1、第2节 微生物的培养技术及应用一、微生物的基本培养技术二、微生物的选择培养和计数向经过杀菌处理的牛奶中添加某些对人体有益的细菌，再经过发酵就可以制成酸奶。由于制作工艺并不复杂，一些人会在家里自制酸奶。自制酸奶虽然方便，但是食用自制酸奶导致肠胃不适的事例屡见不鲜，主要原因是在制作过程中有杂菌混入。那么，怎样才能保证无处不在的杂菌不混入发酵物中呢？从社会中来首先酸奶制作所用的容器要进行消毒晾干后使用，避免酸奶制作过程中混入杂菌；其次，准备好菌种，最好是纯的乳酸菌菌种；再有就是接种时要在无菌条件下操作，所用搅拌器要经过消毒灭菌等。无菌技术微生物的培养技术微生物结构简单、形体微小，眼睛看不到，若想得到
2、纯净的微生物，就必须对其进行培养和分离。实验室培养微生物条件提供微生物生长繁殖所需营养和环境条件确保其它微生物无法混入-培养基-无菌技术一、微生物的基本培养技术（一）培养基的配制培养基是人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。培养基用以培养、分离、鉴定、保存微生物或积累其代谢物。培养基的种类培养基种类特点液体培养基不含凝固剂（如琼脂），呈液体状态固体培养基含凝固剂（如琼脂），呈固体状态注意说明琼脂在98 以上熔化，在44 以下凝固，在常规培养条件下呈现固态。固体培养基中的琼脂仅作为凝固剂，不能为微生物生长提供能量和碳源。微生物在固体培养基表面生长，可以形成肉眼可见的菌
3、落。一个微生物细胞繁殖而来的肉眼可见的，有一定形态结构的子细胞群体。培养基的营养结构基本成分：碳源、氮源、水、无机盐碳源无机碳源：CO2、CO32-、HCO3-有机碳源：葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨等氮源无机氮源：NH4、NO3-、NH3等有机氮源：牛肉膏、蛋白胨、尿素、氨基酸等无机盐-Ca、K、Mg；Zn、Cu、Mn、Co、Mo等。培养基的营养结构特殊需求：满足微生物对pH、特殊营养物质、O2的需求。培养乳酸杆菌时，需要在培养基中添加维生素；培养霉菌时，需要将培养基调至酸性；培养细菌时，需要将培养基调至中性或弱碱性；培养厌氧微生物时，需要提供无氧的条件。组分含量提供的主要营养牛肉膏5g碳源、磷酸盐
4、和维生素等蛋白胨10g氮源和维生素等NaCl5g无机盐H2O定容至1000ml水1000ml牛肉膏蛋白胨培养基的营养组成牛肉膏蛋白胨牛肉膏是采用新鲜牛肉经过消化、过滤、浓缩而得到的一种棕黄色至棕褐色的膏状物。有牛肉自然香味，易溶于水，水溶液呈淡黄色。蛋白胨是一种外观呈淡黄色的粉剂。一般用于蛋白胨生产的蛋白包括动物蛋白和植物蛋白两种。（二）无菌技术 获得纯净的微生物培养物的关键是防止杂菌污染 防止杂菌污染的方法消毒灭菌指使用较为温和的物理、化学或生物等方法杀死物体表面或内部一部分微生物是指使用强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。避免已经灭菌的材料用具与周围物品接触；为了避免周
5、围环境微生物污染，操作应在超净工作台并在酒精灯火焰旁进行。消毒指使用较为温和的物理、化学或生物等方法杀死物体表面或内部一部分微生物。常用方法：煮沸消毒法：100煮沸5-6分钟巴氏消毒法：62-65处理30分钟/80-90下处理30秒-1分钟化学药剂消毒法：用70%酒精擦拭双手/用氯气消毒水源紫外线消毒法：用紫外灯照射接种室、接种箱、超净工作台等灭菌是指使用强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。芽孢，在营养条件缺乏时，在菌体内形成的一个圆形或椭圆形、含水量低、抗逆性强的休眠体；芽孢壁很厚，对干旱、低温、高温等恶劣的环境有很强的抵抗力。例如，有的细菌的芽孢，煮沸3小时以后才死亡。
6、孢子，细菌、原生动物、真菌和植物等产生的一种有繁殖作用的无性生殖细胞。能直接发育成新个体。常用方法：湿热灭菌法、干热灭菌法、灼烧灭菌法湿热灭菌法利用沸水、流通蒸汽或高压蒸汽进行灭菌的方法。实验室常用的高压蒸汽灭菌锅就是以水蒸气为介质，在压力为100 kPa、温度为121 的条件下，维持1530min来灭菌的。对象：培养基等原理：高温蒸汽破坏蛋白质、核酸等结构使其变性优点：操作简便，效果可靠，可以杀灭所有的生物，包括最耐热的某些微生物的休眠体。基本保持培养基的营养成分不被破坏。干热灭菌法将灭菌物品放入密闭容器如干热灭菌箱内，在160-170 的热空气中维持2-3h，使微生物细胞膜破坏、蛋白质变性
7、和原生质干燥等而达到灭菌目的。对象：耐高温和需保持干燥的物品，如玻璃器皿(如试管、培养皿、吸管、注射器)、金属器具(如针头、镊子、剪刀等)的灭菌灼烧灭菌法将灭菌对象直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧，使微生物燃烧，可以迅速地彻底地灭菌。对象：接种工具如接种环、接种针，以及接种过程中的试管口或瓶口等易被污染部位类型适用范围操作方法消毒灭菌较为温和理化方法，杀死部分微生（不包括芽孢、孢子）强烈的理化方法，杀死所有微生物（包括芽孢、孢子）煮沸消毒法巴氏消毒法化学药剂紫外线日常生活不耐高温的液体生物活体、水源等接种室、接种箱，超净工作台100 煮沸56 min6265 煮30 min或80-90 煮30
8、s-1 min擦拭等,如用酒精擦拭双手、用氯气消毒水源紫外线照射30 min灼烧灭菌干热灭菌湿热灭菌接种的金属工具、接种时用的试管口或瓶口等耐高温、需要保持干燥的物品,如玻璃器皿和金属用具等培养基、培养皿等,生产和实验室常用直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧物品放入干热灭菌箱,160170 加热23h高压蒸汽灭菌锅内,100 kPa,温度121,1530 min（三）微生物的纯培养在微生物学中，将接种于培养基内，在合适条件下形成的含特定种类微生物的群体称为培养物；由单一个体繁殖所获得的微生物群体称为纯培养物；获得纯培养物的过程就是纯培养。配置培养基灭菌接种分离培养酵母菌的纯培养原理菌落-分散的微
9、生物(单一个体)在适宜的固体培养基表面或内部可以繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体。特征：形状、大小、光泽度、颜色、透明度等菌落的特征是鉴定菌种的重要依据获得单菌落的方法：平板划线法、稀释涂布平板法方法步骤制备培养基接种和分离培养酵母菌1.制备培养基配置培养基称取去皮马铃薯200g，切成小块，加水1000ml，加热煮沸至马铃薯软烂，用纱布过滤。向滤液中加入20g葡萄糖、15-20g琼脂，用蒸馏水定容至1000ml。灭菌将配制好的培养基转移到锥形瓶中，加棉塞，包上牛皮纸，并用皮筋勒紧，再放入高压蒸汽灭菌锅中，在压力为100kPa、温度为121的条件下，灭菌15-30min。将5-8套
10、培养皿包成一包，用几层牛皮纸包紧，放入干热灭菌箱内，在160-170灭菌2h。倒平板待培养基冷却至50 左右时，在酒精灯火焰附近倒平板。平板冷凝后，为什么要将平板倒置？平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。平板划线法是通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。在数次划线后培养，可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体（单菌落）。2.接种和分离酵母菌微生物群单个细胞单个菌落连续划线分散或稀释生长繁殖12345接种环只蘸一次菌液
11、,但要在培养基不同位置连续划线多次不能将培养基表面划破划线首尾不能相接每次划线前接种环进行灭菌划线后,培养皿倒置培养平板划线法注意事项:划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时,仍然需要灼烧接种环吗？为什么？灼烧时期目的取菌种前每次划线前接种结束后杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者杀死上次划线时残留菌种，使下一次划线的菌种直接来源上次划线的末端杀死接种环上原有微生物3.培养酵母菌完成平板划线后，待菌
12、液被培养基吸收，将接种后的平板和一个未接种的平板倒置培养，放入28左右的恒温培养箱中培养24-28h。未接种的培养基作对照，该培养基无菌落则说明培养基没有污染记录实验结果可以在培养12h和24h后，观察菌落的大小、形状、颜色。培养24h后，菌落的大小、形状是否发生变化，菌落颜色是否加深，光泽度是否增加，等等二、微生物的选择培养和计数自然界中微生物数量繁多，种类庞杂，要想从中分离出需要的特定微生物并不容易，尤其当要分离的微生物在混合菌群中不是优势种群时，仅通过一般的平板划线法或稀释涂布平板法很难实现。科学实例-寻找耐高温的DNA聚合酶PCR是一种在体外DNA复制的技术，此项技术要求使用耐高温（9
13、30C）的DNA聚合酶。耐高温的酶耐高温的生物体高温环境（热泉/火山口）1973年，科学家从美国黄石国家公园的热泉中筛选出水生栖热菌，进而从这种菌中提取出耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）。根据微生物对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。筛选原则耐寒微生物石油分解菌被石油污染的土壤冰川冻土层实验室筛选微生物的原理：人为提供有利于目的菌生长的条件（营养、温度、pH等），同时抑制或阻止其他微生物的生长。（一）选择培养基允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。思考讨论选择培养基配方的设计尿素CO(NH2)2含氮量高，化学性质稳定，是现代农业生产中一种重要的氮肥。尿素施入土
14、壤后，会被土壤中的某些细菌分解成NH3，再被转化为NO3-、NH4+等被植物吸收。而这些细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶。CO(NH2)2+H2O脲酶CO2+2NH3如何设计培养基配方，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来？组分含量牛肉膏5.0g蛋白胨10.0gNaCl5.0g琼脂20.0g蒸馏水定容到1000ml组分含量KH2PO41.4gNaH2PO42.1gMgSO47H2O0.2g葡萄糖10.0g尿素CO(NH2)21.0g琼脂15.0g蒸馏水定容到1000ml从用途上来讲，哪个属于选择培养基？将得到何种细菌？以尿素作唯一氮源的选择培养基可获得能分解尿素的微生物。（二）土壤
15、中分解尿素细菌的分离与计数提出问题1.如何从土壤中分离出能够分解尿素的细菌；2.统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌。实验原理分离-绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，利用以尿素作为唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌。计数-采用稀释涂布平板法，当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过计数平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。直接计数-显微镜直接计数：血细胞计数板/细菌计数板实验过程1.土壤取样取样地点要求：酸碱度接近中性的潮湿土壤取样过程：铲去表土（一般3cm左右），细菌绝大部分分
16、布在距地表38cm的土壤层。注意事项：铁铲和取样袋在使用前都要灭菌；事毕洗手。2.配置培养基选择培养基-以尿素为唯一氮源完全培养基（如牛肉膏蛋白胨培养基）-作为对照，来判断选择培养基是否具有选择作用3.样品稀释与涂布平板3.样品稀释与涂布平板 梯度稀释 涂布平板细菌一般选用104、105、106 稀释倍数的菌液进行涂布培养。取0.1mL菌液，滴加到培养基表面。将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布。用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。微量移液器 涂布平板注意：各浓度分别涂布3个平板及空白平板选择培养基（平行重
17、复）牛肉膏蛋白胨培养基(作为对照)4.微生物的培养与观察培养条件：不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。细菌一般在30-37的温度下,恒温培养箱中培养1-2d（平板倒置）观察：每隔24h统计一次菌落数目，选取数目稳定时的记录作为结果。防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目一般来说，在相同的培养条件下，同种微生物表现出稳定的菌落特征，如形状、大小和颜色等。稀释104倍稀释105倍稀释106倍空白对照计数原则为了保证结果准确，选择30-300个菌落的平板进行计数；每个稀释度至少取3个平板取其平均值；分析实验结果时，要考虑重复组结果是否接近，如果相差太大，意味着操作有误，需重新实验。每g样品中的菌落数(CV)MC代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)M代表稀释倍数
