1、第四章第四章 微生物的生长微生物的生长第一节第一节 微生物生长的测定微生物生长的测定 微生物生长情况可以通过测定单位时间里微生物数量或生物量的变化来评价。通过微生物生长的测定可以客观地评价培养条件、营养物质等对微生物生长的影响，或评价不同的抗菌物质对微生物产生抑制（或杀死）作用的效果，或客观反应微生物的生长规律。因此微生物生长的测量在理论上和实践上有着重要的意义。根据考察的角度、测定的条件和要求不同，可将微生物生长的测量方法分为直接计数法和间接计数法。第一节第一节 微生物生长的测定微生物生长的测定 一、直接计数法一、直接计数法 （一）计数器直接计数法 又称全菌计数法，将待测样品适当稀释后，染色
2、，加到血球计数板(适用于细胞个体形态较大的单细胞微生物，如酵母菌等)或细菌计数板(适用于细胞个体形态较小的细菌)上的计数室内，在显微镜下计数一定体积中的平均细胞数，换算出待测样品的细胞数。这是一种常用的方法，快速、简便，所得结果是死菌和活菌的总数（图 4-1）。第一节第一节 微生物生长的测定微生物生长的测定 图 4-1 血球计数板方格示意图 第一节第一节 微生物生长的测定微生物生长的测定 （二）比浊法 这是测定菌悬液中细胞数量的快速方法。其原理是菌悬液中的单细胞微生物的细胞浓度与混浊度成正比，与透光度成反比。细胞越多，浊度越大，透光量越少。因此，测定菌悬液的光密度(或透光度)或浊度可以反映细胞
3、的浓度。将未知细胞数的悬液与已知细胞数的菌悬液相比，求出未知菌悬液所含的细胞数。浊度计、分光光度计是测定菌悬液细胞浓度的常用仪器。此法比较简便，但使用有局限性。适用于菌悬液浓度在10-7个/mL以上、颜色浅，没有混杂其他物质的样品。第一节第一节 微生物生长的测定微生物生长的测定 （三）称重法 这是一种常用的方法，直接称量样品的干重或湿重。一般细菌干重约为湿重的 2025。此法直接而又可靠，但要求测定时菌体浓度较高，样品中不含杂质，对单细胞及多细胞均适用，尤其是测定菌丝体常用的方法。第一节第一节 微生物生长的测定微生物生长的测定 （四）菌丝长度测定法 这是针对丝状真菌生长而确定的测定方法，一般在
4、固定培养基上进行。最直接的方法就是将真菌接种到平皿的中央，定时测定菌落的直径或面积。对生长快的真菌，每间隔24h测一次，对生长慢的真菌可以数天测定一次，直到菌落覆盖了整个平皿，据此可以测出菌丝的生长速度。不过这种方法不能反映菌丝的纵向生长，即菌落的厚度和深入培养基的菌丝。另外，接种量也会影响测定结果。第一节第一节 微生物生长的测定微生物生长的测定 （五）平板菌落计数 平板菌落计数法可以反映出样品中活菌的数量，又叫活菌计数法。将单细胞微生物待测液经10倍系列稀释后，把最后三个稀释浓度的稀释液各取一定的量接种到琼脂平板培养基上培养，长出的菌落数就是稀释液中含有的活细胞数，据此计算出供测样品中的活细
5、胞数。也可以将经过灭菌后冷却至4550的固体培养基与一定稀释度和体积的菌悬液在培养皿中混匀再倒入培养皿，凝固后培养适当时间，测定菌落形成单位的数目，以此推算出待测样品中的活细胞数。此法要求菌体成分散状态，否则无法确定单个菌落是否由单个细胞形成。因此比较适合于细菌和酵母菌等单细胞微生物计数，不适合于霉菌等多细胞微生物计数。第一节第一节 微生物生长的测定微生物生长的测定 （六）薄膜过滤计数法 测定水与空气中的活菌数量时，由于含菌浓度低，则可先将待测样品(一定体积的水或空气)通过微孔薄膜(如硝化纤维薄膜)过滤浓缩，然后把滤膜放在适当的固体培养基上培养，长出菌落后即可计数。此法适用于测定量大、含菌浓度
6、很低的流体样品，如水、空气等。第一节第一节 微生物生长的测定微生物生长的测定 二、间接计数法二、间接计数法 （一）测定细胞组分的含量进行估算 1.含氮量测定法 细胞的蛋白质含量是比较稳定的，可以从蛋白质含量的测定求出细胞物质量。一般细菌的含氮量约为原生质干重14。而总氮量与细胞蛋白质总含量的关系可用下式计算：蛋白质总量=含氮量百分比 6.25 2.DNA 测定法 这种方法是基于 DNA 与 DABA 2HCl(即新配制的 20 WW，3,5-二氨基苯甲酸盐酸溶液)结合能显示特殊荧光反应的原理，定量测定培养物的菌悬液的荧光反应强度，求得 DNA 的含量，可以直接反映所含细胞物质的量。同时还可根据
7、 DNA 含量计算出细菌的数量。每个细菌平均含 8.4 10-14 g DNA。第一节第一节 微生物生长的测定微生物生长的测定 3.ATP的含量测定法 ATP是细胞中储存能量的化学形式，它在各种微生物细胞中含量也较为稳定，一般是在10-6mol/L数量级。细菌细胞的ATP含量为每克细胞干重含有1mg ATP。ATP只存在于活细胞中，因细胞死亡后ATP会分解，因此ATP可以快速、灵敏地反映出活菌数量。第一节第一节 微生物生长的测定微生物生长的测定 (二)从培养基成分的消耗量来估算 选择一种不用于合成代谢产物的培养基成分为检测对象，如磷酸盐、硫酸盐和镁离子，从这些成分的消耗量可以间接的估算出菌体的
8、生长速度。若发酵的主要产品是菌体本身，也可以从碳源或氧的消耗来估算。(三）从细胞的代谢产物来估算 在有氧发酵中，CO2是细胞代谢的产物，它与微生物生长密切相关。在全自动发酵罐中大多采用红外线气体分析仪来测定发酵产生的CO2量，进而估算出微生物的生长量。第一节第一节 微生物生长的测定微生物生长的测定 （四）从发酵液的粘度来估算 随着菌体量的增加以及粘性的发酵产物的形成，发酵罐的粘度会显著地增大。发酵工厂常采用简单的粘度测定作为发酵生产量的监测指标之一。当然，发酵菌体的裂解或者染菌等不正常情况也会造成发酵粘度的增大或降低，从而产生估算的误差。（五）从发酵罐的酸碱度来估算 在某些特定的情况下，培养基
9、的pH的变化能较好地反映底物的消耗量和微生物的生长。例如氨的利用结果是释放出H+，导致pH下降；类似地，硝酸盐作为氮源，氢离子被从培养基中移去，导致pH上升。第一节第一节 微生物生长的测定微生物生长的测定 一、微生物个体细胞的生长一、微生物个体细胞的生长 工业上常接触到的细菌、酵母、霉菌的生长模式如图4-2图4-4所示。第二节第二节 微生物的生长规律微生物的生长规律第二节第二节 微生物的生长规律微生物的生长规律 （一）细菌细胞的生长 由图4-2中可看出，就大多数原核生物而言，其单个细胞持续生长直至分裂成两个新的细胞，这个过程称为二等分裂。杆状细菌如大肠杆菌在培养过程中，能观察到细胞延长至大约为
10、细胞最小长度的2倍时，处于细胞中间部位的细胞膜和细胞壁从两个相反的方向向内延伸，逐渐形成一个隔膜，直至2个子细胞被分割开，最终分裂形成2个子细胞。细菌完成一个完整生长周期所需的时间随种的不同而变化很大。这种变化除了主要由遗传特性决定外，还受诸多因子的影响，包括营养和环境条件等。在适宜的营养条件下，大肠杆菌完成一个周期仅需大约 20min，一些细菌甚至比这更快，但更多的比其要慢。第二节第二节 微生物的生长规律微生物的生长规律 （二）真菌的生长 酵母菌主要是通过出芽方式繁殖，少数酵母也可以通过分裂或菌丝伸长来繁殖。观察图4-3，芽殖是子细胞在与母细胞大致相同时就从母细胞上分离。酵母的母细胞与子细胞
11、实际上可以识别，因为母细胞产生每个子细胞都会留下一个芽痕，因此酵母细胞的群体有一个连续变化的菌龄分布。第二节第二节 微生物的生长规律微生物的生长规律 （三）霉菌的生长 由图4-4可以看出，霉菌的生长特性是菌丝伸长与分支，从菌丝体的顶端通过细胞间的隔膜进行生长。菌丝体既可是长的和分散的，也可以是短的和高度分支的，或者是两者的混合形式。当霉菌生长在培养基表面时，菌丝体可以形成菌落；在深层培养时，菌丝体多数情况下形成菌丝团，也有分散的菌丝形式存在。第二节第二节 微生物的生长规律微生物的生长规律 二、微生物群体的生长规律二、微生物群体的生长规律 对微生物群体生长的研究表明，微生物的群体生长规律因其种类
12、不同而异，单细胞微生物与多细胞微生物的群体生长表现出不同的生长动力学特性。但就单细胞微生物而言，在特定的环境中，不同种的微生物表现出趋势相近的生长动力学规律。第二节第二节 微生物的生长规律微生物的生长规律 （一）细菌的生长曲线 如将少量细菌纯培养物接种入新鲜的液体培养基中，在适宜的条件下培养，定期取样测定单位体积培养基中的菌体（细胞）数，可发现开始时群体生长缓慢，后逐渐加快，进入一个生长速率相对稳定的高速生长阶段，随着培养时间的延长，生长达到一定阶段后，生长速率又表现为逐渐降低的趋势，随后出现一个细胞数目相对稳定的阶段，最后转入细胞衰老死亡期。如用坐标法作图，以培养时间为横坐标，以计数获得的细
13、胞数的对数为纵坐标，可得到一条定量描述液体培养基中微生物生长规律的实验曲线，该曲线则称为生长曲线（图4-5）。第二节第二节 微生物的生长规律微生物的生长规律第二节第二节 微生物的生长规律微生物的生长规律图 4-5 细菌生长曲线 从图4-5可见，生长曲线表现了细菌细胞及其群体在新的适宜的理化环境中，生长繁殖直至衰老死亡的动力学变化过程，细菌生长曲线可划分为四个时期，即：延滞期、指数生长期、稳定期、衰亡期。深入研究各种单细胞微生物生长曲线各个时期的特点与内在机制，在微生物学理论与应用实践上都有着十分重要的意义。第二节第二节 微生物的生长规律微生物的生长规律 1延滞期 又称迟缓期、适应期。细菌接种到
14、新鲜培养基而处于一个新的生长环境，因此在一段时间里并不马上分裂，细菌的数量维持恒定，或增加很少。此时细胞内的RNA、蛋白质等物质含量有所增加，细胞体最大，说明细菌并不是处于完全静止的状态。延滞期具有以下特点：a.生长速率常数等于零；b.细胞形态变大或增长，许多杆菌可长成长丝状；c.细胞内RNA尤其是rRNA含量增高，原生质呈嗜碱性；d.合成代谢活跃，核糖体、酶类和ATP合成加快，易产生诱导酶；e.对外界不良条件例如NaCl溶液浓度、温度和抗生素等化学药物的反应敏感；f.分裂迟缓、代谢活跃。第二节第二节 微生物的生长规律微生物的生长规律 延滞期所维持时间的长短，因微生物种或菌株和培养条件的不同而
15、异，实践表明延滞期可从几分钟到几小时、几天，甚至几个月不等；如大肠杆菌的延滞期就比分枝杆菌短得多。同一菌种或菌株，接种用的纯培养物所处的生长发育时期不同，延滞期的长短也不一样。如接种用的菌种都处于生理活跃时期，接种量适当加大，营养和环境条件适宜，延滞期将显著缩短，甚至直接进入指数生长期。第二节第二节 微生物的生长规律微生物的生长规律 2.指数生长期 又称对数生长期。细菌经过延滞期进入指数生长期，并以最大的速率生长和分裂，导致细菌数量呈指数增加，而且细菌内各成分按比例有规律地增加，此时期内的细菌生长是平衡生长。指数生长期的特点：a.生长速率常数最大，细胞每分裂一次所需的代时(G)或原生质增加一倍
16、所需的倍增时间较短；b.菌体的大小、形态、生理特征比较一致；c.酶系活跃，代谢旺盛；d.活菌数和总菌数接近。第二节第二节 微生物的生长规律微生物的生长规律 指数生长期中，细胞每分裂一次所需要的时间称为代时(G)，在一定时间内菌体细胞分裂次数愈多，代时愈短，则分裂速度愈快。指数生长期的生长速率受到环境条件（培养基的组成成分、培养温度、pH与渗透压等）的影响，也是特定条件下微生物菌株遗传特性的反映。总的来说，原核微生物细胞的生长速率要快于真核微生物细胞，形态较小的真核微生物要快于形态较大的真核微生物。不同种类的细菌，在同一生长条件下，代时不同；同一种细菌，在不同生长条件，代时也有差异。但是，在一定
17、条件下，各种细菌的代时是相对稳定的，有的 2030 min，有的几小时甚至几十小时（表4-1）。第二节第二节 微生物的生长规律微生物的生长规律第二节第二节 微生物的生长规律微生物的生长规律表 4-1 某些微生物的生长代时 处于指数生长期的细胞，由于代谢旺盛，生长迅速，代时稳定，个体形态、化学组成和生理特性等均较一致，因此，在微生物发酵生产中，常用指数期的菌体作种子，它可以缩短延滞期，从而缩短发酵周期，提高劳动生产率与经济效益。指数生长期的细胞也是研究微生物生长代谢与遗传调控等生物学基本特性的极好材料。第二节第二节 微生物的生长规律微生物的生长规律 3.稳定生长期 细胞的指数期生长不会是无限期的
18、，一方面培养基中必要营养成分的耗尽或其浓度不能满足维持指数生长的需要而成为生长限制因子；另一方面细胞的排出物在培养基中的大量积累，以致抑制菌体生长。由上述两方面主要因素所造成的细胞内外理化环境的改变，营养物质消耗，代谢产物积累、氧化还原电位的变化和pH等一些因子的综合作用，导致细胞生长速率降低，新增细胞与逐步衰老死亡细胞在数量上逐渐趋于相对平衡状态，结束指数生长期。第二节第二节 微生物的生长规律微生物的生长规律 进入稳定生长期。稳定生长期的活细菌数最高并维持稳定。在稳定期，细胞的净数量不会发生较大波动，生长速率常数基本上等于零。此时细胞生长缓慢或停止，有的甚至衰亡，但细胞包括能量代谢和一系列其
19、他生化反应的许多功能仍在继续。稳定期的特点是：a.活菌数保持相对稳定，总菌数达最高水平；b.细菌代谢物积累达到最高峰；c.多数芽孢杆菌在这时开始形成芽孢；d.细胞开始储存糖原、异染颗粒和脂肪等贮藏物；e.有的微生物在稳定期时开始合成抗生素等次生代谢产物。第二节第二节 微生物的生长规律微生物的生长规律 4.衰亡期 一个达到稳定生长期的微生物群体，由于营养物质耗尽和有毒代谢产物的大量积累，群体中细胞死亡率逐渐上升，以致死亡菌数逐渐超过新生菌数，群体中活菌数下降，曲线下滑（图 4-5D），细菌死亡速率逐步增加和活细菌逐步减少，标志进入衰亡期。第二节第二节 微生物的生长规律微生物的生长规律 衰亡期具有
20、以下特点：a.细胞出现多形态、大小不等的畸形、衰退型；b.有的微生物因蛋白水解酶活力的增强会发生自溶；c.有的微生物在此时能产生或释放对人类有用的抗生素等次生代谢产物和胞内酶；在芽孢杆菌中，芽孢释放往往也发生在这一时期。微生物的生长曲线，反映一种微生物在一定的生活环境中(如试管、摇瓶、发酵罐)生长繁殖和死亡的规律。它既可作为营养物和环境因素对生长繁殖影响的理论研究指标，也可作为调控微生物生长代谢的依据，以指导微生物生产实践。第二节第二节 微生物的生长规律微生物的生长规律 （二）掌握微生物生长规律对工业生产的指导意义 1缩短延滞期 微生物经接种后会进入延滞期。在微生物发酵工业中，如果有较长的延滞
21、期，则会导致发酵设备的利用率降低、能耗、水耗增加、产品生产成本上升，最终造成劳动生产力低下与经济效益下降。只有缩短延滞期才有可能缩短发酵周期，提高经济效益。因此深入了解延滞期的形成机制，可为缩短延滞期提供指导实践的理论基础，这对于工业生产及其应用等均有极为重要的意义。第二节第二节 微生物的生长规律微生物的生长规律 因此，在微生物应用实践中，通常可采取处于快速生长繁殖中的健壮菌种细胞接种、适当增加接种量、采用营养丰富的培养基、培养种子与下一步培养用的两种培养基的营养养成分以及培养的其他理化条件尽可能保持一致等措施，来有效地缩短延滞期。第二节第二节 微生物的生长规律微生物的生长规律 2把握对数期
22、通过对微生物生长曲线的分析，可见：a.微生物在对数生长期生长速率最快；b.营养物的消耗，代谢产物的积累，以及因此引起的培养条件的变化，是限制培养液中微生物继续快速增殖的主要原因；c.用生活力旺盛的对数生长期细胞接种，可以缩短延滞期，加速进入对数生长期；d.补充营养物，调节因生长而改变了环境 pH、氧化还原电位，排除培养环境中的有害代谢产物，可延长对数生长期，提高培养液菌体浓度与有用代谢产物的产量；e.对数生长期以菌体生长为主，稳定生长期以代谢产物合成与积累为主。根据发酵目的的不同，确定在微生物发酵的不同时期进行收获。微生物生长曲线可以用于指导微生物发酵工程中的工艺条件优化以获得最大的经济效益。
23、第二节第二节 微生物的生长规律微生物的生长规律 3.延长稳定期 稳定生长期活菌数达到最高水平，如果为了获得大量活菌体，就应在此阶段收获，该时期是生产收获期。在稳定期，代谢产物的积累开始增多，逐渐趋向高峰。某些产抗生素的微生物，在稳定期后期大量形成抗生素。稳定期的长短与菌种和外界环境条件有关。生产上常常通过补料，调节 pH，调整温度等措施来延长稳定生长期，以积累更多的代谢产物。4.监控衰亡期 微生物在衰亡期，细胞活力明显下降，同时由于逐渐积累的代谢毒物可能会与代谢产物起某种反应或影响提纯，或使其分解。因此必须掌握时间，在适当时间结束发酵。第二节第二节 微生物的生长规律微生物的生长规律 生长是微生
24、物同环境相互作用的结果。在液体培养中生长曲线是在正常培养条件下，反映微生物接种后的培养过程中菌数变化同培养时间之间的关系。微生物在培养过程中，环境的变化会对微生物生长产生很大的影响。一、物理因素对微生物生长的影响 影响微生物生长的主要物理因素有营养物质、水的活性、温度、表面张力等。第三节第三节 影响微生物生长的因素影响微生物生长的因素 （一）营养物质 营养物质不足导致微生物生长所需要的能量、碳源、氮源、无机盐等成分不足，此时机体一方面降低或停止细胞物质合成，避免能量的消耗，或者通过诱导合成特定的运输系统，充分吸收环境中微量的营养物质以维持机体的生存；另一方面机体对胞内某些非必要成分或失效的成分
25、进行降解以重新利用，这些非必需成分是指胞内储存的物质、无意义的蛋白质与酶、mRNA等。例如在氮、碳源缺乏时，机体内蛋白质降解速率比正常条件下的细胞增加了7倍，同时减少tRNA合成和降低DNA复制的速率，导致生长停止。第三节第三节 影响微生物生长的因素影响微生物生长的因素 （二）水的活性 水是机体中的重要组成成分，它是一种起着溶剂和运输介质作用的物质，参与机体内水解、缩合、氧化与还原等反应在内的整个化学反应，并在维持蛋白质等大分子物质稳定的天然状态方面起着重要作用。微生物在生长过程中，对培养基的水活度（aw）有一定的要求，每种微生物生长都有最适的aw，高于或低于所要求的aw值，都会通过影响培养基
26、的渗透压力变化而影响微生物的生长速率。微生物不同，生长所需要的最适aw值也不同。第三节第三节 影响微生物生长的因素影响微生物生长的因素 （三）温度 温度是影响微生物生长的重要因素。温度主要通过影响微生物细胞膜的流动性和生物大分子的活性来影响生物的生命活动。随着温度的升高，细胞内酶促反应速度加快，代谢和生长也相应加快。同时，温度增高易导致细胞内各种活性物质变性，细胞功能下降，甚至导致细胞死亡。所以，细胞都有三种基本温度：最低生长温度、最适生长温度、最高生长温度。微生物进行生长繁殖的最低温度界限称为最低生长温度，低于此温度微生物不会生长。使微生物生长速率最高的温度叫最适生长温度，不同微生物的最适生
27、长温度不同。微生物生长繁殖的最高温度界限叫最高生长温度，超过这个温度能够引起细胞的成分不可逆失活而导致细胞死亡。第三节第三节 影响微生物生长的因素影响微生物生长的因素 不同微生物的最适生长温度差异很大，根据微生物生长的最适温度不同，可以将微生物分为低温微生物、中温微生物、高温微生物等类型，它们都有各自的最低、最适和最高生长温度范围。图4-6中表示出温度对微生物生长速率影响的规律。温度的变化都会对每种类型微生物的代谢过程产生影响，通过改变它们的生长速率,以适应温度的变化而生存。第三节第三节 影响微生物生长的因素影响微生物生长的因素第三节第三节 影响微生物生长的因素影响微生物生长的因素图4-6 温
28、度对微生物生长速率影响的规律第三节第三节 影响微生物生长的因素影响微生物生长的因素 1低温型微生物 又称嗜冷微生物，能在0下生长，大多分布在地球的两极地区和海洋深处，还有的分布在冷泉。可分为专性嗜冷和兼性嗜冷两种。专性嗜冷微生物的最适生长温度为15左右，最高生长温度为20，最低生长温度为0或者更低。兼性嗜冷微生物生长的温度范围较广，但是最适温度仍然以20左右为好，最高生长温度为35左右。第三节第三节 影响微生物生长的因素影响微生物生长的因素 根据研究，嗜冷微生物能在低温下生长主要是由于嗜冷微生物的酶在低温下能更有效地起催化作用，而温度达3040时会使酶失去活性。嗜冷微生物的细胞膜含不饱和脂肪酸
29、较高，能在低温下保持膜的通透性，有利于微生物的生长。2中温微生物 又称嗜温微生物，绝大多数微生物属于这一类。其最适生长温度为2040，最低生长温度为1020，最高生长温度为4050。土壤、植物、温血动物及人体中的微生物大部分属于这一类。它们又可分为室温性微生物和体温性微生物。嗜温性微生物的生长速率高于嗜冷性微生物，嗜温性微生物的最低生长温度不能低于10，低于10蛋白质合成过程不能启动，许多酶功能受到抑制，使生长受到抑制。第三节第三节 影响微生物生长的因素影响微生物生长的因素 3高温型微生物 又称嗜热型微生物，它们适宜在4550以上的温度中生长（低于3040便不能繁殖）。这类微生物主要分布在温泉
30、、堆肥堆、发酵饲料、日照充足的土壤表面等腐烂有机物中。例如部分芽孢杆菌、高温放线菌属等都是能在5570中生长的类群。有的细菌可在近100的高温中生长。第三节第三节 影响微生物生长的因素影响微生物生长的因素 高温型微生物能在较高的温度下生长，可能是由于菌体内的酶和蛋白质比中温型微生物更能抗热，尤其蛋白质对热更稳定；它们产生多胺、热亚胺和高温精胺可以稳定细胞中与蛋白质合成有关的结构和保护大分子免受高温的损害；高温型微生物的核酸也有保证热稳定性的结构；高温型微生物的细胞膜中含有较多的饱和脂肪酸和直链脂肪酸，能在高温下调节膜的流动性而维持膜的功能。第三节第三节 影响微生物生长的因素影响微生物生长的因素
31、 高温型微生物的生长速率快，合成大分子物质迅速，可以及时弥补由热破坏掉的大分子物质。耐高温的微生物一方面给罐头工业、发酵工业带来麻烦，另一方面在一些发酵工业，废物处理等方面应用高温型微生物，可以节省能源和控制温度方面的费用。第三节第三节 影响微生物生长的因素影响微生物生长的因素第三节第三节 影响微生物生长的因素影响微生物生长的因素表4-2 微生物的生长温度类型 （四）表面张力 液体表面有种尽可能缩小表面积的力称为表面张力。液体培养基的表面张力与微生物的形态、生长、繁殖有着密切的关系。常温下，纯水的表面张力为7.210-4Nm，而一般液体培养基的表面张力为4.510-46.510-4Ncm，多数
32、微生物在这个表面张力下能正常生长，如将表面张力降低至4.0l0-4Ncm以下，就会影响微生物的形态、生长和繁殖。一些无机盐可以增强溶液的表面张力，如矿泉水的表面张力比较大。许多有机酸、蛋白质、肥皂、多肽和醇等都能降低溶液的表面张力。第三节第三节 影响微生物生长的因素影响微生物生长的因素 凡能改变液体表面张力的物质称为表面活性剂，它们可分为阳离子型、阴离子型和非离子型三类。表面活性剂加入培养基中，可影响微生物细胞的生长和分裂。阴离子表面活性剂有肥皂、十二烷基磺酸钠(SDS)等，其中肥皂是生活中常用的表面活性剂，具有一定的杀菌效力，但比较弱，对肺炎球菌、革兰氏阴性菌、细菌芽孢、结核分枝杆菌无效。一
33、般认为，肥皂的作用是机械除菌，微生物附着于肥皂泡沫中被水冲洗掉。第三节第三节 影响微生物生长的因素影响微生物生长的因素 阳离子表面活性剂主要有季铵盐类化合物等。这类表面活性剂有明显的抗菌活性，即使在高度稀释的情况下仍有广谱杀菌作用，包括对革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌、真菌、病毒等的杀菌活性。其作用机制可能有3个方面：a.降低表面张力，便于机械除菌；b.抑制酶，使蛋白质变性；c.破坏细胞膜，造成渗漏。季铵盐类表面活性剂兼有杀菌和清洁的作用，并且使用时不受温度影响，低气味、无毒、无腐蚀性、穿透力好，因此在皮肤消毒、食品加工等方面作为卫生消毒剂，应用十分广泛。常用的季铵盐类化合物有洁尔灭、新洁尔灭
34、、杜灭芬等。第三节第三节 影响微生物生长的因素影响微生物生长的因素 一些高分子化合物，如聚醛类表面活性剂，是非离子型表面活性剂。这类表面活性剂不电离，也没有抑菌活性，主要为乳化作用。发酵工业中常用表面活性剂作为消泡剂以消除泡沫，防止发酵罐因泡沫过多而发生跑液。过去常用植物油作消泡剂，近年来，已经采用消泡效果更好的聚醚类表面活性剂代替植物油。表面活性剂的另一主要用途是改变细胞膜的通透性，使胞内合成的代谢产物能够顺利排到胞外。这样，一方面降低了发酵产物在胞内的浓度，固而减小了产物抑制；另方面则有利于提高发酵产物的产量并简化产物的分离提取。第三节第三节 影响微生物生长的因素影响微生物生长的因素 （五
35、）氧气 氧对微生物的影响很大。根据微生物和氧的关系，可将微生物分为五类（表4-4）：第三节第三节 影响微生物生长的因素影响微生物生长的因素表4-3 五类微生物与氧气的关系 1专性好氧微生物 专性好氧微生物必须在有氧条件下生长，有完整的呼吸链，以氧气为最终电子受体，细胞内含超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶。多数细菌和大多数真菌属于专性好氧微生物。第三节第三节 影响微生物生长的因素影响微生物生长的因素 2兼性好氧微生物 兼性好氧微生物在有氧和无氧的条件下都能生长，但在这两种情况下代谢途径并不相同，它们在有氧的时候进行有氧呼吸，在无氧的情况下进行酵解或无氧呼吸，其产物也各不相同，例如谷氨酸发酵时
36、，通气量充足产谷氨酸，通气量不足则产生乳酸或琥珀酸。兼性好氧微生物的细胞内也含有SOD和过氧化物酶。许多酵母菌和细菌属于兼性好氧微生物，如酵母菌、肠杆菌科的细菌等。第三节第三节 影响微生物生长的因素影响微生物生长的因素 3微好氧微生物 微好氧微生物在有氧和绝对无氧条件下均不能生长。只能在较低的氧分压下生活，一些氢单胞菌属、发酵单胞菌属和弯曲菌属的种及霍乱弧菌属于这一类。4专性厌氧微生物 专性厌氧微生物不能利用氧气，氧气的存在对它们的生存能造成损害，即使短时接触空气，生长也会被抑制甚至致死。专性厌氧微生物经过酵解、无氧呼吸或循环光合磷酸化等获取能量。细胞内缺乏SOD和细胞色素氧化酶，大多数还缺少
37、过氧化氢酶。梭状芽孢杆菌属、甲烷杆菌属、链球菌属中的一些种都属于此类菌。5耐氧微生物 耐氧微生物不能利用氧气，但氧气的存在对它们无害，它们没有呼吸链，只能通过酵解获取能量，细胞内存过氧化物酶，但缺乏过氧化氢酶，多数乳酸菌都是耐氧微生物。第三节第三节 影响微生物生长的因素影响微生物生长的因素 二、化学因子对微生物生长的影响 1氢离子浓度对微生物生长的影响 微生物生长过程中机体内发生的绝大多数的反应是酶促反应，而酶促反应都有一个最适pH范围，在此范围内只要条件适合，酶促反应速率最高，微生物生长速率最大，因此微生物生长也有一个最适生长的pH范围。此外微生物生长还有一个最低与最高的pH范围，低于或高出
38、这个范围，微生物的生长就被抑制，微生物类型不同，其生长的最适、最低与最高的pH范围也不同（表4-4）。第三节第三节 影响微生物生长的因素影响微生物生长的因素第三节第三节 影响微生物生长的因素影响微生物生长的因素表 4-4 不同微生物对氢离子浓度的适应范围 pH通过影响细胞质膜的透性、膜结构的稳定性和物质的溶解性或电离性来影响营养物质的吸收，从而影响微生物的生长速率。质子是一种唯一不带电子的阳离子，它在溶液里能迅速地与水结合成水合氢离子(H3O+等)。在偏碱性条件下，OH-占优势，水合氢离子和OH-对营养物质的溶解度和离解状态，细胞表面电荷平衡和细胞的胶体性质等方面均会产生重大影响。在酸性条件下
39、H+可以与营养物质结合，并能从可交换的结合物或细胞表面置换出某些阳离子，从而影响细胞结构的稳定性。同时由于pH 较低，CO2溶解度降低，某些金属离子如Mn2+、Ca2+、Mo2+等溶解度增加，导致它们在溶液中的浓度增加，从而对机体产生不利的作用。第三节第三节 影响微生物生长的因素影响微生物生长的因素 2.重金属及其化合物 重金属及其化合物都有杀菌作用，重金属离子带正电，容易与带负电的菌体蛋白质结合使其凝固变性，或者进入细胞使酶失活。重金属盐类是蛋白质的沉淀剂，能产生抗代谢作用，或者与细胞内的主要代谢产物发生螯合作用，使正常的代谢物失效，抑制微生物生长或致其死亡。第三节第三节 影响微生物生长的因
40、素影响微生物生长的因素 3.卤素及其化合物 碘是强杀菌剂。3%7%碘溶于70%83%的乙醇中配制成碘酊，5%碘与10%碘化钾溶液都是有效的皮肤消毒剂。碘的杀菌机制是碘不可逆地与菌体蛋白质中的酪氨酸结合。氯气和次氯酸钙常用于饮用水消毒。其杀菌机制是氯与水结合产生次氯酸，次氯酸易分解产生新生态氧，它的杀菌力较强。第三节第三节 影响微生物生长的因素影响微生物生长的因素 4.有机化合物 酚、醇、醛是常用的杀菌剂。低浓度的酚可以破坏细胞膜组分，高浓度的酚凝固菌体蛋白。酚还能破坏结合在膜上的氧化酶与脱氢酶，使细胞迅速死亡。醇是脱水剂，也是脂溶剂。它能使蛋白质脱水死亡，损害细胞膜而具有杀菌力。醛类的作用主要
41、使蛋白质烷基化，改变酶或者蛋白质的活性，使菌的生长受到抑制或死亡。第三节第三节 影响微生物生长的因素影响微生物生长的因素 一、微生物的纯培养技术一、微生物的纯培养技术 微生物在自然界中不仅分布很广，而且都是混杂地生活在一起。要想研究或利用某一种微生物，必须把它从混杂的微生物类群中分离出来，以得到只含有一种微生物的培养。微生物学中将在实验条件下，从一个细胞或同种细胞群繁殖得到的后代称为纯培养。纯培养的获得有下列几种方法，各种方法的优点及应用范围见表4-5。第四节第四节 微生物的培养微生物的培养 第四节第四节 微生物的培养微生物的培养 表4-5 微生物纯培养分离方法的比较 （一）平板划线分离法 用
42、接种环以无菌操作蘸取少许待分离的材料，在无菌平板表面进行平行划线、扇形划线或其他形式的连续划线，微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少，并逐步分散开来，如果划线适宜的话，微生物能一一分散，经培养后，可在平板表面得到单菌落。第四节第四节 微生物的培养微生物的培养 （二）稀释倒平板法 先将待分离的材料用无菌水做一系列的稀释（如1 10、1 100、1 1000、1 10000），然后分别取不同稀释液少许，与已溶化并冷却至45左右的琼脂培养基混合，摇匀后，倾入灭过菌的培养皿中，待琼脂凝固后，制成可能含菌的琼脂平板，保温培养一定时间即可长出菌落。如果稀释得当，在平板表面或琼脂培养基中就可出现分散的单
43、个菌落，这个菌落可能就是由一个细菌细胞繁殖形成的。随后挑取该单个菌落，或重复以上操作数次，便可得到纯培养。第四节第四节 微生物的培养微生物的培养 （三）单孢子或单细胞分离法 采取显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养，称为单细胞（单孢子）分离法。单细胞分离法的难度与细胞或个体的大小成反比，较大的微生物如藻类、原生动物较容易，个体较小的细菌则较难。在显微镜下使用单孢子分离器进行机械操作，挑取单孢子或单细胞进行培养。也可以采用特制的毛细管在载玻片的琼脂涂层上选取单孢子并切割下来，然后移到合适的培养基上进行培养。单细胞分离法对操作技术有比较高的要求，多限于高度专业化的科
44、学研究中采用。第四节第四节 微生物的培养微生物的培养 （四）利用选择性培养基分离法 各种微生物对不同的化学试剂、染料、抗生素等具有不同的抵抗能力，利用这些特性可配制合适某种微生物而限制其他微生物生长的选择培养基，用它来培养微生物以获得纯培养。另外，还可以将样品预处理，消除不希望分离到的微生物。如加温杀死营养菌体而保留芽孢，过滤去除丝状菌体而保留单孢子。第四节第四节 微生物的培养微生物的培养 二、工业规模的微生物培养 将微生物置于一定容积的培养基中，经过培养生长，最后一次收获，此称分批培养。通过对细菌纯培养生长曲线的分析可知，在分批培养中，培养料一次加入，不予补充和更换。随着微生物的活跃生长，培
45、养基中营养物质逐渐消耗，有害代谢产物不断积累，故细菌的对数期不可能长时间维持。如果在培养器中不断补充新鲜营养物质，并及时不断地以同样速度排出培养物(包括菌体及代谢产物)，从理论上讲，对数生长期就可无限延长。只要培养液的流动量能使分裂繁殖增加的新菌数相当于流出的老菌数，就可保证培养器中总菌量基本不变，此种方法就叫连续培养法。此法已成为当前发酵工业的发展方向。第四节第四节 微生物的培养微生物的培养 最简单的连续发酵装置包括：培养室、无菌培养基容器以及可自动调节流速(培养基流入，培养物流出)的控制系统，必要时还装有通气、搅拌设备。控制连续培养的方法主要有两类：恒浊连续培养与恒化连续培养（表4-7）。
46、第四节第四节 微生物的培养微生物的培养 第四节第四节 微生物的培养微生物的培养 图4-7 连续培养装置示意图A恒浊培养系统；B恒化培养系统1盛无菌培养基的容器；2控制流速阀；3培养室；4排出管；5光源；6光电池；7流出物 （一）恒浊连续培养 不断调节流速而使细菌培养液浊度保持恒定的连续培养方法叫恒浊连续培养(图4-7A)。在恒浊连续培养中装有浊度计，借光电池检测培养室中的浊度(即菌液浓度)，并根据光电效应产生的电信号的强弱变化，自动调节新鲜培养基流入和培养物流出培养室的流速。当培养室中浊度超过预期数值时，流速加快，浊度降低；反之，流速减慢，浊度增加，以此来维持培养物的某一恒定浊度。如果所用培养
47、基中有过量的必需营养物，就可使菌体维持最高的生长速率。恒浊连续培养中，细菌生长速率不仅受流速的控制，也与菌种种类、培养基成分以及培养条件有关。恒浊连续培养可以不断提供具有一定生理状态的细胞，得到以最高生长速率进行生长的培养物，从而具有较好的经济效益。第四节第四节 微生物的培养微生物的培养 （二）恒化连续培养 控制恒定的流速，使由于细菌生长而耗去的营养及时得到补充，培养室中营养物浓度基本恒定，从而保持细菌的恒定生长速率，故称恒化连续培养，又叫恒组成连续培养(图4-7B)。已知营养物浓度对生长有影响，但营养物浓度高时并不影响微生物的生长速率，只有在营养物浓度低时才影响生长速率，而且在一定的范围内，
48、生长速率与营养物的浓度成正相关，营养物浓度愈高，则生长速率也高。第四节第四节 微生物的培养微生物的培养 恒化连续培养的培养基成分中，必须将某种必需的营养物质控制在较低的浓度，以作为限制因子，而其他营养物均为过量，这样，细菌的生长速率将取决于限制性因子的浓度(图4-8)。随着细菌的生长，限制因子的浓度降低，致使细菌生长速率受到限制，但同时通过自动控制系统来保持限制因子的恒定流速，不断予以补充，就能使细菌保持恒定的生长速率。用不同浓度的限制性营养物进行恒化连续培养，可以得到不同生长速率的培养物。第四节第四节 微生物的培养微生物的培养 第四节第四节 微生物的培养微生物的培养 图4-8 营养物浓度对生
49、长速率的影响 能作为恒化连续培养限制因子的物质很多。这些物质必须是机体生长所必需的，在一定浓度范围内能决定该机体生长速率的。常用的限制性营养物质有作为氮源的氨、氨基酸；作为碳源的葡萄糖、麦芽糖、乳酸；以及生长因子，无机盐等。第四节第四节 微生物的培养微生物的培养 表4-7 恒浊器连续培养与恒化器连续培养的比较第四节第四节 微生物的培养微生物的培养 （三）连续培养的应用 连续培养如用于生产实践上，就称为连续发酵，连续发酵与单批发酵相比有许多优点：a.高效，它简化了装料、灭菌、生产时间和提高了设备的利用率；b.自控，便于利用各种仪表进行自动控制；c.产品质量较稳定；d.节约了大量动力、人力等资源。
50、连续培养或连续发酵也有其缺点。最主要的是菌种易于退化，其次易遭杂菌污染，此外营养的利用率一般亦低于单批培养。在生产实践上，连续培养技术已广泛用于酵母菌体的生产，乙醇、乳酸和丙酮-丁醇等发酵。以及用假丝酵母进行石油脱蜡或是污水处理中。第四节第四节 微生物的培养微生物的培养 在微生物研究或生产实践中，常需要控制微生物的生长速率并杀灭不需要的微生物。影响微生物生长的因素都可以控制微生物生长，包括加热、低温、干燥、辐射、过滤等物理方法和消毒剂、防腐剂和化学治疗剂等化学方法两大类。对微生物生长控制采用的方法不同，产生的效果也不同。利用强烈的理化因素杀死物体中所有微生物的措施称为灭菌。采用温和的理化手段杀
