1、生物技术实践生物技术实践第第 37 37 讲讲DNA和蛋白质技术和蛋白质技术选修11 1进行进行DNADNA的粗提取与鉴定。的粗提取与鉴定。2 2尝试尝试PCRPCR技术的基本操作和应用。技术的基本操作和应用。3 3尝试蛋白质的提取和分离。尝试蛋白质的提取和分离。1 1(2010(2010江苏江苏)某生物兴趣小组开展某生物兴趣小组开展DNADNA粗提粗提取的相关探究活动。具体步骤如下：取的相关探究活动。具体步骤如下：材料处理：称取新鲜的花菜、辣椒和蒜黄各材料处理：称取新鲜的花菜、辣椒和蒜黄各2 2份，每份份，每份10 g10 g。剪碎后分成两组，一组置。剪碎后分成两组，一组置于于20 20、另
2、一组置于、另一组置于20 20 条件下保存条件下保存24 h24 h。DNADNA粗提取：粗提取：第一步：第一步：将上述材料分别放入研钵中，各加将上述材料分别放入研钵中，各加入入15 mL15 mL研磨液，充分研磨。用两层纱布过研磨液，充分研磨。用两层纱布过滤，取滤液备用。滤，取滤液备用。第二步：第二步：先向先向6 6只小烧杯中分别注入只小烧杯中分别注入10 mL10 mL滤液滤液，再加入，再加入20 mL20 mL体积分数为体积分数为95%95%的冷酒精溶液的冷酒精溶液，然后用玻璃棒缓缓地向一个方向搅拌，使，然后用玻璃棒缓缓地向一个方向搅拌，使絮状物缠绕在玻璃棒上。絮状物缠绕在玻璃棒上。第三
3、步：第三步：取取6 6支试管，分别加入等量的支试管，分别加入等量的2 mol/L 2 mol/L NaClNaCl溶液溶解上述絮状物。溶液溶解上述絮状物。DNADNA检测：在上述试管中各加入检测：在上述试管中各加入4 mL4 mL二苯胺试二苯胺试剂，混合均匀后，置于沸水中加热剂，混合均匀后，置于沸水中加热5 min5 min，待试管冷却后比较溶液的颜色深浅，结果如待试管冷却后比较溶液的颜色深浅，结果如下表。下表。(注：注：“”越多表示蓝色越深越多表示蓝色越深)分析上述实验过程，回答下列问题：分析上述实验过程，回答下列问题：(1)(1)该探究性实验课题名称是该探究性实验课题名称是 。(2)(2)
4、第二步中第二步中“缓缓地缓缓地”搅拌，这是为了减少搅拌，这是为了减少 。探究不同材料和探究不同材料和不同保存温度对不同保存温度对DNA提取量的影响提取量的影响DNA断裂断裂(3)(3)根据实验结果，得出结论并分析。根据实验结果，得出结论并分析。结论结论1 1：与与20 20 相比，相同实验材料在相比，相同实验材料在20 20 条条件下保存，件下保存，DNADNA的提取量较多。的提取量较多。结论结论2 2：。针对结论针对结论1 1，请提出合理的解释：，请提出合理的解释：。(4)(4)氯仿密度大于水，能使蛋白质变性沉淀，与水和氯仿密度大于水，能使蛋白质变性沉淀，与水和DNADNA均不相溶，且对均不
5、相溶，且对DNADNA影响极小。为了进一步提影响极小。为了进一步提高高DNADNA纯度，依据氯仿的特性，在纯度，依据氯仿的特性，在DNADNA粗提取第三粗提取第三步的基础上继续操作的步骤是：步的基础上继续操作的步骤是：，然后用体积分数为，然后用体积分数为95%95%的冷酒精溶液使的冷酒精溶液使DNADNA析出析出。等质量的不同实验材料，在相同的保存温等质量的不同实验材料，在相同的保存温度下，从蒜黄提取的度下，从蒜黄提取的DNA量最多量最多 低温抑制了相关酶低温抑制了相关酶的活性，的活性，DNA降解速度慢降解速度慢 将第三步获得的溶液分别与将第三步获得的溶液分别与等量的氯仿充分混合，静置一段时间
6、，吸取上清液等量的氯仿充分混合，静置一段时间，吸取上清液 本题考查了本题考查了DNADNA粗提取技术的原理、操粗提取技术的原理、操作过程及学生的分析、判断能力。从题目实验看作过程及学生的分析、判断能力。从题目实验看出，该实验的课题名称是探究不同材料和不同保出，该实验的课题名称是探究不同材料和不同保存温度对存温度对DNADNA提取量的影响。在实验的第二步中提取量的影响。在实验的第二步中，为了防止，为了防止DNADNA断裂，要缓缓地搅拌。从表中结断裂，要缓缓地搅拌。从表中结果看出，由于低温抑制了相关酶的活性，果看出，由于低温抑制了相关酶的活性，DNADNA降降解慢，使得相同材料在低温保存时，解慢，
7、使得相同材料在低温保存时，DNADNA提取量提取量大；在相同保存条件下，蒜黄蓝色最深，说明相大；在相同保存条件下，蒜黄蓝色最深，说明相同条件下从蒜黄中提取的同条件下从蒜黄中提取的DNADNA量最大。由于氯仿量最大。由于氯仿密度比水大，可使蛋白质变性后沉淀，而与水、密度比水大，可使蛋白质变性后沉淀，而与水、DNADNA不相溶，这样可将第三步获得的溶液分别与不相溶，这样可将第三步获得的溶液分别与等量的氯仿混合，静置一段时间，吸取上清液即等量的氯仿混合，静置一段时间，吸取上清液即可得到较纯净的可得到较纯净的DNADNA。2.(2008山东山东)科学家发现家蝇体内存在科学家发现家蝇体内存在一种抗菌活性
8、蛋白。这种蛋白质具有极强一种抗菌活性蛋白。这种蛋白质具有极强的抗菌能力，受到研究者重视。的抗菌能力，受到研究者重视。(1)分离该抗菌蛋白可用电泳法，其原分离该抗菌蛋白可用电泳法，其原理是根据蛋白质分子的理是根据蛋白质分子的，大小及性状不同，在电场中的大小及性状不同，在电场中的不不同而实现分离。同而实现分离。电荷电荷(带电情况带电情况)迁移速度迁移速度(2)可用金黄色葡萄球菌来检验该蛋白质的可用金黄色葡萄球菌来检验该蛋白质的体外抗菌特性。抗菌实验所用培养基中的牛体外抗菌特性。抗菌实验所用培养基中的牛肉膏和蛋白胨主要为细菌生长提供肉膏和蛋白胨主要为细菌生长提供和和。(3)分别在加入和未加入该抗菌蛋
9、白的培养分别在加入和未加入该抗菌蛋白的培养基中接种等量菌液。培养一定时间后，比较基中接种等量菌液。培养一定时间后，比较两种培养基中菌落的两种培养基中菌落的，确定该蛋白质，确定该蛋白质的抗菌效果。的抗菌效果。(4)抗 菌 培 养 常 用 的 接 种 方 法 有抗 菌 培 养 常 用 的 接 种 方 法 有 .和和。实验结。实验结束后，对使用过的培养基应进行束后，对使用过的培养基应进行处理。处理。碳源碳源氮源氮源数量数量平板划线法平板划线法稀释涂布平板法稀释涂布平板法(稀释混合平板法稀释混合平板法)灭菌灭菌(1)电泳是指带电粒子在电场的作用下发电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。许多重要
10、的生物大分子，如生迁移的过程。许多重要的生物大分子，如多肽、蛋白质、核酸等都具有可解离基团，多肽、蛋白质、核酸等都具有可解离基团，它们在某个特定的它们在某个特定的pH下会带上正电或负电下会带上正电或负电；在电场的作用下，这些带电分子会向着与；在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极方向移动。电泳技术其所带电荷相反的电极方向移动。电泳技术就是在电场的作用下，利用待分离样品中各就是在电场的作用下，利用待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而达到对样品
11、进行分离、鉴定或提纯度，从而达到对样品进行分离、鉴定或提纯的目的。的目的。(2)牛肉膏和蛋白胨是成分复杂的天牛肉膏和蛋白胨是成分复杂的天然有机物，能为微生物提供碳源、氮然有机物，能为微生物提供碳源、氮源。源。(3)可采用逆向思维。若抗菌蛋白具可采用逆向思维。若抗菌蛋白具有抗菌效果，即抗菌蛋白抑制了金黄有抗菌效果，即抗菌蛋白抑制了金黄色葡萄球菌的生长繁殖，则不形成菌色葡萄球菌的生长繁殖，则不形成菌落或菌落数量明显偏少。落或菌落数量明显偏少。(4)微生物接种的方法很多，最常用的是微生物接种的方法很多，最常用的是平板划线法和稀释涂布平板法。平板划线平板划线法和稀释涂布平板法。平板划线法通过接种环在琼
12、脂固体培养基表面连续法通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。稀释涂布平板法则是将到培养基的表面。稀释涂布平板法则是将菌液进行一系列的梯度稀释。然后将不同菌液进行一系列的梯度稀释。然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。实验结束后，使用过的表面，进行培养。实验结束后，使用过的培养基应该进行灭菌处理才能倒掉，这的培养基应该进行灭菌处理才能倒掉，这样做的目的是防止造成环境污染。样做的目的是防止造成环境污染。一、一、DNA的粗提取与鉴定的粗提取与鉴定1.原理原
13、理粗提粗提取取DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶溶液中溶解度不同。在液中溶解度不同。在0.14 mol/L 的的NaCl溶液溶液中中DNA溶解度最溶解度最 .DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质则不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质则溶于酒精溶于酒精DNA与杂质对酶、高温和洗涤剂的耐受性不同与杂质对酶、高温和洗涤剂的耐受性不同鉴定鉴定DNA+蓝色蓝色二苯胺二苯胺沸水浴沸水浴5 min低低2.粗提取流程粗提取流程(以鸡血细胞液做实验材料为例以鸡血细胞液做实验材料为例)3.鉴定鉴定序号序号试管试管A试管试管B2 mol/L 的的NaCl溶溶液液5 m
14、L5 mL加丝状物，用玻璃加丝状物，用玻璃棒搅拌棒搅拌加二苯胺加二苯胺4 mL，混匀，混匀4 mL，混匀，混匀沸水浴沸水浴5 min5 min实验现象实验现象变蓝变蓝不变蓝不变蓝实验结论实验结论丝状物的主要成分是丝状物的主要成分是DNA分子分子本实验不能用哺乳动物的成熟红细胞作本实验不能用哺乳动物的成熟红细胞作实验材料，原因是哺乳动物的成熟红细胞实验材料，原因是哺乳动物的成熟红细胞内无细胞核，但它可作为血红蛋白提取和内无细胞核，但它可作为血红蛋白提取和制备细胞膜的理想材料。制备细胞膜的理想材料。体内复制体内复制PCR反应反应解旋解旋在解旋酶作用下，在解旋酶作用下，细胞提供能量，细胞提供能量，部
15、分解开部分解开加热至加热至90，双链全部解，双链全部解开，不需解旋酶开，不需解旋酶温度温度体内温和条件体内温和条件高温高温引物引物一小段一小段RNARNA或单链或单链DNA分子片段分子片段合成合成子子链链在引物基础上，在引物基础上，一条链连续合一条链连续合成，另一条链成，另一条链不连续合成不连续合成分别从两条链的引物端开分别从两条链的引物端开始，都是连续合成，控始，都是连续合成，控制温度制温度72 二、多聚酶链式反应扩增二、多聚酶链式反应扩增DNA片段片段1.生物体内生物体内DNA复制与复制与PCR反应的比较反应的比较体内复制体内复制PCR反应反应特点特点边解旋边复制，半保留复制边解旋边复制，
16、半保留复制体外迅速扩增体外迅速扩增酶酶解旋酶、解旋酶、DNA聚合酶等聚合酶等TaqDNA聚合酶聚合酶循环循环次次数数受生物体自身控制受生物体自身控制30多次多次相同相同点点生物体内的生物体内的DNA复制和复制和PCR体外体外DNA扩增都扩增都需要模板、四种脱氧核苷酸，子链延伸的方需要模板、四种脱氧核苷酸，子链延伸的方向都是从向都是从5端端3端端条条件件稳定的缓冲液环境；稳定的缓冲液环境；DNA模板；分别与模模板；分别与模板板DNA两条模板链相结合的两种引物；两条模板链相结合的两种引物；A、T、G、C四种脱氧核苷酸；耐热的四种脱氧核苷酸；耐热的DNA聚合酶，聚合酶，一般用一般用TaqDNA聚合酶
17、；能严格控制温度变化聚合酶；能严格控制温度变化的温控设备的温控设备过过程程变性：当温度上升到变性：当温度上升到90 以上时，双链以上时，双链DNA解解旋为单链旋为单链复性：温度下降为复性：温度下降为50 左右时，两种引物通过碱左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链基互补配对与两条单链DNA结合结合延伸：当温度上升到延伸：当温度上升到72 左右，四种脱氧核苷酸左右，四种脱氧核苷酸在在DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的对原则合成新的DNA链链2.PCR反应反应蛋白质分蛋白质分离的方离的方法法三、血红蛋白的提取和分离三、血红蛋白的提取和分离1.蛋白质
18、分离的方法蛋白质分离的方法凝胶色谱法凝胶色谱法电泳法电泳法蛋白质蛋白质相对分子质量大相对分子质量大相对分子质量小相对分子质量小运动方式运动方式排阻在凝胶颗粒排阻在凝胶颗粒外面，迅速通外面，迅速通过过进入凝胶颗粒内进入凝胶颗粒内部，被滞留部，被滞留移动速度移动速度.运动路程运动路程较短较短较长较长洗脱次序洗脱次序先先后后凝胶色谱法凝胶色谱法较快较快较慢较慢原理原理:一些生物大分子一些生物大分子(如多肽、核酸等如多肽、核酸等),在一定在一定pH下，其可解离的基团会带下，其可解离的基团会带上正电或负电上正电或负电,在电场的作用下在电场的作用下,这些这些带电分子会向着与其所带电荷带电分子会向着与其所带
19、电荷的的电极移动电极移动影响因素影响因素:各种分子带电性质的差异以及各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状分子本身的大小、形状常用方法常用方法:琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶电泳(通常使用通常使用聚丙聚丙烯酰胺凝胶电泳烯酰胺凝胶电泳)电泳法电泳法相反相反SDS步骤步骤目的目的过程过程样样品品处处理理红红细细胞胞洗洗涤涤去除杂蛋白，去除杂蛋白，以利于后以利于后续步骤的续步骤的分离纯化分离纯化分离分离(低速短时间离心低速短时间离心)用胶用胶头吸管吸去上层透明黄色血头吸管吸去上层透明黄色血浆浆下层红色细胞用下层红色细胞用洗涤洗涤(低速短时间离心低速短时间离心
20、)三次三次血血红红蛋蛋白白的的释释放放使红细胞破使红细胞破裂释放血裂释放血红蛋白红蛋白依图中依图中abcd顺序顺序2.蛋白质的提取和分离操作流程蛋白质的提取和分离操作流程生理盐水生理盐水步骤步骤目的目的过程过程样样品品处处理理分分离离血血红红蛋蛋白白经过离心使血红经过离心使血红蛋白和其他杂蛋白和其他杂质分离开来，质分离开来，便于下一步对便于下一步对血红蛋白的纯血红蛋白的纯化化搅拌好的混合液转移至搅拌好的混合液转移至离心管中，离心管中，2000 r/min速度离心速度离心10 min(高速长时间高速长时间)滤滤纸过滤除去杂质得血纸过滤除去杂质得血红蛋白红蛋白粗分离粗分离(透析透析)除去样品中分子
21、除去样品中分子量较小的杂质量较小的杂质或用于更换样或用于更换样品的缓冲液品的缓冲液1 mL 血红蛋白溶液血红蛋白溶液透析袋透析袋20 mmol/L 的的(pH为为7.0)12h装入装入放入放入透析透析磷酸缓冲液磷酸缓冲液步骤步骤目的目的过程过程纯纯化化凝胶色谱凝胶色谱柱制作柱制作通过凝胶色通过凝胶色谱操作，谱操作，根据根据 .分离蛋分离蛋白质白质(将将相对分子相对分子质量大的质量大的杂质蛋白杂质蛋白除去除去)取玻璃管取玻璃管制作柱底部制作柱底部制作柱顶部制作柱顶部凝胶色谱凝胶色谱柱的装填柱的装填固定色谱柱固定色谱柱计算所需计算所需凝胶量凝胶量凝胶用蒸馏凝胶用蒸馏水溶胀水溶胀装填装填洗涤洗涤平衡
22、平衡样品的加样品的加入和洗脱入和洗脱调整缓冲液面调整缓冲液面滴加透滴加透析样品析样品样品渗入凝样品渗入凝胶床胶床洗脱洗脱收集收集相对分子相对分子质量的大小质量的大小步骤步骤目的目的过程过程纯度鉴定纯度鉴定判断纯化的蛋白判断纯化的蛋白质是否达到要质是否达到要求求使用最多的是使用最多的是SDS聚丙烯酰胺凝胶电聚丙烯酰胺凝胶电泳泳(操作选做操作选做)相对分子质量不同的蛋白质通过相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较小的容易进凝胶时，相对分子质量较小的容易进入凝胶内部的通道，而相对分子质量入凝胶内部的通道，而相对分子质量较大的蛋白质只能在凝胶外部移动，较大的蛋白质只能在凝胶外部移动，移动速
23、度快，因此相对分子质量不同移动速度快，因此相对分子质量不同的蛋白质分子彼此分离。的蛋白质分子彼此分离。1.如何正确区分破碎动物细胞和植物细胞的原理如何正确区分破碎动物细胞和植物细胞的原理和方法？和方法？原理原理方法方法动物细动物细胞胞(鸡鸡血细血细胞胞)在低浓度溶在低浓度溶液中会吸液中会吸水甚至涨水甚至涨破破鸡血细胞液中加入一定量的蒸鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌，馏水，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液过滤后收集滤液植物细植物细胞胞(洋洋葱细葱细胞胞)洗涤剂能够洗涤剂能够瓦解细胞瓦解细胞膜膜在切碎的洋葱中，加入一定的在切碎的洋葱中，加入一定的洗涤剂和食盐，进行充分的洗涤剂和食
24、盐，进行充分的搅拌和研磨，过滤后收集研搅拌和研磨，过滤后收集研磨液磨液2.教材中去除滤液中杂质的三种方案有教材中去除滤液中杂质的三种方案有什么不同？什么不同？原理原理方法方法方方案案一一DNA在不同在不同浓度的浓度的NaCl溶液溶液中溶解度中溶解度不同不同在滤液中加入在滤液中加入2 mol/L NaCl溶液，溶液，过滤除去不溶杂质；再调节过滤除去不溶杂质；再调节NaCl溶液浓度为溶液浓度为0.14 mol/L，析出析出DNA，过滤除去不溶的杂，过滤除去不溶的杂质，再用质，再用2 mol/L NaCl溶液溶溶液溶解解DNA原理原理方法方法方方案案二二DNA对酶对酶的耐受的耐受性性直接在滤液中加入
25、嫩肉粉，反应直接在滤液中加入嫩肉粉，反应1015 min，嫩肉粉中的木瓜蛋，嫩肉粉中的木瓜蛋白酶能够分解蛋白质白酶能够分解蛋白质方方案案三三DNA对高对高温的耐温的耐受性受性将滤液放在将滤液放在6075 的恒温水浴箱的恒温水浴箱中保温中保温1015 min，注意严格控，注意严格控制温度范围，使蛋白质沉淀而制温度范围，使蛋白质沉淀而DNA分子还未变性，可将分子还未变性，可将DNA与与蛋白质分离蛋白质分离3.如何区分如何区分DNA粗提取实验中部分操作的目的？粗提取实验中部分操作的目的？加蒸加蒸馏馏水水加到鸡血细胞液，使血细胞吸水胀裂加到鸡血细胞液，使血细胞吸水胀裂加到含加到含DNA的的2 mol/
26、L NaCl溶液，使溶液，使DNA析出析出用纱用纱布布过过滤滤过滤血细胞破裂液，提取细胞核物质过滤血细胞破裂液，提取细胞核物质(滤液滤液)滤取滤取0.14 mol/L NaCl溶液中析出的溶液中析出的DNA(黏稠物黏稠物)过滤溶有过滤溶有DNA的的2 mol/L NaCl溶液溶液(滤液滤液)用用NaCl溶溶液液加加2 mol/L NaCl溶液，溶解提取的细胞核溶液，溶解提取的细胞核物质物质(加蒸馏水加蒸馏水)0.14 mol/L NaCl溶液使溶液使DNA析析出出加加2 mol/L NaCl溶液，溶解滤取的溶液，溶解滤取的DNA黏黏稠物稠物用用2 mol/L NaCl溶液，溶解丝状物用于鉴溶液
27、，溶解丝状物用于鉴定定DNA4.什么是什么是3端和端和5端？端？DNA复制为什么需要引物复制为什么需要引物？为了明确地表示为了明确地表示DNA的方向，通常将的方向，通常将DNA的羟的羟基基(OH)末端称为末端称为3端，而含磷酸基团的末端称为端，而含磷酸基团的末端称为5端；一个双链端；一个双链DNA分子中含分子中含2个个3端和端和2个个5端，端，如果一条链的方向是如果一条链的方向是35，则另一条链的方向就，则另一条链的方向就是是53，这就是反向平行的含意。，这就是反向平行的含意。DNA聚合酶不能从头开始合成聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从，而只能从3端延伸端延伸DNA链。链。PCR实验中，
28、引物长度通常为实验中，引物长度通常为2030个核苷酸。个核苷酸。5.PCR实验中应注意哪些问题？如何进行实验中应注意哪些问题？如何进行PCR结结果的分析与评价？果的分析与评价？(1)PCR实验中的注意事项：实验中的注意事项：避免外源避免外源DNA污染：所用仪器、缓冲液、蒸馏污染：所用仪器、缓冲液、蒸馏水等使用前进行高压灭菌。水等使用前进行高压灭菌。缓冲液和酶分装成小份，缓冲液和酶分装成小份，-20 低温保存。低温保存。每添加一种反应成分，更换一个移液器的枪头每添加一种反应成分，更换一个移液器的枪头。混匀后离心处理，使反应液集中在离心管底部混匀后离心处理，使反应液集中在离心管底部。(2)PCR结
29、果的分析与评价：结果的分析与评价：对于教材中的方法，可以通过计算对于教材中的方法，可以通过计算DNA含量来含量来评价扩增的效果。评价扩增的效果。原理：原理：DNA在在260 nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与，峰值的大小与DNA的含量有关。的含量有关。过程：稀释过程：稀释对照调零对照调零测定测定计算。计算。对于电泳检测的方法，可以通过在紫外线下直对于电泳检测的方法，可以通过在紫外线下直接观察接观察DNA带的分布及粗细程度来评价扩增的效果带的分布及粗细程度来评价扩增的效果。扩增不成功的可能原因有：漏加了扩增不成功的可能原因有：漏加了PCR的反应的反应成分，
30、各反应成分的用量不当，成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当程序设置不当等。等。6.分离血红蛋白的样品处理中，红细胞分离血红蛋白的样品处理中，红细胞洗涤时为什么要低速短时间离心，并且要洗涤时为什么要低速短时间离心，并且要洗涤三次？洗涤三次？红细胞洗涤时，洗涤次数、离心速度与红细胞洗涤时，洗涤次数、离心速度与离心时间十分重要。洗涤次数过少，无法离心时间十分重要。洗涤次数过少，无法除去血浆蛋白；离心速度过高和时间过长除去血浆蛋白；离心速度过高和时间过长会使白细胞等一起沉淀，达不到分离的效会使白细胞等一起沉淀，达不到分离的效果。洗涤三次后，若上清液仍有黄色，可果。洗涤三次后，若上清液仍有黄色
31、，可增加洗涤次数，否则无法除去血浆蛋白。增加洗涤次数，否则无法除去血浆蛋白。7.凝胶色谱柱的装填有什么要求？如何凝胶色谱柱的装填有什么要求？如何进行样品的加入和洗脱？进行样品的加入和洗脱？在色谱柱中填凝胶的时候要尽量紧密，在色谱柱中填凝胶的时候要尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。一是在装填以降低凝胶颗粒之间的空隙。一是在装填凝胶柱时，不能有气泡存在，因为气泡会凝胶柱时，不能有气泡存在，因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。二是在凝胶色谱操作过程中，不离效果。二是在凝胶色谱操作过程中，不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象能发生洗脱液流干，露
32、出凝胶颗粒的现象。一旦发生上述两种情况，凝胶色谱柱需。一旦发生上述两种情况，凝胶色谱柱需要重新装填。要重新装填。滴加样品时，吸管管口贴着管壁环滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，不要破坏凝胶面。在蛋绕移动加样，不要破坏凝胶面。在蛋白质分离过程中，仔细观察红色区带白质分离过程中，仔细观察红色区带在洗脱过程中的移动情况，如果红色在洗脱过程中的移动情况，如果红色区带均匀一致地移动，说明色谱柱制区带均匀一致地移动，说明色谱柱制作成功。根据红色区带的移动状况判作成功。根据红色区带的移动状况判断收集流出液时间，待红色的蛋白质断收集流出液时间，待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出接近色谱柱底
33、端时，用试管收集流出液，每液，每5 mL 收集一管，连续收集。收集一管，连续收集。DNA的粗提取与鉴定的粗提取与鉴定 下表是关于下表是关于DNA粗提取与鉴定实验中，粗提取与鉴定实验中，所使用的材料、操作及其作用的表述，正所使用的材料、操作及其作用的表述，正确的是确的是()试剂试剂操作操作作用作用A柠檬酸柠檬酸钠溶钠溶液液与鸡血混合与鸡血混合防止防止DNA受损受损B蒸馏水蒸馏水与鸡血细胞混合与鸡血细胞混合保持细胞形状保持细胞形状C蒸馏水蒸馏水加入到溶解有加入到溶解有DNA的的NaCl溶液中溶液中析出析出DNA丝状丝状物物D冷却的冷却的酒精酒精加入到过滤后含加入到过滤后含DNA的的NaCl溶液中溶
34、液中产生特定的颜产生特定的颜色反应色反应 C在在“DNA粗提取与鉴定粗提取与鉴定”实验中柠实验中柠檬酸钠可以防止血液凝固；鸡血中加檬酸钠可以防止血液凝固；鸡血中加入蒸馏水可以使细胞膜破裂；入蒸馏水可以使细胞膜破裂；DNA在在不同的氯化钠溶液中的溶解度不同，不同的氯化钠溶液中的溶解度不同，在在0.14 mol/L 时，溶解度最低，有利时，溶解度最低，有利于于DNA析出；析出；DNA不溶于酒精，但细不溶于酒精，但细胞中的某些物质可以溶于酒精，所以胞中的某些物质可以溶于酒精，所以加入酒精，可以获得较纯的加入酒精，可以获得较纯的DNA；DNA遇二苯胺产生蓝色反应遇二苯胺产生蓝色反应(需要沸需要沸水浴加
35、热水浴加热)。在在“DNA粗提取与鉴定粗提取与鉴定”的实验中，将含有的实验中，将含有一定杂质的一定杂质的DNA丝状物分别放入体积为丝状物分别放入体积为2 mL 的的四种溶液中，经搅拌后过滤，获得四种溶液中，经搅拌后过滤，获得4种滤液，含种滤液，含DNA较少的是较少的是()A.B.C.D.C1 蒸馏水中蒸馏水中搅拌后过滤搅拌后过滤 滤液滤液E2 2 mol/L 的的NaCl溶液溶液搅拌后过滤搅拌后过滤 滤液滤液F3 0.14 mol/L 的的NaCl溶液溶液中中搅拌后过滤搅拌后过滤 滤液滤液G4 冷却的冷却的95%的酒精溶液中的酒精溶液中 搅拌后过滤搅拌后过滤 滤液滤液HDNA在不同浓度的在不同
36、浓度的NaCl溶液中溶溶液中溶解度不同，在解度不同，在0.14 mol/L 的的NaCl溶液溶液中溶解度最低，参照中溶解度最低，参照DNA在在NaCl溶溶液中溶解度曲线，可知中只有液中溶解度曲线，可知中只有滤液滤液G中中DNA含量较少。含量较少。DNA不不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质则溶于酒精，利用这一原理可以将质则溶于酒精，利用这一原理可以将DNA与蛋白质进一步分离，可见与蛋白质进一步分离，可见滤液滤液H中中DNA也较少。也较少。DNA与蛋白质的溶解性不同与蛋白质的溶解性不同：溶解规律溶解规律2mol/LNaCl溶液溶液0.14mol/LNaCl溶液溶液
37、DNA溶解溶解析出析出蛋蛋白白质质NaCl溶液浓度从溶液浓度从2 mol/L降低过程中，降低过程中，其溶解度逐渐增其溶解度逐渐增大大部分发生盐部分发生盐析沉淀析沉淀溶解溶解多聚酶链式反应扩增多聚酶链式反应扩增DNA片段片段 关于关于DNA的复制，下列叙述正确的是的复制，下列叙述正确的是()A.DNA聚合酶不能从头开始合成聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从只能从5端延伸端延伸DNA链链B.DNA复制不需要引物复制不需要引物C.引物与引物与DNA母链通过碱基互补配对进母链通过碱基互补配对进行结合行结合D.DNA的合成方向总是从子链的的合成方向总是从子链的3端向端向5端延伸端延伸 C由于由于DNA
38、聚合酶不能从头开始聚合酶不能从头开始合成合成DNA，只能从引物的，只能从引物的3端即端即复制方向由复制方向由3端向端向5端延伸；由于端延伸；由于DNA分子是反向平行的，子链是分子是反向平行的，子链是依据碱基互补配对原则，在依据碱基互补配对原则，在DNA聚合酶作用下合成的，其合成方聚合酶作用下合成的，其合成方向是从子链向是从子链5端向端向3端延伸。端延伸。下图示下图示PCR技术扩增获取技术扩增获取DNA的过程。扩增时的过程。扩增时首先使首先使DNA两条链解开为单链；然后冷却使两条链解开为单链；然后冷却使“引物引物”(DNA复制时所需的约复制时所需的约20个核苷酸的短链个核苷酸的短链)与单链与单链
39、相应碱基互补序列结合；再在热稳定相应碱基互补序列结合；再在热稳定DNA聚合酶的聚合酶的作用下进行延伸，合成与模板互补的作用下进行延伸，合成与模板互补的DNA新链，如新链，如此反复循环。上述过程可在此反复循环。上述过程可在PCR扩增仪中自动完成扩增仪中自动完成。(1)图中过程也称为图中过程也称为DNA的变性，此过的变性，此过程在温度高达程在温度高达9095 时才能完成，说明时才能完成，说明DNA分子具有分子具有性。性。(2)过 程 在 人 体 内 可 由过 程 在 人 体 内 可 由.催化完成。催化完成。(3)由题中信息可知，在由题中信息可知，在PCR扩增仪中进扩增仪中进行行DNA自动扩增时，若
40、起始时有自动扩增时，若起始时有a个个DNA分子，连续扩增分子，连续扩增n代，可形成代，可形成个个DNA分子。分子。稳定稳定DNA聚合酶聚合酶(DNAa2n聚合酶、聚合酶、DNA连接酶连接酶)DNA比蛋白质更能忍受高温，分子结构具有相比蛋白质更能忍受高温，分子结构具有相对的稳定性，其中对的稳定性，其中GC碱基对占比例越高的碱基对占比例越高的DNA分子越稳定。为延伸过程，在体外扩增是耐高温分子越稳定。为延伸过程，在体外扩增是耐高温的的DNA聚合酶催化，在体内是由聚合酶催化，在体内是由DNA聚合酶催化完聚合酶催化完成。依据起始成。依据起始a个以及个以及DNA扩增呈指数增长，可得扩增呈指数增长，可得答
41、案。答案。PCR一般要经历三十多次循环，每次循环都包括一般要经历三十多次循环，每次循环都包括变性、复性、延伸三步。两引物之间的固定长度的变性、复性、延伸三步。两引物之间的固定长度的DNA序列呈指数扩增。序列呈指数扩增。血红蛋白的提取和分离血红蛋白的提取和分离 蛋白质的分离与纯化技术是蛋白质研究的重蛋白质的分离与纯化技术是蛋白质研究的重要技术。下列有关叙述不正确的是要技术。下列有关叙述不正确的是()A.根据蛋白质分子不能透过半透膜的特性，根据蛋白质分子不能透过半透膜的特性，可将样品中各种不同的蛋白质分离可将样品中各种不同的蛋白质分离B.根据蛋白质所带电荷性质的差异及分子大根据蛋白质所带电荷性质的
42、差异及分子大小等，可通过电泳分离蛋白质小等，可通过电泳分离蛋白质C.根据蛋白质相对分子质量的大小，可通过根据蛋白质相对分子质量的大小，可通过凝胶色谱法分离蛋白质凝胶色谱法分离蛋白质D.根据蛋白质的分子大小、密度不同，可通根据蛋白质的分子大小、密度不同，可通过离心沉降法分离蛋白质过离心沉降法分离蛋白质 AA项蛋白质分子既然不能透过半透膜项蛋白质分子既然不能透过半透膜，那样品中的各种不同的蛋白质仍在透析袋内，而，那样品中的各种不同的蛋白质仍在透析袋内，而不能达到分离的目的。不能达到分离的目的。B正确：电泳利用了分离样正确：电泳利用了分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小品中各种分子带电
43、性质的差异以及分子本身的大小、形状不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从、形状不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。而实现样品中各种分子的分离。C正确：凝胶色谱正确：凝胶色谱法也称作分配色谱法，是根据相对分子质量的大小法也称作分配色谱法，是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。分离蛋白质的有效方法。D正确：根据蛋白质的分正确：根据蛋白质的分子大小、密度不同，可通过离心沉降法分离蛋白质子大小、密度不同，可通过离心沉降法分离蛋白质，分子大、密度大的在沉淀物中。，分子大、密度大的在沉淀物中。下列叙述错误的是下列叙述错误的是()A.在一定范围内，缓冲溶液能够抵制外在一
44、定范围内，缓冲溶液能够抵制外界的酸和碱对溶液界的酸和碱对溶液pH的影响，维持的影响，维持pH基基本不变本不变B.电泳是指带电粒子在电场的作用下发电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程生迁移的过程C.洗涤红细胞时，用五倍体积的蒸馏水洗涤红细胞时，用五倍体积的蒸馏水充分冲洗充分冲洗D.缓冲溶液通常由缓冲溶液通常由12种缓冲剂溶解于种缓冲剂溶解于水中配制而成水中配制而成C洗涤红细胞时，应是加入五倍体积洗涤红细胞时，应是加入五倍体积的生理盐水，以维持红细胞的正常形的生理盐水，以维持红细胞的正常形态和结构。态和结构。血液样品处理后，若分层不明显，血液样品处理后，若分层不明显，原因有：洗涤次数少，未能除去血原因有：洗涤次数少，未能除去血浆蛋白；离心速度过高和时间过长浆蛋白；离心速度过高和时间过长。p 经常不断地学习,你就什么都知道。你知道得越多,你就越有力量p Study Constantly,And You Will Know Everything.The More You Know,The More Powerful You Will Be写在最后Thank You在别人的演说中思考，在自己的故事里成长Thinking In Other PeopleS Speeches，Growing Up In Your Own Story讲师：XXXXXX XX年XX月XX日
