1、高速逆流色谱分离纯高速逆流色谱分离纯化抗生素化抗生素高速逆流色谱分离纯化抗生素2 内内 容容 提提 要要一一 高速逆流色谱技术简介高速逆流色谱技术简介 二二 溶剂选择溶剂选择 在在逆流色谱中的重要性逆流色谱中的重要性三三 高速逆流色谱技术分离纯化抗生素实例高速逆流色谱技术分离纯化抗生素实例高速逆流色谱分离纯化抗生素3一一 高速逆流色谱技术简介高速逆流色谱技术简介高速逆流色谱(High Speed Counter Current Chromatography,HSCCC)a 多层盘绕管；多层盘绕管；b 平衡物平衡物高速逆流色谱分离纯化抗生素4优缺点优缺点（与（与HPLC等液等液-固色谱技术比较固
2、色谱技术比较)优点优点分离原理不同：互补性强分离原理不同：互补性强无需固体作固定相无需固体作固定相：不存在固体对样品组分的吸附、玷污、不存在固体对样品组分的吸附、玷污、变性、失活、拖尾等现象，能实现很高的回收率，节省昂变性、失活、拖尾等现象，能实现很高的回收率，节省昂贵的材料消耗和溶剂消耗（贵的材料消耗和溶剂消耗（HPLC的的1/10以下），运行使以下），运行使用的后续投入较低用的后续投入较低 溶剂极性可调：无需更换不同极性的色谱柱即可实现流动相溶剂极性可调：无需更换不同极性的色谱柱即可实现流动相从弱极性到强极性或相反的转化从弱极性到强极性或相反的转化 色谱柱无填料，柱内空间全部是有效空间，容
3、积大：样品负色谱柱无填料，柱内空间全部是有效空间，容积大：样品负载能力强，制备量大，重现性好载能力强，制备量大，重现性好盘管总体积盘管总体积100mL，一次分离量：一次分离量：0.5-2克克盘管总体积盘管总体积3000mL，一次分离量：，一次分离量：15-60克克 高速逆流色谱分离纯化抗生素5缺点缺点 分离效率（理论塔板数）还不高（分离效率（理论塔板数）还不高（1000)N=5.54(t)N=5.54(tR R/W/W1/21/2)2 2一次分离所需时间还较长（以小时计）一次分离所需时间还较长（以小时计）基本原理以及溶剂系统选择等还不完善基本原理以及溶剂系统选择等还不完善相应的配套检测器还不够
4、完善（溶剂干扰）相应的配套检测器还不够完善（溶剂干扰）分离后样品的纯度还需分离后样品的纯度还需HPLC等方法测定等方法测定混合溶剂的回收混合溶剂的回收高速逆流色谱分离纯化抗生素6二二 溶剂选择溶剂选择在高速在高速逆流色谱中的重要性逆流色谱中的重要性分离度分离度Rs:2(tR2-tR1)/W1+W2提高分离度的方法提高分离度的方法CCC&CPC:(tR2-tR1),HPLC:W1+W2 高速逆流色谱分离纯化抗生素7样品：极性、溶解度、纯度（预处理）样品：极性、溶解度、纯度（预处理）溶剂：两相溶剂的体积应尽量相同，挥发性较强溶剂：两相溶剂的体积应尽量相同，挥发性较强 样品样品+溶剂：溶剂：沉降时间
5、（沉降时间（301.5 1.5 溶剂系统：溶剂系统：固定相保留率：固定相保留率：75%75%高速逆流色谱分离纯化抗生素8表表1 最佳溶剂体系选择表最佳溶剂体系选择表极性较弱溶剂极性较弱溶剂 最佳溶剂最佳溶剂 极性较强溶剂极性较强溶剂heptane,CHCl3 THF H2Oheptane,toluene,MiBK,CHCl3,EtOAc ACO H2Oheptane methyl ethyl ketone H2OTHF DMSO H2Otoluene,MtBE,MiBK,EtOAc MeCN H2Oheptane,toluene,CHCl3,EtOAc BuOH H2Oheptane,tolu
6、ene,CHCl3,EtOAc PrOH H2Oheptane,CHCl3,EtOAc EtOH H2Oheptane,toluene,CHCl3,EtOAc,BuOH MeOH H2Oheptane,toluene,CHCl3,MiBK,EtOAc,BuOH HOAc H2OCHCl3 HCOOH H2O非水体系非水体系Heptane THF,DMF,EtOAc,PrOH,EtOH MeOH,MeCN高速逆流色谱分离纯化抗生素9逆流色谱中常用的几个三元溶剂体系相图逆流色谱中常用的几个三元溶剂体系相图 Type 1:Chloroform/Methanol/Water应用：杆菌肽，应用：杆菌肽，
7、Niphimycin，克念菌素，克念菌素 ，Herbicidins A,B等等高速逆流色谱分离纯化抗生素10lType 2.Ethyl acetate/butanol/Waterl应用：应用：WAP-8294A，弱极性样品弱极性样品高速逆流色谱分离纯化抗生素11Type 0:Water/Dimethylsulfoxide/Tetrahydrofuran 应用：应用：极性强的难溶性样品如两性霉素极性强的难溶性样品如两性霉素B 高速逆流色谱分离纯化抗生素12 CPC separation of Amphotericin B(peak 7)Water-DMSO-THF(24.6:16.2:59.2,
8、V/V/V)高速逆流色谱分离纯化抗生素13溶剂系统溶剂系统的选择与优化的选择与优化步骤步骤1:采用采用简单的梯度洗脱系统如水简单的梯度洗脱系统如水-乙腈乙腈（100:00:100）用用HPLC对样品进行极性扫描分析对样品进行极性扫描分析，得到样品的，得到样品的极性范围极性范围高速逆流色谱分离纯化抗生素14步骤步骤2:溶剂系统溶剂系统 的优化的优化区域区域 化合物化合物极性极性 溶剂系统溶剂系统 A 强强极性极性 正己烷正己烷/正丁醇正丁醇/甲醇甲醇/水水 B 中中极性极性 正己烷正己烷/乙酸乙酯乙酸乙酯/甲醇甲醇/水水 C 非非极性极性 正己烷正己烷/乙腈乙腈步骤步骤3:溶剂比例溶剂比例的优化
9、的优化 一次只改变一种一次只改变一种溶剂的量溶剂的量取少量样品在试管中进行分配系数实验取少量样品在试管中进行分配系数实验TLC或或HPLC测定实验结果测定实验结果高速逆流色谱分离纯化抗生素15实例：孢绿菌素实例：孢绿菌素(Sporaviridins)的分离的分离Sporaviridins A1 A2 B1 B2 C1 C2 R1 H H H H OH OH R2 OH OH NH2 NH2 OH OH R3 C2H5 CH3 C2H5 CH3 C2H5 CH3 OOOOOOOOOOOHNH2OHOHOHNH2R1H2CR2OHOHOHOHOHOOHOOHR3OOHOHOHOOCH2OHOHOH
10、OHOOHOHOHOOHNH2OH高速逆流色谱分离纯化抗生素16孢绿菌素：碱性，水溶性，抗孢绿菌素：碱性，水溶性，抗G+菌和毛菌和毛癣癣菌等。菌等。化学结构：含七个糖元的化学结构：含七个糖元的34元大环内酯化合物，主要有元大环内酯化合物，主要有6个组分，个组分，由于结构非常相似，用由于结构非常相似，用HPLC等方法难以分离。等方法难以分离。溶解性：只溶于极性溶剂如水、甲醇和正丁醇等。溶解性：只溶于极性溶剂如水、甲醇和正丁醇等。HSCCC方法：方法：溶剂系统选择：溶剂系统选择：正丁醇正丁醇/水：主要分布在上相（正丁醇），因此，必须降低孢绿水：主要分布在上相（正丁醇），因此，必须降低孢绿菌素在上相
11、中的溶解度。方法：加入非极性溶剂如正己烷和菌素在上相中的溶解度。方法：加入非极性溶剂如正己烷和乙醚。乙醚。正丁醇正丁醇/乙醚乙醚/水：先固定正丁醇和水的体积（各水：先固定正丁醇和水的体积（各10mL)，加入不，加入不同体积的乙醚，发现同体积的乙醚，发现10：4：10（V/V/V)效果较好。再固定正效果较好。再固定正丁醇丁醇/乙醚乙醚10：4，调整水的体积，确定正丁醇：乙醚：水为，调整水的体积，确定正丁醇：乙醚：水为10：4：12。HSCCC：固定相保留率：固定相保留率：75%，分离时间：，分离时间：3.5h，洗脱体积：，洗脱体积：500mL分离前粗品分离前粗品15mg，分离后分别得到纯组分，分
12、离后分别得到纯组分A1(1.4mg),A2(0.6mg),B1(0.7mg),B2(0.5mg),C1(1.1mg),C2(1.4mg)。高速逆流色谱分离纯化抗生素17HPLC separation of sporaviridins.Column:Cosmosil 5C18(5 um,150 mm*4.6 mm),mobile phase:methanol-1 M ammonium chloride(74:26,v/v),flow rate:1ml/min,detection:232 nm.高速逆流色谱分离纯化抗生素18 孢绿菌素各组分在正丁醇系统中的分配系数 分配系数（分配系数（U/L）正丁
13、醇正丁醇/乙醚乙醚/水水 C2 B2 A2 C1 B1 A1 10:0:10 2.96 6.41 6.65 4.87 8.81 9.09 10:3:10 0.96 2.17 2.78 1.84 3.34 4.19 10:4:10 0.50 1.12 1.59 1.04 1.85 2.91 10:5:10 0.38 0.78 1.11 0.74 1.25 2.12 10:6:10 0.39 0.90 1.19 0.81 1.39 1.70 10:7:10 0.24 0.63 1.10 0.59 1.08 1.82 10:4:11 0.31 0.89 1.24 0.70 1.50 2.00 10:
14、4:12 0.38 1.09 1.41 0.80 1.85 2.32 10:4:13 0.37 1.05 1.51 0.73 1.58 2.10 10:4:14 0.29 1.09 1.17 0.57 1.22 1.74高速逆流色谱分离纯化抗生素19lHPLC separatin of each sporaviridin component.Column:Cosmosil 5C18(5 um,150 mm*4.6mm),mobile phase:methanol-1 M ammonium choride(74:26,v/v),folw rate:1ml/min,detection:232 nm
15、.高速逆流色谱分离纯化抗生素20三三 高速逆流色谱技术分离纯化抗生素实例高速逆流色谱技术分离纯化抗生素实例文献报道：文献报道：样品样品 溶剂系统溶剂系统 流动相流动相 发表时间发表时间肽类肽类短杆菌肽短杆菌肽A,B,C C6H6-CHCl3-MeOH-H2O LP 1982多粘菌素多粘菌素 n-BuOH-0.04MTFA(1%glycerol)LP 1991杆菌肽杆菌肽 CHCl3-MeOH-H2O LP 1991 CHCl3-EtOH-MeOH-H2O LP 1991WAP-8294A n-BuOH-EtOAC-0.005M TFA LP 2001 放线菌素类放线菌素类放线菌素混合物放线菌素
16、混合物 Et2O-nC6H14-MeOH-H2O UP 1986 高速逆流色谱分离纯化抗生素21样品样品 溶剂系统溶剂系统 流动相流动相 发表时间发表时间大环内酯类大环内酯类2-去甲基红霉素去甲基红霉素 nC5H12-C6H6-AcO-iPrOH -0.01M citrate buffer(pH6.3)UP 1988尼达霉素尼达霉素 CCl4-MeOH-0.01MK3PO4 buffer(pH7)UP 1988Tiacumicins CCl4-CHCl3-MeOH-H2O UP 1988Coloradocin CHCl3-MeOH-H2O UP 1988孢绿菌素孢绿菌素 n-BuOH-Et2O
17、-H2O LP 1990霉菌素霉菌素 n-C6H14-EtOAc-MeOH-8%NH3.H2O LP 1991Dunaimycin n-C6H14-EtOAc-MeOH-H2O UP 1991原始霉素原始霉素 CHCl3-EtOAc-MeOH-H2O UP 1992伊维菌素伊维菌素 n-C6H14-EtOAc-MeOH-H2O LP 1996螺旋霉素螺旋霉素 n-C6H14-EtOAc-MeOH-H2O UP 2000 高速逆流色谱分离纯化抗生素22 样品样品 溶剂系统溶剂系统 流动相流动相 发表时间发表时间蒽环类蒽环类道诺红霉素衍生物道诺红霉素衍生物 CHCl3-CH2Cl2-nC6H14-
18、MeOH-H2O UP 1981Benzanthrins A,B CCl4-CHCl3-MeOH-H2O UP 1986Tetracenomycin D EtOAC-C6H12-MeOH-H2O UP 2005多烯类多烯类呋罗托霉素呋罗托霉素 CCl4-CHCl3-MeOH-H2O UP 1985克念菌素克念菌素 CHCl3-MeOH-H2O UP 1987头孢类头孢类Cephalosporin C&PEG600 15%W/W-(NH4)2SO4 Desacetyl Cephalosporin C 17.5%W/W LP 1995高速逆流色谱分离纯化抗生素23样品样品 溶剂系统溶剂系统 流动相
19、流动相 发表时间发表时间其它其它Pentalenolactone CHCl3-MeOH-H2O UP 1985（内酯）（内酯）Tirandamycin A,B n-C6H14-EtOAc-MeOH-H2O UP 1985Siderochelin A CHCl3-MeOH-H2O UP 1985A 201E CCl4-CHCl3-MeOH-H2O UP 1985Bu 2313B n-C6H14-CH2Cl2-MeOH-H2O LP 1985Sordarin derivative CH2Cl2-CF3COOH(0.04%)UP 2004SCH 42282 CHCl3-MeOH-H2O UP 199
20、8(含糖大环内酰胺含糖大环内酰胺)高速逆流色谱分离纯化抗生素24我们的工作我们的工作1.HSCCC分离海洋小单孢菌产生的黄酮类化合物分离海洋小单孢菌产生的黄酮类化合物 HSCCC分离前粗品分离前粗品FW635HPLC图图 HSCCC:仪器：同田生物仪器：同田生物TBE-300 CHCl3:CH3OH:H2O(4:3:2,V/V/V)Mobile Phase:LP，转速，转速 800rpm 高速逆流色谱分离纯化抗生素25FW635 I 1 t1 10.75minFW635I-2 t2 11.35minOOOHHO大豆黄素OOOHOHHO染料木素高速逆流色谱分离纯化抗生素262.HSCCC分离大环
21、内酯类抗生素分离大环内酯类抗生素从土壤放线菌次级代谢产物中分离出两个大环内酯类抗真菌抗从土壤放线菌次级代谢产物中分离出两个大环内酯类抗真菌抗生素生素Ac1和和Ac2,两者结构相似，难以用两者结构相似，难以用HPLC等色谱方法分离等色谱方法分离。分离前分离前HPLC分析图分析图高速逆流色谱分离纯化抗生素27HSCCC分离分离 仪器：同田生物仪器：同田生物TBE-300溶剂体系选择：正己烷：异丙醚：甲醇：水溶剂体系选择：正己烷：异丙醚：甲醇：水=2：3：6：5下相下相HPLC图图上相上相HPLC图图高速逆流色谱分离纯化抗生素28计算计算K值和值和 值：值：K值：值：KAc1=上相中上相中Ac1的峰
22、面积的峰面积/下相中下相中Ac1的峰面积的峰面积 =1699782/2298768=0.74 KAc2=上相中上相中Ac2的峰面积的峰面积/下相中下相中Ac2的峰面积的峰面积 =2542940/2172947=1.17 值值=KAc2/KAc1=1.17/0.74=1.58 固定相：上相；保留率；固定相：上相；保留率；79%；流速：；流速：1mL/min 转速：转速：800rpm 高速逆流色谱分离纯化抗生素303 HSCCC分离环孢菌素（由茄病镰刀菌产生）分离环孢菌素（由茄病镰刀菌产生）环孢菌素环孢菌素：A，X=H,Y=CH3；B，X=Y=H；C，X=OH,Y=CH3；D，X=Y=CH3；H，
23、(D-MeVal11)CsA环孢菌素环孢菌素AB、C、D和和H的化学结构的化学结构MeLeuMeLeuMeValNCH3CCHHOHCH3HMeGlyD AlaAlaMeLeuVal MeLeuNHCCOCHXYO1234567891011高速逆流色谱分离纯化抗生素31HSCCCHSCCC分离纯化天然环孢菌素分离纯化天然环孢菌素 仪器：同田生物TBE-300分离前分离前分离后分离后:石油醚石油醚/丙酮丙酮/水（水（3：3：2）,Mobile Phase:LP 组份组份 纯度（纯度（%）收率（收率（%）第一部分第一部分 Cyclosporin C 99.3 85.0第二部分第二部分 Cyclos
24、porin B 98.7 88.5第三部分第三部分 Cyclosporin A 98.6 90.2第四部分第四部分 Cyclosporin D 98.4 86.3Minutes7891011121314151617181920mAU0200400600800100012001400mAU0200400600800100012001400高速逆流色谱分离纯化抗生素32 Cyclosporin C 10.816min Cyclosporin B 11.915min Cyclosporin A 13.493min Cyclosporin D 16.043min Minutes789101112131
25、4151617181920mAU-50050100150200250300mAU-50050100150200250300Minutes78910111213141516171819mAU050100150200250300mAU050100150200250300Minutes78910111213141516171819mAU0200400600mAU0200400600Minutes78910111213141516171819mAU-20020406080mAU-20020406080高速逆流色谱分离纯化抗生素33蒸发光散射器蒸发光散射器(ELSD)在线检测在线检测HSCCC分离分离高
26、速逆流色谱分离纯化抗生素34HSCCC分离环孢菌素其它组分分离环孢菌素其它组分CsL(组分组分1）高速逆流色谱分离纯化抗生素35HSCCC分离环孢菌素其它组分分离环孢菌素其它组分组分组分2结构待确定结构待确定 高速逆流色谱分离纯化抗生素36HSCCC分离环孢菌素其它组分分离环孢菌素其它组分CsE(组分组分3）高速逆流色谱分离纯化抗生素37HSCCC分离半合成环孢菌素异构体分离半合成环孢菌素异构体 异构体异构体1化学结构化学结构HPLC分析图分析图CsAOHOHOAC高速逆流色谱分离纯化抗生素38异构体异构体1分离的溶剂系统选择分离的溶剂系统选择(石油醚石油醚/丙酮丙酮/水）水）HSCCCHSC
27、CC分离分离石油醚石油醚/丙酮丙酮/水水=3:3:2,=3:3:2,流动相：流动相：LPLP固定相保留率：固定相保留率：76%;76%;流速：流速：1.5ml/min;1.5ml/min;转速转速:900rpm;:900rpm;=K K2 2：K K1 1=0.69/0.43=1.60=0.69/0.43=1.60 溶剂比例a上(峰面积)a下(峰面积)b上(峰面积)b下(峰面积)K1(a上/a下)K2(b上/b下)3：2：220501052458306394608338131620.831.033：3：230461077112647255803636821470.430.693：4：23301
28、48113373343185606364982370.250.29高速逆流色谱分离纯化抗生素39分离前分离前分离后分离后高速逆流色谱分离纯化抗生素40异构体异构体2（顺（顺-反异构体）反异构体）HPLC分析图分析图高速逆流色谱分离纯化抗生素41异构体异构体2分离的溶剂系统选择分离的溶剂系统选择(石油醚石油醚/甲醇甲醇/丙酮丙酮/水）水）HSCCCHSCCC分离分离石油醚石油醚/甲醇甲醇/丙酮丙酮/水水=3：1.5：3：2,流动相：流动相：LPLP固定相保留率：固定相保留率：83%;83%;流速：流速：2.0ml/min;2.0ml/min;转速转速:900rpm;:900rpm;=K K2 2
29、/K/K1 1=1.28/0.83=1.54=1.28/0.83=1.54 溶剂比例a上(峰面积)a下(峰面积)b上(峰面积)b下(峰面积)K1(a上/a下)K2(b上/b下)3：0.5：3：212380407217200216238221189036980.570.333：1.0：3：2880688813836092518637052423800.660.993：1.5：3：21135302513614393641640249964500.831.28高速逆流色谱分离纯化抗生素42分离前分离前分离后：分离后：2A（反式）（反式）CsAOACHHd,J=15.65ppm高速逆流色谱分离纯化抗生素432B（顺式）（顺式）CsAOACHHppmd,J=11.88高速逆流色谱分离纯化抗生素44致谢：同田生物的大力支持致谢：同田生物的大力支持本所：方东升本所：方东升 季新燕季新燕 温耀明温耀明 陈振伟陈振伟 陈秀明陈秀明 方剑英方剑英 范建辉等范建辉等 谢谢大家！
