1、实验诊断学及其常用检测项目的临床意义主要授课内容实验诊断学概念与展望血液和尿液的常规检验生物化学常规检验临床免疫学的常规检验临床微生物学常规检验分子生物学检验实验诊断学概述f一、实验诊断学概述（一）基本概念f实验诊断（laboratory diagnosis）f临床实验室对采自病人的样本进行检测、分析，所得到的信息为临床预防、诊断、治疗疾病或预后评价提供参考，整个的医学活动即为实验诊断。实验诊断学与检验医学相同点：核心都是检验。异同点：研究和教学的目的各有侧重。实验诊断学：以检验结果的临床应用为目的检验医学：以检验方法的研究和改进为目的（二）分类（内容）f 根据实验诊断学的内容，分为：血液学检
2、验体液排泄物检验生物化学检验临床免疫学检验临床病原学检验分子生物学检验（三）现状与发展趋势f 实验诊断学现状：诊断学的子学科独立的学科手工操作高度自动化定性分析定量分析常量分析微量分析现状与发展趋势f 发展趋势个体化诊断：遗传基因、后天突变、疾病基因、代谢特征、药物敏感性床边检测（POCT）：血糖尿糖、凝血状态、心肌损伤、酸碱平衡状态、感染性疾病、药物水平检验中心：社区医院、专科诊所、或特色检验项目（四）临床危机值电解质：K、Na、Ca；血糖血常规：WBC、RBC、PLT血 气：pO2、pCO2、pH凝 血：PT、APTT、INR 心肌酶：TNT、CK-MB质量血培养：血标本细菌培养f二、血液
3、检查（一）白细胞系列参数fWBC：白细胞数量，正常人参考为4-10 109/LfNE%：中性粒细胞百分比，正常参考为50%-75%fNE#：中性粒细胞绝对值fLY%：淋巴细胞百分比，正常参考为20%-40%fLY#：淋巴细胞绝对值fMO%：单核细胞百分比，正常参考为3%-10%fMO#：单核细胞绝对值fEO%：嗜酸细胞百分比，正常参考为0.5%-5%fEO#：嗜酸细胞绝对值fBA%：嗜碱细胞百分比，正常参考为0-2%fBA#：嗜碱细胞绝对值中性粒细胞变化临床意义生理性变化：新生儿WBC升高，一般在15109/L；34天降至10109/L左右；3月后接近成人水平。运动、疼痛和情绪影响：当剧烈运动
4、、疼痛和激动时，WBC，以N为主，为循环池和边缘池细胞重新调配的结果。日间变化：在安静和休息时WBC较低；活动和进食后较高；下午高于上午；一日之内最高值约为最低值的12倍。妊娠与分娩：妊娠5个月，WBC。通常在(1217)109/L，分娩时疼痛和产伤可更高，如无并发症产后2周左右恢复正常。中性粒细胞变化临床意义病理性增多急性感染：化脓性球菌严重的组织损伤或大量的血细胞破坏急性大出血急性中毒肿瘤性增多骨髓增殖性疾病中性粒细胞变化临床意义病理性减少某些感染：沙门菌感染，病毒感染某些血液病慢性理化损伤自身免疫性疾病脾功能亢进（二）红细胞系列参数fRBC：红细胞数量，正常参考男性为4.0-5.5 10
5、12/Lf 女性为3.5-5.0 1012/LfHgb：外周血中Hb浓度，正常参考为110-160 g/LfHct：血细胞压积，也可指红细胞压积，f 正常参考为0.35-0.50fMCV：平均红细胞体积，正常参考为80-100 fLfMCH：平均红细胞Hb含量，指平均每个红细胞含Hb量f 正常参考为27-34 pgfMCHC：平均红细胞Hb浓度，指红细胞中Hb浓度，f 正常参考为320-360 g/LfRDW：红细胞分布宽度，正常参考为11.5%-15%红细胞增多的临床意义生理性增多：新生儿、高原生活、剧烈运动、精神因素等。病理性增多相对性增多：血浆水分丢失，有形成分相对增加，绝对值没有发生变
6、绝对性增多：继发性：心、肺疾病、异常血红蛋白病、某些肿瘤等原发性：真性红细胞增多症红细胞减少的临床意义生理性减少：儿童、孕妇、老年人。病理性减少：骨髓造血功能低下，如再障。造血原料缺乏，如缺铁贫、巨幼贫。红细胞破坏增加，如溶贫。红细胞丢失过多。（三）血小板系列参数fPLT：血小板数量，f 正常参考为100-300 109/LfMPV：平均血小板体积，f 正常参考为6.5-12.5fLfPct：血小板压积，f 正常参考为0.108%-0.271%fPDW：血小板分布宽度，f 正常参考为11.5%-18%（f三、尿液检查（一）尿液理学检查尿量颜色及透明度比密尿渗量气味f尿 量f尿量取决于肾小球的滤
7、过率和肾小管的重吸收f尿量变化与气候、饮水量和食物等有关正常成人：1,000-2,000 ml/24h新生儿：30-60 ml/24h，婴儿：100-150 ml/24h儿童：500-1000 ml/24hf 无尿f（anurina）f 少尿 f(oliguria)f 多尿 f(polyuria)f 正常f(normal)fl00ml f400ml f1500ml f2500ml 颜色和透明度尿色随尿量的多少、饮食（酸度）、药物及病变而改变。正常新鲜尿为淡黄色、清晰透明。新鲜尿液发生浑浊的原因尿酸盐沉淀：加热或加碱后溶解。磷酸盐或碳酸盐沉淀：碱性尿中出现，加酸后溶解，碳酸盐溶解时有气泡产生。尿
8、液比密(SG)测定比密被用于度量肾脏在维持机体内环境稳定中的浓缩稀释能力，即肾小管功能重要指标。高比密尿：高热脱水、蛋白尿、糖尿、急性肾小管肾炎、心功能不全；尿有造影剂低比密尿：尿崩症、高血压、慢性肾炎、肾盂肾炎；使用利尿药物 注意事项：高糖、高蛋白、高尿素氮，尿比密应进行校正。X线造影剂、右旋糖酐、甘露醇等使比密升高。连续测定尿比密比一次测定更有价值。尿液气味f 尿液气味是尿中溶解物质浓度的指标正常尿液：可受食物或药物影响，尿液气味发生改变 病理性尿液：新鲜排出的尿液即有氨臭味提示有慢性膀胱炎、慢性尿潴留等；烂苹果味则提示有糖尿病酮症酸中毒；腐臭味提示有泌尿系感染或晚期膀胱癌；大蒜臭味提示有
9、机磷中毒；“老鼠尿”样臭味提示有苯丙酮尿症。（二）尿液化学检验液酸碱度比重蛋白葡萄糖酮体胆红素胆原亚硝酸盐红细胞白细胞（三）尿沉渣（尿有形成分）细胞红细胞肉眼血尿：每升尿液中含血量超过1ml，肉眼可见到不同程度混浊红色的尿液显微镜血尿：血液含量在0.1%以下，外观无血色，镜下红细胞平均/HPF的尿液白细胞：正常尿液中可偶然见到12个WBC/HPF，如5个或5个以上白细胞为增多。泌尿系统炎症泌尿系统附近器官炎症肾移植术后排斥反应尿沉渣（尿有形成分）管型腊样管型透明管型颗粒管型细胞管型红细胞管型白细胞管型上皮细胞管型混合型管型（四）结晶生理性结晶草酸钙结晶尿酸结晶马尿酸结晶磷酸盐类结晶病理性结晶胆
10、红素结晶胱氨酸/亮氨酸/酪氨酸结晶胆固醇结晶含铁血黄素颗粒药物结晶f四、生化检查（一）肝脏功能检查肝实质损伤ALT AST胆汁郁积-GTALP5-NT肝纤维化MAOPH（二）肾脏功能检查肾小球滤过功能内生肌酐清除率试验血清尿素肌酐尿酸测定、血2-MG CysC 尿Alb/Ig肾脏功能检查近端肾小管功能排泌功能：酚红排泄试验重吸收功能：尿氨基酸、葡萄糖重吸收 TmG/2-MG/1-MG肾脏功能检查远端肾小管重吸收功能浓缩稀释试验 尿渗量、血浆渗量渗透清除率自由水清除率（三）脂代谢检查胆 固 醇（THOL）甘油三脂（TG）脂 蛋 白高密度脂蛋白（HDL）低密度脂蛋白（LDL）载脂蛋白载脂蛋白A（A
11、po-A）载脂蛋白B（Apo-B）载脂蛋白a（LP(a)）f五、免疫学检查IgG单体Ig，占总Ig的70-80%。病毒、细菌、寄生虫抗体。生高：各种慢性感染、淋巴瘤、SLE等降低：体液免疫缺陷病、联合免疫缺陷病、重链病、轻链病等。IgA：分为血清型和分泌型，血清型占总Ig的10-15%，后者存在于分泌物中。升高：SLE、类风关、肝硬化、肾病；降低：反复呼吸道感染、重链病、轻链病、免疫缺陷病、自身免疫性疾病和代谢病。（一）免疫功能检测免疫功能检测IgM：初次免疫应答反应中的Ig，最早出现，分子量最大。占总Ig的5-10%。升高：病毒感染早期、肝硬化、SLE、类风关、肝硬化、肾病；降低：先天性免疫
12、缺陷病、代谢病。免疫功能检测细胞功能检测流式细胞（仪）技术。T细胞花结形成试验（E玫瑰花结形成试验）T细胞转化试验T细胞分化抗原测定*：白细胞分化抗CD）CD3+总T细胞CD3+/CD4+T辅助细胞CD3+CD8+T抑制细胞（二）肿瘤免疫检测肿瘤标志物（tumor marker,TM）f 由肿瘤细胞直接产生或非肿瘤细胞经肿瘤细胞诱导后合成的一类物质，包括蛋白质、激素、酶或多胺等，存在于人体组织、细胞、血液或体液中，可以通过是其否存在或含量的高低反映肿瘤的存在和/或生长情况。特定的TM可以提示或确定某一部位肿瘤。定期检查各种TM，有可能早期发现肿瘤。肿瘤若治疗（手术切除、放疗或化疗等）有效，相应
13、的TM会明显减少。有复法或转移后，相应的TM可能再次增加。肿瘤免疫检测-AFP定义甲胎蛋白（AFP）是胎儿发育早期，由肝脏和卵黄囊合成的一种血清糖蛋白，胎儿出生后不久即逐渐消失。参考值血清 25g/L临床意义原发性肝细胞癌，77.1%患者明显升高（300g/L）。但也有18%患者可无AFP升高生殖腺胚胎性肿瘤，如睾丸、奇胎瘤和卵巢肿瘤等，血清AFP升高。病毒性肝炎、肝硬化，可有不同程度的升高，但其水平300g/L。肿瘤免疫检测-CEA定义癌胚抗原（CEA）是一种结构复杂的可溶性糖蛋白，胚胎期主要存在于胎儿的胃肠道、胰腺和肝脏，出生后组织内含量很低。参考值血清 5g/L临床意义胃肠道肿瘤，尤其是
14、结肠癌、直肠癌（术后复发）、胃癌、胰腺癌等其他部位肿瘤：乳腺癌、肺癌胃肠道肿瘤术后或化疗的疗效观察肿瘤免疫检测-CA19-9定义糖链抗原19-9（CA19-9），又称胃肠癌相关抗原，是一种与胰腺癌、胆囊癌、结肠癌和胃癌相关的肿瘤标志物。正常人体组织中含量很低。参考值血清 37000 U/L 临床意义胰腺癌、胆囊癌和胆管壶腹癌，明显升高，尤其胰腺癌，敏感性70%-95%，特异性72-90%。其他消化道肿瘤：胃癌阳性率50%，结肠癌阳性率60%，肝癌51%。消化道炎症，如急性胰腺炎、胆囊炎、肝硬化和肝炎等，也有不同程度升高。肿瘤免疫检测-CA125定义癌抗原125（CA125）是很重要的卵巢癌相关
15、抗原，是一种大分子多聚糖蛋白，存在于上皮性卵巢癌组织和患者血清中。参考值血清 35000 U/L 临床意义卵巢癌明显升高，手术或化疗有效者很快下降；复发时再度明显升高。其他肿瘤：卵巢癌40%，其他妇科肿瘤43%，胰腺癌50%，胃癌47%，肺癌41.4%。非恶性肿瘤，如子宫内膜异位症、盆腔炎、卵巢囊肿等，也可不同程度升高。肿瘤免疫检测-CA15-3定义癌抗原15-3（CA15-3）是一种乳腺癌相关抗原，为大分子糖蛋白。参考值血清 25000 U/L。临床意义乳腺癌患者升高。是原发性乳腺癌的辅助诊断指标，也是手术后随访和监控肿瘤复法、转移的指标。其他恶性肿瘤：肺癌、肾癌、结肠癌、胰腺癌、卵巢癌和原
16、发性肝癌，也有不同程度的阳性率。肝脏、胃肠道、肺、乳腺、卵巢等非恶性肿瘤疾病，阳性率低于10%。肿瘤免疫检测-PSA定义前列腺特异性抗原（PSA）是一种由前列腺上皮细胞分泌的蛋白酶。目前临床可以检测血清总PSA（T-PSA）和游离PSA（F-PSA）。参考值T-PSA 4.0 g/L，F-PSA 0.8 g/L，F-PSA/T-PSA0.25临床意义前列腺癌患者血清PSA升高，其浓度和阳性率随病程的进展而增高。前列腺肥大、前列腺炎、肾脏和泌尿生殖系统疾病，也可轻度升高。F-PSA/T-PSA比值临床意义更大。比值0.1提示前列腺癌，0.25提示可能是前列腺增生。（三）感染免疫检测-细菌血清抗链
17、球菌溶血素“O”试验f 溶血素“O”是A群溶血性链球菌产生的具有溶血活性的代谢产物，相应的抗体称作抗链球菌溶血素“O”。参考值：乳胶凝集法（LAT）阴性临床意义：阳性-近期A群溶血性链球菌感染（活动性风湿热、风湿性心肌炎、急性肾小球肾炎、急性上呼吸道感染、皮肤软组织感染等。感染免疫检测-细菌伤寒和副伤寒沙门菌免疫测定f 伤寒沙门菌感染后菌体“O”和鞭毛“H”抗原可刺激机体产生相应抗体。甲、乙、丙型副伤寒沙门菌也可产生相应的“O”“H”抗体。肥达反应（Widal reaction,WR）。参考值：伤寒H1160,O 180；f 副伤寒180临床意义：单份血清O180，H160；或动态观察升高4倍
18、以上。O、H均升高，伤寒；O不高、H升高，预防接种；O升高、H不高，感染早期。感染免疫检测-病毒乙型肝炎病毒抗原抗体f 表面抗原（HBsAg）及其抗体（抗-HBs）,e抗原（HBeAg）及其抗体（抗-HBe），核心抗原（HBcAg）及其抗体（抗HBc）。HBsAg：急慢性乙肝或携带者抗-HBs：保护性抗体，病毒已清除，或疫苗接种后HBeAg：HBV复制状态及血清有传染性指标抗-HBe：非保护性抗体，提示预后良好。抗HBc：IgM型抗体。急性感染指标。感染免疫检测-病毒甲型肝炎病毒抗原抗体抗原检测（ELISA）：微量板包被抗-HAV，加入待检样本，再加入酶标记的抗-HAV，显色，测定OD值。f
19、待检样本OD值-空白OD值/阴性对照OD值0.21为阳性。抗体检测：检测抗-HAV IgM和总抗-HAV。f ELISA法或化学发光法。（四）自身免疫检测f 机体的免疫系统对自身组织成分产生免疫应答，产生相应的自身抗体，并引起组织损伤，形成自身免疫性疾病。类风湿因子抗核抗体抗组织细胞抗体其他自身抗体f六、微生物检查及时采集无菌操作立即送检定量或半定量培养药敏试验分级报告和限时报告f（一）标本采集与处理原则2.标本采集方法血液标本上呼吸道标本尿标本粪便标本1血液标本f1）送检指征f症状指征发 热：高热（39C以上），伴有明显的f 毒血症状，以间歇迟张热多见。皮 疹：革兰阴性菌瘀点f 伤寒玫瑰疹f
20、 斑疹伤寒暗红色斑丘疹肝脾肿大：革兰阴性菌败血症关节疼痛：革兰阳性菌神志昏迷或休克：革兰阴性菌毒血症状f疾病指征化脓性病灶或损伤粘膜损伤性疾病肝脏疾病糖尿病血液疾病及恶性肿瘤呼吸道感染或呼吸衰竭：吸入或血源长期输液或导管介入疾病血液透析患者f血液标本血液标本f 采血时间与次数f 抗菌药物治疗前f 发热初期或高峰期；f 连续23次。f 采血部位：肘静脉f 采集方法：注射器抽取f 采血量：成人 510ml，f 儿童 15 mlf 2）标本采集血液标本f 3）标本运送与处理f f 床边接种血培养瓶。立即送检。f 不能及时送检者，置室温（22C左右）保存。2上呼吸道标本f 1）送检指征f症状指征咳嗽：
21、痉挛性、持续性日咳 咳痰：铁锈色痰大叶性肺炎 黄粘痰细菌感染咯血：痰中带血或泡沫血痰呼吸困难：肺源性，常拌胸痛发热：稽留热大叶性肺炎 长期低热肺结核 肺炎支气管炎气管炎肺脓肿肺结核白喉百日咳f上呼吸道标本f疾病指征f采集时间痰：晨痰f 支扩或有空洞者作体位引流f 抗生素治疗前咽拭子：晨起后、进食前f 抗生素治疗前f上呼吸道标本f2）标本采集痰液标本自然咳痰法晨起后清水反复漱口后 无痰或痰少者可雾化吸入支气管镜采集法气管穿刺或直接肺穿刺厌氧菌培养咽拭子f 晨起后清水漱口，无菌棉拭子涂抹咽后壁f上呼吸道标本f采集方法上呼吸道标本f3）标本运送与处理标本采集后置无菌容器内及时送检。不能及时送检者，置
22、冰箱（4C左右）保存。f 1）送检指征f症状指征尿路刺激症状：尿频、尿急、尿痛 肾区疼痛、扣击痛f疾病指征肾盂肾炎膀胱炎f3尿标本尿标本f2）标本采集中段尿：尿道口清洗、消毒f 后，取中段尿标本。两侧肾盂尿：单侧肾脏感染膀胱穿刺：厌氧菌培养尿标本f 3）标本运送与处理 标本采集后置无菌容器内及时送检。不能及时送检者，置冰箱（4C左右）保存。4脑脊液标本f1）送检指征f症状指征全身症状：发热，往往为高热 颅压增高：头痛、呕吐（喷射性）、f 颈项强直、反射增强。f疾病指征化脓性脑膜炎结核性脑膜炎脑脊液标本f2）标本采集f 及时采集（抗生素用药前），f 腰穿，取脑脊液mlf3）标本运送与处理f 标本
23、采集后置无菌容器内及时送检。f 不能及时送检者，置室温（22C左 f 右）保存。自然排便：采集脓、血或f 粘冻成分松检。直肠试子：排便困难f 或婴儿f5粪便标本f1）不染色标本直接镜检不染色标本的直接镜检主要用于观察细菌的动力及运动状况。有鞭毛的细菌在显微镜下运动活泼，如霍乱弧菌的米泔样粪便标本的直接镜检。湿片法或悬滴法。f（二）病原学检查镜检 镜检f2）革兰染色镜检方法：结晶紫初染碘液媒染f 乙醇脱色石碳酸复红复染。结果：革兰阳性紫色；革兰阴性红色意义：有无细菌及大致的量；f 染色性（G+、G-），经验用药；f 形态（球菌、杆菌），鉴定；f 特殊诊断（尿道分泌物淋病奈瑟菌，脑脊液脑膜炎奈瑟菌
24、）。镜检f3）抗酸染色镜检 方法：石碳酸复红初染盐酸乙醇脱色 f 呂氏美兰复染。结果：抗酸菌红色；f 其他细菌、细胞红色 意义：检查抗酸菌（主要分枝杆菌）。镜检f4）其它特殊染色镜检 荚膜染色；鞭毛染色；异染颗粒染色检验方法分离培养f1）细菌体外培养的条件营 养蛋白质、糖类、无机盐、水温 度病原菌35C，腐生菌22C气 体O2，CO2，N2，H2渗透压其 它生长因子（V、X因子等）分离培养f2）培养基选择 增菌培养基：肉汤、碱性蛋白胨水 基础培养基：营养琼脂、M-H琼脂 选择培养基：麦康凯琼脂、SS琼脂 鉴别培养基：胆汁七叶苷琼脂 厌氧培养基：厌氧血平板f3）接种方法肉汤增菌：血液、脑脊液等蛋
25、白胨水增菌：粪便（弧菌）平板划线接种：其他标本f （四区划线法）分离培养分离培养f3）初代培养初代培养最好含510 CO2f （尤其是嗜血该菌、奈瑟菌等）3537 C，培养1824h f（分枝杆菌24w）f分离培养f 4）分离纯化f 初代培养分不出单个菌落时应重新分区划线接种。f1）生化鉴定f 不同种属的细菌因代谢酶的不同，在生长过程中需要的生化底物不同，产生的代谢产物也不同。糖的利用：单糖（葡、乳、麦、甘）、多糖蛋白质利用和分解：赖、鸟、精氨酸盐类利用与分解：NaCl、枸橼酸盐等气体产生：N2，NO，CO2、CO等。f检验方法鉴定鉴定f 2）血清学反应f 观察待检菌株与已知抗体的凝集反应，鉴
26、定各种细菌，并分型。（如沙门菌、志贺菌、致病大肠埃希菌、霍乱弧菌等抗血清。）鉴定f 3）分子生物学鉴定f 根据病原菌、病毒或其它病原微生物核酸的特异性基因片断，合成并标记引物，直接用基因探针或经PCR或RT-PCR扩增后检测、分析。鉴定f 4）自动或半自动微生物分析仪f（采用细菌的生化特征或免疫学特征）VITEK-AMS MicroScan Phonex（三）体外药敏试验f定义：体外药敏试验（antimicrobial susceptibility testing in vitro），即用体外试验的方法，检测待检菌对某种抗菌药物的敏感程度，指导临床合理选用敏感的抗菌药物，迅速控制和治疗该细菌引
27、起感染。f方法：抑菌试验f 杀菌试验f 联合药敏试验f 耐药酶检测目的与指征临床分离菌株必须进行常规药敏试验以提供临床选择药物时参考。临床因治疗的反应差而考虑更换抗菌药物时，应对拟选药物进行药敏试验。了解所在医院或地区常见病原菌耐药性的变迁情况。评价新抗菌药物的抗菌谱和抗菌活性等药效学特性。对细菌耐药谱进行分析和分型有助于某些菌种的鉴定，并作为医院感染流行病学调查的手段之一。f药敏试验的意义指导临床合理选择敏感的抗菌药物，f 及时控制细菌感染。减少不必要的抗菌药物的使用，降低f 治疗费用，也降低对病人机体的损害。减少耐药菌株的产生。辅助鉴定细菌。定义：用于测定抗菌药物体外抑制细菌生长大效力的试
28、验。实验方法：主要有进行定性测定的纸片扩散法（disk diffusion test），定量测定的稀释法（dilution test）和E试验法（E test）。f抑菌试验 1.纸片扩散法f 临床常用的是纸片琼脂扩散法（disc agar diffusion method），即Kirby-Bauer（K-B）纸片琼脂扩散法。f 将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种待检菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸收琼脂中的水分溶解后不断向纸片周围区域扩散形成递减的梯度浓度，在纸片周围抑菌浓度范围内待检菌的生长被抑制，形成透明的抑菌圈，抑菌圈大小与该药对待检菌的最低抑菌浓度（MIC）呈负相关关系。f（1）原理
29、 f1）抗菌药物纸片 f 直径6.35mm，吸水量为20l。f2）培养基f 水解酪蛋白（M-H）琼脂。f3）操作方法转种肉汤，制备菌液（0.5麦氏单位）；接种平板，贴药敏纸片；孵育（35，1824h）。f（2）方法 敏感（susceptible）表示待检菌能被测定药物常规剂量给药后在体内达到的血药浓度所抑制或杀灭。中度敏感（intermediate）指待检菌可被测定药物大剂量给药后在体内能达到的浓度所抑制，或在测定药物浓集部位的体液中，如尿中被抑制。耐药（resistant）表示待检菌不能被体内感染部位可能达到的抗菌药物浓度所抑制。f（3）结果判读f 稀释法是定量测定抗菌药物抑制细菌生长作用大
30、体外方法，分为肉汤稀释法和琼脂稀释法。f 稀释法所测得的某种抗菌药物能抑制待检菌肉眼可见生长的最低浓度称为最低（最小）抑菌浓度（minimal inhibitory concentration，MIC）。f稀释法肉汤稀释法 肉汤稀释法抗菌药物的配制与稀释f 用蒸馏水或 0.1mol/L磷酸盐缓冲液（pH6）稀释抗菌药物。待检菌和质控菌的准备f 同K-B法。接种、孵育f 最终接种浓度为5105CFU/ml。结果判读f 肉眼可见生长的最低药物浓度为MIC。质控控制f 用无菌96孔聚苯乙烯U型微量板代替试管，其他方法同肉汤稀释法。微量肉汤稀释法琼脂稀释法f 本法的优点是可以同时做多株菌株的MIC测定
31、，结果重复性优于肉汤稀释法，且易于发现污染或耐药突变菌株。f琼脂稀释法含药琼脂的制备f 取稀释后的抗菌药物 2ml，分别加入18ml消毒后、冷却至50左右的琼脂中。接种f 定点接种12 l菌液。孵育 f 351824h。结果判读f 菌落生长完全被抑制的最低药物浓度为该药对待检菌的MIC。3.E试验-原理f E试验结合了稀释法和扩散法的原理和特点，操作简便同扩散法，但可以同稀释法一样直接定量检测药物对待检菌的MIC。同纸片扩散法的主要区别在于E试验所用的是一条宽5mm、长50mm，内含干化、稳定、浓度由高至低呈指数梯度分布的一种抗菌药物的商品化塑料试条。操作过程f 培养基、菌液准备和接种均同K-
32、B法，贴E试验试条（90mm平皿可贴12根，140mm平皿可贴6根）。结果判读f 孵育后围绕试条可形成一个椭圆形的抑菌圈，抑菌圈与试条的横向相交处的读数即为抗菌药物对待检菌的MIC。fE试验-方法f（六）特殊药敏试验1.-内酰胺酶检测目的：-内酰胺酶（-lactamase）能灭活-内酰胺类抗生素，导致细菌对该类抗生素耐药。临床意义：流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌和卡他莫拉汗菌对青霉素、氨苄西林耐药；葡萄球菌和肠球菌对青霉素等耐药。注意事项：革兰阴性菌不检测-内酰胺酶。检测目的：超广谱-内酰胺酶（extend spectum-lactamase,ESBL）能灭活包括青霉素和头孢菌素等各种-内酰胺类抗生
33、素，导致细菌对该类抗生素耐药。临床意义：ESBL阳性表示对不耐酶的青霉素和头孢菌素耐药。注意事项：产ESBL的大肠埃希菌和克雷伯菌对所有青霉素和头孢菌素耐药。f2.超广谱-内酰胺酶3.耐药基因检测目的：所有产生耐药的细菌，不论其产生的机制如何，都与起基因位点变化有关，可通过分子生物学技术（DNA探针、PCR等）检测。临床意义：阳性的基因检测表示对该抗生素耐药。（见P293表7-13）注意事项：临床上多采用PCR检测技术。PCR检测需有严格的质量控制。4.耐甲氧西林 葡萄球菌（MRSA）定义：1g苯唑西林纸片的抑菌圈直径10mm，或其MIC 4 g/ml的金黄色葡萄球菌、对1g苯唑西林纸片的抑菌
34、圈17mm，或其MIC 0.5 g/ml的凝固酶阴性的葡萄球菌。临床意义：MESA不论体外药敏结果如何，对所有-内酰胺类抗生素均耐药；绝大多数MRSA呈多重耐药性，包括氨基糖苷类、大环内酯类和四环素类。定义：对30g万古霉素纸片的抑菌圈直径14mm，或其MIC 32g/ml，即为VRE。临床意义：对VRE目前尚无有效的治疗方法。f5.耐万古霉素f 肠球菌（VRE）定义：ESBL是一种水解青霉素、头孢菌素和单胺类抗生素的酶，主要由肠杆菌科细菌产生。经筛选试验和确证试验即可确定为ESBL。临床意义：产ESBL大肠埃希菌和克雷伯菌不论体外药敏试验结果如何，对青霉素、头孢菌素和氨曲南无效。6 6.ES
35、BLsESBLsf七、分子生物学检查测序PCR扩增基因杂交基因芯片f1.常用的分子生物方法肿瘤靶向治疗的分子检测EGFRKRAS/NRASBRAFALK/ROS1f2.常用的分子检测项目抗栓治疗的分子检测CYP2C19氯吡格雷CYP2C9/VKORC1法华林f常用的分子生物项目代谢酶相关的分子检测ALDH1酒精/硝酸甘油代谢ApoE/SLCO1B1他叮类药物f常用的分子检测项目复习思考题f1.实验诊断学的定义、分类？f2.实验诊断学的现状和发展趋势？f3.医院感染最常见的病原体是什么？f4.医院感染的感染途径和易感宿主是什么？f5.采集血培养标本的要求是什么？f6.临床最常用的革兰染色的意义是什么？f7.临床最常用的药敏试验的方法是什么？f8.分子生物学检测的临床意义是什么？
