1、邢万金邢万金 苏慧敏苏慧敏内蒙古大学生命科学学院生物系内蒙古大学生命科学学院生物系目的基因的亚克隆、表达载体的构建、目的基因的亚克隆、表达载体的构建、在大肠杆菌中诱导表达。在大肠杆菌中诱导表达。pMD18-T-NK(full):3.8kp 纳豆激酶全长纳豆激酶全长1181bpDNA已插入已插入pMD18-T克隆载体：克隆载体：表达载体：表达载体：pET-Trx3.3kbMCSAmpT7PT7 RBS TRX(his-patch)CTC GAA GTT CTG TTT CAG GGT CCA GCAGGA TCC GCA GAA TTC AGC GCT AGC TAA CAT CAT CAT C
2、AT CAT TAA GCTT Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly ProBamHI EcoRI NheI HindIIIBamHI EcoRI NheI stop HindIIIP3C cut site pGEX-4T14950 bpLacIAmpPtacGSTBamHI EcoRI SmaI XhoI SalI NotIGTC GTT CCG CGT GGA TCC CCG GAA TTC CCG GGT CGA CTC GAG CGG CCG CAT CGT GAC TGALeu Val Pro Arg Gly Ser Pro Glu Phe Pro Gly Arg
3、Leu Glu Arg Pro His Arg AspThrombine提取目的基因模板提取目的基因模板提取表达载体质粒提取表达载体质粒PCR扩增目的基因扩增目的基因EcoRI+BamHI双酶切回收双酶切回收T载体载体目的基因亚克隆载体目的基因亚克隆载体EcoRI+BamHI双酶切回收双酶切回收目的基因片段目的基因片段目的基因表达载体目的基因表达载体IPTG诱导表达诱导表达酶酶 切鉴定切鉴定酶酶 切鉴定切鉴定SDS-PAGE检测检测感受态感受态DH5感受态感受态BL21(DE3)（1）提取目的基因载体（作）提取目的基因载体（作PCR模板）模板）pMD18-T-NK(full)pEGFP-N1
4、pDsRed2-1（2）提取表达载体）提取表达载体pET-Trx（备酶切）（备酶切）pET-Trx pGEX-4T1 37 dd water 32l 10PCR buffer（不含（不含MgCl2）5l 25mM MgCl2 3l 2.5mmol/L dNTP 4l 10mol/L Primer1 2l 10mol/L primer2 2l 模板质粒模板质粒 1l 3U/l Taq酶酶 1l（3u）总体积总体积 50l1.PCR体系体系 94 5min 94 1min 60 1min 72 1min30s goto 34 cycles 72 10min复性温度比引物的复性温度比引物的Tm值低值
5、低2-5。表达载体表达载体T载体载体目的基因目的基因EBEBno EB表达载体表达载体BamHI+EcoRIT载体载体+目的基因目的基因BamHI+EcoRI表达载体表达载体BamHI+EcoRI目的基因目的基因BamHI+EcoRI重组表达载体重组表达载体T4 ligase，14目的基因目的基因（PCR产物）产物）T载体载体重组克隆载体重组克隆载体14DH5a 和和 BL21（DE3）442重组载体重组载体感受态菌感受态菌3737提取质粒提取质粒酶切酶切3737载体载体目的基因目的基因PCR产物产物重组载体滞后重组载体滞后BamHI+EcoRIOD600IPTG1.低分子量蛋白低分子量蛋白Marker2.BL21(DE3)对照对照3.BL21(DE3)诱导诱导4.4-8.重组表达载体诱导重组表达载体诱导5.9.表达载体诱导表达载体诱导20.1314366.297.4 1 2 3 4 5 6 7 8 9谢谢大家！谢谢大家！
