类实验称为“剂量效应”(dosedoseresponseresponse)实验实验设计1 1、测试组和对比组在同一个分析批内完成;2 2、计算重复测量次数:n有临床意义的最小差异值;n假设检验水准;n重复性(批内周密度)。实验材料1 1 基础标本(Base poolBase pool)从几个健康的、没有进行药物治疗的个体获得适当类型(血清、尿等)的新鲜样本,基础样本应能反映样本基质,能反映分析物的特点 。合适的冰冻或冻干样本,确认测试材料是否与临床样本相似 计算所需样本量 测定基础标本中分析物的浓度并用合适的纯物质调整测 试管的分析物浓度到医学
13、决定浓度,应幸免加入分析物时引入其他物质,推荐的分析物测试浓度见附录 B B。实验材料2 2、贮存液 l获得合适而纯的潜在干扰物,或者该物质最接近体内循环状态的形式 l选择一种能够充分溶解分析物的溶剂 l尽估计小地稀释样本基质,最好小于5%5%。假如溶解度允许,通常配制成浓缩的2020倍的贮存溶液l有机溶剂需要特别的对待,氯仿至少要求 1 1:100 100 的稀释倍数,乙醇浓度大于1 12 2时能够使抗体变性。3、对比样本n用制备贮存液相同体积的溶剂替代测试干扰物,其他要求与测试样本相同。假如对比样本中存在测试物质(比如胆红素),),使用合适的分析方法确定它的浓度。假如对比样本中被分析物浓度
14、与基础样本中明显 的不相符,考虑溶剂为潜在的干扰物。实验材料重测次数要求n重测次数取决于统计学假设水准 当有效假设检验不能确定干扰的方向(正的或负的)时使用双侧检验,当有效假设检验包括干扰的方向(正的或负的)时使用单侧检验重测次数要求n双侧检验:nZ1-Z1-/2/2:100(1100(1)%)%的置信水平,nz1z1 :100100(1 1)检验效能,ns s 是重复性标准差。nd max d max 是分析物在测试浓度范围内的最大允许干扰。n单侧检验:用Z Z 1-1-代替 Z Z1-1-/2/2n z z百分位值:重测次数要求n z z百分位值:举例:检测可接受干扰程度为1 1、5 mg
15、/dL 5 mg/dL 的干 扰效应,9595(0 0、0505)检验水准时,重复性(批内周密度)为1 1、0mg/d L,0mg/d L,计算重复次数:重测次数要求n批内标准差(d max/sd max/s)的倍数:9595(0 0、0505)检验水准时检测不同的干扰效应所需的重测次数如下:重测次数要求批内标准差(d max/sd max/s)的倍数:举例n在1mg/dL 1mg/dL 肌酐浓度水平,批内重复测定的标准差为0 0、075 075 mg/dLmg/dL,实验室认为 0 0、1mg/dL1mg/dL是一个有意义的干扰。需要测定多少次,估计干扰能被检测到？n首先,把不精确度表述为批
16、内重复测定的标准差的倍数:0 0、1mg/dL/01mg/dL/0、075 mg/dL=1075 mg/dL=1、33 33。n将1 1、3333向前舍入一位为1 1、3 3,上表决定重复测定次数,得出在9595(0 0、0505)检验水准时,每个对比和测试样品需要重复测定1616次。重测次数要求实验程序“配对差异”实验:1)1)合适的分析物浓度;2)2)建立有临床意义差别的标准(d max d max););3)3)确定每个样品所需的重复测量次数;4)4)准备临床基础标本;5)5)准备2020倍的浓缩贮存液(潜在干扰物),),假如使用另外一种浓度)确定,依照步骤6 6和8 8稀释(推荐浓度见
17、附表C C);n6)6)用吸管吸取1/201/20容器体积的浓缩贮存液到 容量瓶中,称为测试样品,n7)7)用基础液补足到刻度体积,充分混匀;n8)8)用吸管吸取1/201/20容器体积的制备贮存液的 溶剂到第二个容量瓶,称为对比样品。n9)9)基础液补足体积,充分混匀;n10)10)准备能够被n n整除的测试样本和对比样本,重复测定次数n n由第三步确定;实验程序11)11)按交互的顺序分析测试(T T)和对比(C C)样本;假如检测系统受携带污染影响,增加额外的样本使对比样本免受来自测试样本携带污染的影响。增加的额外对比样品CxCx结果应舍弃。12)12)记录结果,进行数据分析。实验程序数
18、据分析、1 计算观察到的干扰效应的“点估计”,即dobs dobs,是测试样本均值和对比样本均值之间的差值。2 计算cut-off cut-off 值c c(双侧检验)nullnull是无效假设规定的值,通常0 0,关于单侧检验,用 Z Z1 1 取代 Z Z1 1/2/2 。3 3、计算95 95 置信区间的干扰效应95 95 置信区间数据分析s s是测量方法重复性的批内周密度,n n是每个样本的重复测量次数,t t0 0、975 n-1975 n-1为 t t 检验数值表中9797、5%5%和 n-1 n-1 的自由度时的值(n 30n 30,2 2、0 0是t0、975 n-1的合理近似
19、值)。结果解释 假如点估计d dobsobs值小于或等于cut-offcut-off值dcdc,能够得出某种物质引起的偏倚小于d d max max;否则,接受有效假设,说明由该物质引起干扰的假设成立。当解释干扰测试结果时考虑以下情况:n由于吸样错误,真实的干扰估计不同于观察到的“点估计”。假如无效假设成立,置信限100100(1 1)接受它;假如有效假设检验成立,置信限100100(1 1)接受它。相反置信限分别为 100 100 和 100 100 。n假如被检物为非人血清成分检测,估计会引入人造物品的误差 n测试浓度的随意选择估计不显示干扰结果解释n当一种或多种分析物的浓度出现干扰效应,
20、则可通过剂量效应曲线确定不同干扰物浓度干扰程度,干扰物不同浓度可通过最高值干扰物浓度样本和对比样本混合制备。n一般情况下,做剂量效应曲线时每个测试浓度水平重复测量三次足够。如计算每个浓度所需的重复测量次数,也可用附录中公式计算。“剂量效应”实验测试材料1、基础标本2 2、贮存液3 3、高浓度样本-用基础标本稀释贮存液,制备成所 需的浓度。4 4、低浓度样本 准备一组低的含平均浓度的干扰物的临床样本,在大多数情况下,治疗药物,或血红蛋白、胆红素能够忽略不计,低浓度样本的制备可参照对比样本的制备方法 测试材料5 5、测试样本-制备一系列不同浓度的干扰测试样本,通常五个浓度足够确定一个线性的剂量效应
21、关系。剂量效应实验程序1)1)测定待测的最高和最低标本浓度水平;2)2)确定被认为“有临床意义”差别,假如曾做过“配对差异”实验,这一步差不多完成;3)3)确定在每个浓度重测次数 n n(见附录 E E),),通常3 3次;4)4)准备高中低系列浓度样本;剂量效应实验程序5 5)依照第三步n n值的大小准备每份标本量;6 6)在同一分析批之内检测5 5个样本的浓度,第一组依照升序测定各样本,第二组按降序测定,第3 3组依照升序等等,平均系统漂移影响;或按随机顺序检测所有样本,达到最小化漂移效应;7 7)计算低浓度样本的平均值,其他各组结果中减去该低浓度样本的平均值,然后把最终净结果填入表格中进
22、行数据分析。数据分析n将结果点在图上,y y轴为干扰结果,x x轴上为干扰物浓度,观察剂量效应关系曲线的形状:线性效应 非线性效应线性效应 n数据随机分布,大约成一条直线,用最小二乘法进行回归分析,在图上划出回归直线,确定适合所有数据点,其效应曲线是线性。n与干扰物浓度相关线性干扰举例:线性效应 五个浓度水平的剂量效应线性关系结果线性效应 剂量效应回归分析线性效应 线形回归的95%95%可信区间范围从干扰物浓度与置信区间改变大小的函数能够看出,在95%95%置信区间内结果最可信的是中间干扰物浓度范围 非线性效应n干扰物浓度的干扰估计不是一个线性函数,假如绘图的数据显示是弯曲的,那么对一个给定的
23、干扰物浓度的干扰程度的适当估计能够用图解形式表示 。举例:非线性效应五个系列浓度剂量响应非线性结果 非线性效应非线性剂量效应回归分析 任何浓度水平的干扰物的干扰程度能够从图表中被估计,也能够用非线性回归方程计算。回归线斜率代表每单位干扰物的偏倚,y y轴上的截距表示内源性干扰浓度的校正,通过回归方程或者图表,任何干扰物浓度水平的干扰程度都可被估计。假如斜率是正的,实验显示该物质引起一个正的干扰。结果解释分析物和干扰物联合评价n在单一的实验中,干扰物浓度和分析物浓度在检测过程中有组织设置,两个或更多潜在干扰物能被更有效同时检测,单一成分的干扰效应可通过单因素分析方法评估,多因素实验设计描述,参见
24、BoxBox和HunterHunter文献。n优点:提高效率和提供更多的信息,干扰物质之间及干扰物与分析物之间的相互作用都能被评价。不足之处是样本准备更加复杂,增加了人为误差发生的估计性。干扰筛选的局限性n在临床标本中的真实干扰物估计不是原来的药物,而是代谢产物。n实验标本基体并不代表典型的有问题的临床标本。n加入的物质与临床标本中的干扰物不相同,例如,蛋白结合、沉淀,或不均一性(异质性)。n实验水平估计选择得太高或太低以至不真实。干扰测定第二种方法:用病人样本评价干扰 l第一种方法不论考虑多么全面,在病人的血清标本中估计遇到意想不到的干扰。为了最大程度的减少这种情况的发生,应该分析来自病人的
25、真实标本以评价内在的不同血清标本间的变异性。假如某个标本中出现一个可重复的“离群值”,则说明该标本中有未知的干扰物质存在。实验设计l被评价的方法和参考方法(或者其他被认定合格的比较方法)同时测定两组病人样本(测试组和对比组),),假如测试组与对比组结果出现有意义的偏倚,存在干扰。l参考方法或比较方法对干扰物有低敏感性。测试标本n选择原则:疾病(例如,来自心脏病、肝病或肾病病人的标本);药物(例如,使用过某种想了解的药物的病人标本);n其他不正常组分(例如,具有不正常胆红素、脂质、血红蛋白或蛋白的标本)。对比标本选择原则:n没有使用目标药物;n潜在干扰物质在正常浓度范围内;n相同或者相似诊断;n
26、分析物分布状态与测试标本相似;n对比样本必须包括在每一分析批内。实验程序1 1、计算测试标本和对比标本数,取决于:n两种方法周密度;n干扰效应的大小;n规定的假设检验水准。2 2、挑选测试组和对比组标本;3 3、选择合适的参考方法或者效果较好的比较方法;4 4、在尽估计短的时间内(通常在两个小时内),),用两种方法重复测定每个样本。5 5、假如观察到偏倚存在,测定样本中药物或者其他潜在的干扰物质的浓度,假如估计的话,确定偏倚和干扰物浓度两者之间的关系。实验程序数据分析 n计算测试组和对比组平均值之间的差值,并与干扰标准进行比较,然后确定干扰能否被排除或者需要进一步的研究。1 1、与比较方法结果
27、作偏倚图n计算重复测定结果的均值;n计算每个样本平均偏倚(测试方法结果减去比较方法结果););n作图:偏倚在垂直轴上,比较方法浓度在水平轴,测试和对比样本用不同的记号标识;n通过线性回归分析计算每一组的Sy,x Sy,x 统计量(比较方法x x),),它可用于计算9595置信区间。数据分析 2 2、估计干扰的偏倚评估:数据分析 (A A)相关于对比组的正偏倚 (B)(B)相关于对比组没有偏倚成比例的方法偏倚 (C)(C)相关于对比组的负的偏倚 (D)(D)相关于对比组没有偏倚 3 3、以潜在干扰物绘制偏倚曲线 假如病人标本中可疑干扰物的浓度已知,能够判断它是否与获得的偏倚相关 。数据分析 一种
28、与潜在干扰物浓度相关特别好的干扰效应用病人样本评价干扰-局限性(1 1)对实验变异缺乏控制对比(2 2)本方法并不能确定原因与作用的关系,它只能说明偏倚与估计干扰物某水平的相对关系(3 3)假如标本不新鲜,将会失去某些易变组分(例如,乙酰乙酸、CO2CO2等)用病人样本评价干扰局限性4 4)病人通常用多种药物,因此,难于证实何种药物的干扰作用5)5)按疾病和用药对病人分类,不是不估计,至 少对许多实验而言是特别困难的6)6)实验是一种机遇,成功取决于在检测的病人人群的标本中是否有此干扰存在7)7)特别少有公认的参考方法。有的参考方法难以在常规实验室中使用。另外,参考方法估计也同样的被干扰。不管
29、如何,第二种方法对证实干扰物是有用的,这也是唯一的方法可检出药物代谢物干扰作用,它也可肯定在真实标本中有干扰的方法。用病人样本评价干扰-局限性建立、确认和验证干扰声明nEP7-AEP7-A可被厂商用于验证和确认特异性,建立干扰声明,临床实验室也可用它检验厂商的声明以及确认方法的特异性是否满足医学要求。干扰声明n 关于商业方法来说,已知的干扰物质应在使用明书中阐述,实验证明没有干扰的物质也应该阐述,以便实验室能够验证某种方法对它所服务的病人群体的习惯性干扰声明-举例1 11 1、干扰物系列浓度的结果 n依照 EP7EP7文件,对 ASTAST方法进行干扰评价。当下列这些物质添加到血清中时,在显示
30、的浓度水平处产生干扰,偏倚超过1010考虑为干扰。测试物质AST 25U/L的干扰浓度AST 200U/L的干扰浓度注释血红蛋白250mg/dL325mg/dL溶血N-乙酰半胱氨酸150mg/ml300mg/ml静脉注射治疗剂量为180mg/ml干扰声明-举例2 22 2、胆红素方法两个水平的干扰筛选 依照EP7EP7文件,对胆红素测量方法进行干扰评价,当血清中分析物和干扰物浓度达到表中所显示浓度时,以下物质产生干扰,偏倚超过0 0、2mg/dL2mg/dL考虑为干扰。干扰物干扰浓度分析物(mg/dl)偏倚(mg/dl)注释血红蛋白300g/dl300g/dl1、216、5-0、4+0、5肉眼
31、可见溶血N-乙酰半胱氨酸90mg/dl90mg/dl1、216、50、2-0、6静脉注射治疗剂量对氨基水扬酸50mg/dl50mg/dl1、216、50、2+0、3中毒剂量确认干扰声明n干扰和特异性声明可用实验方法确认,合适的方法依赖于声明类型。声明类型:(1 1)最大干扰声明(干扰小于一个规定的最大值)(2 2)实测干扰声明(1 mg/dL 1 mg/dL 镁存在时,正常血清标本组 钙离子浓度比对比组高0 0、14 mg/dL 14 mg/dL)(3 3)非定量干扰声明(据报道甲氨蝶呤对该方法可产生干扰)(4 4)特异性声明(水杨酸盐对该方法不产生干扰)调查与临床不一致的病人结果 每个实验室间或会遇到与临床不一致的结果,该结果估计被临床医生认为与诊断不相符或者与往常结果不一致,或者在实验室内两种方法检测的结果有差异。假如实验室对一个特定病人的结果的差异可被重复,且该方法符合标准,那么出现的差异估计由干扰引起。调查程序(1 1)确认系统性能 (2 2)评价样本质量 (3 3)证实最初的结果 (3 3)确定潜在的干扰物质(4 4)测定估计的干扰物 (5 5)评价干扰效应(6 6)报告厂家感谢您的聆听！
