1、生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验 主讲：王丹主讲：王丹 生物技术实验室生物技术实验室 2015.9.14 实验基本操作与蛋白质化学实验基本操作与蛋白质化学 授课内容安排 序号 实验项目名称 学时分配 实验 类型 1 实验基本操作与蛋白质化学 3 理论 2 综合性实验（一）蛋白质化学酪蛋白的制备 3 综合 3 综合性实验（一）蛋白质化学双缩脲法测定蛋白质含量 3 综合 4 综合性实验（一）蛋白质化学考马斯亮蓝法测蛋白质含量 3 综合 5 综合性实验（一）蛋白质化学蛋白质电泳技术及血浆蛋白电泳 3 综合 6 血糖的测定 3 验证 7 谷丙转氨酶活力测定 3 验证 8 肝脏DNA提取
2、 3 验证 9 DNA含量测定 3 验证 10 综合性实验（二）分子生物学质粒DNA提取 3 综合 11 综合性实验（二）分子生物学PCR实验 3 综合 12 综合性实验（二）分子生物学琼脂糖凝胶电泳 3 综合 13 综合性实验（三）分子生物学HBV病毒实时荧光定量PCR 3 综合 14 实验设计的原则与方法(一) 3 自主 15 实验设计的原则与方法(二) 3 自主 总计 45 主要内容 生化与分子生物学实验发展史 实验室的规则制度 实验仪器使用 实验基本操作 蛋白质化学 19201920年代：年代： 微量分析技术导致了维生素、激素和辅酶等的发现。 瑞典著名的化学家T.Svedberg奠基了
3、“超离心技术的理论基础， 1924年制成了第一台5000 RCF的离心机（5000 r/min-8000 r/min， 相对离心力相对离心力“RCF”的单位可表示为“g”)，并准确测定了血红蛋 白等复杂蛋白质的分子量，获得了1926年的诺贝尔化学奖。 一、生物化学与分子生物学实验发展史一、生物化学与分子生物学实验发展史 19301930年代年代： 电子显微镜技术打开了微观世界，使我们能够看 到细胞内的结构和某些生物大分子的大致结构。 Folin-Wu 血糖测定方法：美国哈佛大学的Folin教授和中国的吴宪吴宪教授建立 的通过比色定量分析血糖的检测方法，源自其1919 年的“血液系统分析法” 博
4、士论文。 历史性：20世纪20年代以前，测验血中的非蛋白氮组分对病人来说是个沉重 的负担，例如仅一次尿酸测定就需耗血25毫升。 而福林吴的新方法，制备出无蛋白质的血液 只需10毫升就足以进行包括尿素、肌氨酸、肌 氨酸酐、尿酸和糖的测定（其中只需一滴血就 能测定血糖）。 19301930年代年代： 电子显微镜技术打开了微观世界，使我们能够看到细 胞内的结构和某些生物大分子的大致结构。 英藉德裔生物化学家Krebs，在1937年发现了三羧酸循环，对 细胞代谢及分子生物学的研究作出了重要贡献，他与美藉德裔 生物化学家Lipmann共获1953年诺贝尔生理医学奖。 19401940年代年代： 两位英国
5、科学家Martin和Synge发明了分配色谱（层析）， 他们获得了1952年的诺贝尔化学奖。由此，层析技术成为分离 生化物质的关键技术。 电泳技术由瑞典的著名科学家Tisellius奠基，从而开创了 电泳技术的新时代，他因此获得了1948年的诺贝尔化学奖。 小结：层析技术和电泳技术用于分析生物大分子的组成 和代谢的中间产物，示踪技术的应用推动了代谢的研究。 美国化学家Pauling确认氢键在蛋白质空间结构中以及生物 大分子间相互作用的重要性等，并因此而获得了诺贝尔化学奖。 19501950年代年代： 1953年美国科学家Watson和英国科学家Crick提出DNA分子反向平 行双螺旋模型，19
6、62年与英国科学家Wilkins分享诺贝尔生理医学 奖。 英国物理学家Perutz对血红蛋白血红蛋白的结构进行X-射线结构分析, Kendrew测定了肌红蛋白肌红蛋白结构，成为研究生物大分子立体结构先驱， 获1962年诺贝尔化学奖。 英国生物化学家Sanger于1953年确定牛胰岛素中氨基酸顺序牛胰岛素中氨基酸顺序而获 得1958年诺贝尔化学奖。 Kornberg发现了DNA聚合酶，美藉西班牙裔科学家Uchoa发现了 细菌的多核苷酸磷酸化酶，研究并重建了将基因内遗传信息通过 RNARNA中间体翻译成蛋白质的过程中间体翻译成蛋白质的过程。两人分享了1959年诺贝尔生理医 学奖。 19601960
7、年代年代： 1968-1972年Anfinsen创建了亲和层析技术，开辟了层析技术的 新领域。1969年Weber应用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术测定了蛋 白质的相对分子质量，使电泳技术取得了重大进展。 美国生物化学家Nirenberg在破译遗传密码方面作出了重要贡献， Holly阐明了酵母丙氨酸tRNA的核苷酸排列顺序，后来证明所有 tRNA的结构均相似。美藉印度裔生物化学家Khorana提出按预定的 序列合成核酸分子的方法。他们3人共获1969年诺贝尔生理医学奖。 法国生物学家Lwoff、JAcob和生物化学家Monod由于在病毒DNA和 mRNA等方面出色的大量研究工作而共获1965年
8、诺贝尔生理医学奖。 19701970年代年代： 基因工程技术取得了突破性的进展，Arber，Smith和Nathans 三个小组发现并纯化了限制性内切酶. 1972年，美国斯坦福大学的Berg等人首次用限制性内切酶切割了 DNA分子，并实现了DNA分子的重组。 1973年，又由美国斯坦福大学的Cohen等人第一次完成了DNA重组 体的转化技术，这一年被定为基因工程的诞生年，Cohen成为基 因工程的创始人，从此，生物化学进入了一个新的大发展时期。 各种仪器分析手段进一步发展，制成了DNA序列测定仪、DNA合成 仪等。 19801980年代年代 1980年，英国剑桥大学的生物化学家Sanger和
9、美国哈佛大学的 Gilbert分别设计出两种测定DNA核苷酸序列的方法，而与Berg共获诺贝 尔化学奖 1981年由Jorgenson和Lukacs首先提出的高效毛细管电泳技术 （HPCE），现已用于制备和下游技术。 1984年德国科学家Kohler、美国科学家Milstein和丹麦科学家Jerne由 于发展了单克隆抗体技术，完善了极微量蛋白质的检测技术而共享了诺 贝尔生理医学奖。 1985年美国加利福尼亚州Cetus公司的Mullis等发明了用PCR技术 （Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应扩增DNA的技术，对于 生物化学和分子生物学的研究工作具有划时代的意
10、义，因而与第一个设 计基因定点突变的Smith共享1993年的诺贝尔化学奖 1988年，美国遗传学家McClintock由于在二十世纪五十年代提出并发 现了可移动的遗传因子而获得诺贝尔生理医学奖。 1989年，美国科学家Altman和Cech由于发现某些RNA具有酶的功能 （称为核酶）而共享诺贝尔化学奖。 19901990年代：年代： 1993年，美国科学家Roberts和Sharp由于在断裂基因方面 的工作而荣获诺贝尔生理医学奖。 1994年，美国科学家Gilman和Rodbell由于发现了G蛋白在 细胞内信息传导中的作用而分享诺贝尔生理医学奖。 1995年，美国科学家Lewis、德国科学家
11、Nusslein-Volhard 和美国科学家Wieschaus由于在20世纪40-70年代先后独立鉴定 了控制果蝇体节发育基因而共享诺贝尔生理医学奖。 进入21世纪以来，PCR技术、生物芯片 技术不断完善，基因组学、蛋白质组学、生物 信息学发展迅速。 二、实验室的规章制度二、实验室的规章制度 实验室安全事故案例 19951995年年9 9月香港科技大学化学系大四学月香港科技大学化学系大四学 生梁同学因吸入别的同学泼洒的酸酐而生梁同学因吸入别的同学泼洒的酸酐而 不治身亡。不治身亡。 19971997年香港科技大学物理系访问学者因年香港科技大学物理系访问学者因 未按规定使用通风橱造成他人肺部伤害
12、未按规定使用通风橱造成他人肺部伤害 而永不被香港各大学录用。而永不被香港各大学录用。 事故原因分类分析 天灾天灾 占占2 人为因素人为因素 占占98% 不安全行为不安全行为 不安全环境不安全环境 凡不知、不顾、不凡不知、不顾、不 理、不能、粗心、理、不能、粗心、 迟钝、迟钝、 疲劳、失疲劳、失 檢、情绪各种内在檢、情绪各种内在 外在的行为外在的行为 工作场所中，工作工作场所中，工作 环境、设备设施对环境、设备设施对 人所产生之危险因人所产生之危险因 素素 实验室常用的安全警示标示实验室常用的安全警示标示 常用试剂的危害及防护 无色液体，有芳香气味，易挥发。用来制造、染料、塑料和药物。属低 毒类
13、，对皮肤和黏膜有刺激作用，高浓度有麻醉作用。神经系统会受损 害，还会使肾和肝受时性损伤。 易燃，有爆炸危险。属于甲类防火危险物质。用二氧化碳或干粉或泡沫 灭火剂，不宜用水。 眼睛接触：蒸气会刺激眼睛，液体导致严重刺激，发红肿胀和灼伤。通 常影响是暂时性的。皮肤接触：产生灼伤感、干燥。可以用微温的缓慢 流水冲洗至少20分钟，用无摩擦性的肥皂有助于从皮肤上洗去二甲苯。 二甲苯 三氯甲烷 无色透明易挥发液体，有特殊的香甜气味。 沸点：61.2，医药上用作麻醉剂。也用作萃取剂和溶剂。 有很强的麻醉作用，在光的作用下，能被空气中的氧反应生成氯化氢 和剧毒的光气。通常加入12%乙醇，使生成的光气与乙醇作用
14、而生 成碳酸乙酯，以消除其毒性。 吸入高浓度蒸汽时，开始刺激眼、口腔、鼻孔粘摸，发生流泪、感觉 麻醉、呕吐、痉挛、直到昏睡、不省人事。 在空气、水分和光的作用下，酸度增加，因而对金属有强烈的腐蚀性 常用试剂的危害及防护 乙 醚 透明、无色、易挥发有芳香刺激性气味的液体。沸点：34.6；对人体 有麻醉性能。当吸入含量为3.5%时，3040分钟就可失去知觉。人体过量 吸入，会引起严重的急性中毒。呼气中带醚味，并出现呕吐、出汗、喷 嚏、咳嗽、头痛、记忆力减退、无力、兴奋。 微溶于水，易溶于盐酸，能与醇、醚、石油醚、苯、氯仿等有机溶剂混 溶。应储存于阴凉、干燥、通风的低温库房内，库温最好控制在25以
15、下。远离热源、火种，避免阳光直射。 易燃，与强氧化剂反应能起火爆炸。在空气中与氧长期接触或受光照会 生成不稳定的过氧化物，受热能自行着火爆炸。着火时，可用干粉、泡 沫、二氧化碳、沙土灭火。用水灭火无效，但可用水保持火场容器冷却。 常用试剂的危害及防护 乙 醇 无色有酒味，易挥发的澄清液体。沸点78.5：用于溶剂、清洗剂、 分析试剂等。属微毒类，对眼睛黏膜有轻微刺激作用。 乙醇可使皮肤发干，长期受大剂量作用时，可使神经系统、消化器官 等发生严重的器质性疾病。 易燃，手热或遇明火有燃烧爆炸危险，燃烧时，发出兰色火焰。蒸气 能与空气形成爆炸性混合物，在火场中，受热的容器有爆炸的危险。 着火时，用二氧
16、化碳、雾状水、干粉、1211或抗泡沫灭火。用水冷却 火场中的容器，驱散蒸气，赶出溢出液体，使其稀释成为不燃性混合 物 常用试剂的危害及防护 冰 醋 酸 有酸性气味的无色透明液体，沸点：118.1。用于制造氯乙烯塑料、醋 酐、有机醋酸酯、醋酸盐（铅、铝、铜等）及醋酸纤维；也可用于染料、 制药、罐头食品、食品防腐、色素生产等工业。 属低毒类，可经消化道、呼吸道、皮肤吸收，对眼、皮肤和上呼吸道有刺 激作用。眼睛接触：引起眼睑水肿、结膜充血；皮肤接触：轻者出现红斑， 重者出现化学灼伤，有水泡和疼痛。 吸入：当空气中蒸气浓度不明时，应佩带有黄色色标滤毒盒（罐）的防毒 面具。使用时应有良好的通风条件和有效
17、的防护用品，如有醋酸的泄露或 溅污，应以碱液中和，然后用水冲洗，经稀释的污水排入废水系统。 常用试剂的危害及防护 盐 酸 透明或黄色冒烟液体，蒸气有强烈刺激味。易溶于水，用于油井活化 剂、矿石还原剂，食品处理剂、清洁剂、锅炉除垢剂及化学中间体。 对皮肤和黏膜有较强刺激腐蚀作用。眼睛接触：导致刺激、严重灼伤 和失明。皮肤接触：浓溶液（大于38%）导致严重灼伤。 与强碱类（如氢氧化钠）起激烈反应，与硫化物、磷化物、氰化物、 乙酯基化合物、氟化物、硅化物和碳化物起反应，释放出易燃和有毒 的气体，与氧化剂（如过氧化物）能起激烈反应。 常用试剂的危害及防护 小小 结结 入室要求入室要求 试剂配制试剂配制
18、 值日规程值日规程 仪器使用仪器使用 三、实验仪器使用三、实验仪器使用 1 1、离心机、离心机 工作原理工作原理：利用机件旋转产生的离心力实现悬浮液、乳浊 液及其悬浮液及其他物料的分离或浓缩的机器。 按转速分：按转速分：低速离心机：少于6000r/min 高速离心机：低于25000r/min 超速离心机：超越30000r/min 温度控制：冷冻离心机（未经过培训） 普通离心机（按照操作要求进行） 1.离心前必须仔细检查仔细检查转头各孔内有无异物。 2.使用各种离心机时，必须事先在天平上精密地平衡离心管 和其内容物，平衡时重量平衡时重量之差不得超过各个离心机说明书上 所规定的范围。 3.每个转头
19、各有其最高允许转速和使用累积限时最高允许转速和使用累积限时，使用转头 时要查阅说明书，不得过速使用。每一转头都要有一份使用 档案，记录累积的使用时间，若超过了该转头的最高使用限 时，则须按规定降速使用。并使用后必须仔细检查转头，及 时清洗、擦干，搬动时要小心，不能碰撞，避免造成伤痕， 转头长时间不用时，要涂上一层上光腊保护。 离心机使用的注意事项离心机使用的注意事项 4.装载溶液时，根据待离心液体的性质及体积选用适合的离心选用适合的离心 管管，有的离心管无盖，液体不得装得过多，以防离心时甩出， 造成转头不平衡、生锈或被腐蚀，而制备性超速离心机的离心 管，则常常要求必须将液体装满，以免离心时塑料
20、离心管的上 部凹陷变形。严禁使用显著变形、损伤或老化的离心管。 5.离心过程中不得随意离开不得随意离开，应随时观察离心机上的仪表是否 正常工作，如有异常的声音应立即停机检查，及时排除故障。 6.当转速为0时，不准开盖，禁止用手指头逼停转头不准开盖，禁止用手指头逼停转头。 7.若要在低于室温低于室温的温度下离心时。转头在使用前应放置在冰 箱或置于离心机的转头室内预冷转头室内预冷。 离心机使用的注意事项离心机使用的注意事项 2 2、紫外可见光分光光度计、紫外可见光分光光度计 基本原理基本原理 Beer-Lambert 定律：当一束单色光通过溶液时，由于溶液吸收 了一部分光能，光的强度就会减弱。设入
21、射光的强度为I0，透过浓度为c， 液层厚度为b的溶液后，透射光的强度I必定小于I0，随浓度和厚度的增加， 光被吸收的程度亦增加，透射光的强度则减小。透射光强度与入射光强度 的比值，称为透光度(transmittance)，以T表示。实验证明，当液层厚度 b和溶液浓度c按算术级数增加时，透光度T按几何级数减小，数学式为： A A- -lgTlgTbcbc A：吸光度，又称光密度“O.D”； T：透光度， TI / I。； a：吸光系数（Lmol1cm1）；比例常数，称吸光系数 b：样品光程（cm），通常使用1.0cm 的吸收池，则b=1cm； c：样品浓度（mol/L）。 吸光度与液层厚度和溶液
22、浓度的乘积成正比，称为朗伯比尔定律， 简称比尔定律，即光的吸收定律。其数学表达式为：A=A=a abcbc 吸光度“A”有一个重要性质是其具有加和性： 即混合物的总吸光度等于溶液中的各组份各自在该波长下 吸光度的算术和。这是多元混合物分光光度法定量分析的基础。 若溶液中各溶质的吸光系数相同，则各溶质吸光度的大 小与溶质浓度成比例。 例：尿嘧啶核苷酸溶液用1cm石英吸收池测定 260nm的吸光 度为0.650，用同一吸收池测定纯溶剂的吸光度为0.070，已知 其摩尔吸光系数 = 8.2103 M-1cm，计算其摩尔浓度。 L）。 A AbC bC AA（溶剂加样品的吸光度）（溶剂的吸光度（溶剂加
23、样品的吸光度）（溶剂的吸光度） A A0.6500.6500.0700.0700.5800.580 b b1cm1cm C=7.1C=7.11010- -5 5 mol / Lmol / L 定性方法定性方法： 一系列不同波长的单色光照射待测溶液，可测 的一系列相应的吸光度。以吸光度为纵坐标，以波 长为横坐标作图，可以得到待测物质的吸收曲线。 通过与标准品比较而定性。 定量方法：定量方法： 1.1.吸光系数法（绝对法）：吸光系数法（绝对法）：根据比尔定律A= c l，若 l 和吸光系数或E1%1cm已知，即可根 据测得的A，求出被测物的浓度。通常或E1%1cm可 以在手册或文献中查到。C =
24、A / l 2. 标准曲线的制作标准曲线的制作 （1）配置一系列浓度不同的标准溶液。 （2）在测定条件相同的情况下，分别测定其吸光度。 （3）以标准溶液浓度为横坐标（不必考虑显色剂等引起的浓度变化）， 以相应的吸光度为纵坐标，绘制A-C关系图。 （4）在相同条件下测出样品溶液的吸光度，从标准曲线上查出浓度。 A C 0 Ax Cx 如如FolinFolin酚试剂法酚试剂法(Lowry(Lowry法法) )测定蛋白质测定蛋白质 含量含量 取14只试管分成两组，分别加入0，0.1， 0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL标准蛋白质溶液 (250 g/mL)，用水补足到1mL，加入5mL试剂甲，
25、 混匀，于20-25放置10分钟。再加入0.5mL试 剂乙(Folin氏试剂)，立即振摇均匀，在20-25 保温30分钟，然后于500nm处比色。取两组测定 的平均值，以蛋白质浓度为横坐标，光吸收值为 纵坐标，绘制标准曲线作为定量的依据 。横坐 标的蛋白质浓度分别为0，25，50，100，150， 200，250，单位为g/mL，不可将上述数字再除 以6.5，将数字变成一个小数。 要彻底清洗，尤其是盛过蛋白质等溶液，干后 形成一层膜，不易洗去，通常杯子不用时可放在 1洗洁净液中浸泡，去污效果好，使用时用水冲 洗干净，要求杯壁不挂水珠，还可以用绸布丝线 或软塑料制作一个小刷子清洗杯子。 严禁用手
26、指触摸透光面，因指纹不易洗净。严 禁用硬纸和布擦拭透光面，只能使用镜头纸和绸 布。 严禁加热烘烤。急用干的杯子时，可用酒精荡 洗后用冷风吹干。决不可用超声波清洗器清洗。 使用的注意事项使用的注意事项 3、微量移液器的使用、微量移液器的使用 设定移液体积设定移液体积 从大体积调节到小体积时，为正常调节方 法，逆时针旋转刻度即可； 从小体积调节至大体积时，可先顺时针调 至超过设定体积的刻度，再回调至设定体积， 这样可以保证最佳的精确度。 装配移液器吸头装配移液器吸头 单道移液器，将移液端垂直插入 吸头，左右微微转动，上紧即可。 多道移液器，将移液器的第一道对准第一个 吸头，倾斜插入，前后稍许摇动上
27、紧，吸头插入 后略超过O型环即可。 注意：注意：用移液器反复撞击吸头来上紧的方法是不可取 的，这样操作会导致移液器部件 因强烈撞击而松散， 严重的情况会导致调节刻度的旋钮卡住。 移液器的养护：移液器的养护： 1、如液体不小心进入活塞室应及时清除污染物； 2、移液器使用完毕后，把移液器量程调至最大值，且将移 液器垂直放置在移液器架上； 3、根据使用频率所有的移液器应定期用肥皂水清洗或用 60 的异丙醇消毒，再用双蒸水清洗并晾干； 4、避免放在温度较高处以防变形致漏液或不准； 5、发现问题及时找专业人员处理。 1、当移液器吸嘴有液体时切勿将移液器水平或倒置放置，以防 液体流入活塞室腐蚀移液器活塞；
28、 2、正确使用移液器吸液、排液，以达高精准度。 3、平时检查是否漏液的方法： 吸液后在液体中停 1-3 秒观察 吸头内液面是否下降；如果液面下降首先检查吸头是否有问题， 如有问题更换吸头，更换吸头后液面仍下降说明活塞组件有问 题，应找专业维修人员修理。 4、 需要高温消毒的移液器应首先查阅所使用的移液器是否适 合高温消毒后再行处理。 使用注意事项：使用注意事项： 四、实验基本操作四、实验基本操作 1、移液管操作 移液管的手持方法 取液 移液 操作细节 移液前应当把洗耳球内的空气尽量排尽，把洗耳球口 对准移液管后部 在吸取少量液体時要留心不要吸入空氣，以 免污染洗耳球 完成吸取后，尽快以手指代替
29、洗耳球阻塞移液管。 请用食指 移液管与试管倾斜45 液体体积读数 水浴加热水浴加热 哪个是正确的操作呢？哪个是正确的操作呢？ 滤纸的使用 五、蛋白质化学五、蛋白质化学 NH2-CH-C H O OH 甘甘氨氨酸酸 NH2-CH-C H O OH 甘甘氨氨酸酸 NH-CH-C H OH O O H 甘甘氨氨酸酸 + -HOH 甘氨酰甘氨酸甘氨酰甘氨酸 肽键肽键 NH2-CH-C-N-CH-C O OHHHH O NH2-CH-C-N-CH-C O OHHHH O 氨基酸的性质氨基酸的性质 ( (1 1) )酸碱性质和酸碱性质和等电点等电点 ( (2 2) )光学活性光学活性和和光谱性质光谱性质
30、( (3 3) )重要化学反应重要化学反应 与与2 2, ,4 4一二硝基氟苯一二硝基氟苯(DNFB)(DNFB)的反应的反应（sangersanger反应反应）: :用用 于蛋白质于蛋白质N N- -端测定端测定. . 与苯异硫氰酯与苯异硫氰酯（PITCPITC）的反应的反应（EdmanEdman反应反应）： 用于用于 蛋白蛋白N N- -端测定端测定，蛋白质顺序测定仪设计原理的依据蛋白质顺序测定仪设计原理的依据。 与茚三酮反应与茚三酮反应: :用于氨基酸定量定性测定用于氨基酸定量定性测定 成肽反应成肽反应：氨基酸合成肽的反应基础：氨基酸合成肽的反应基础 氨基酸的两性解离性质及等电点氨基酸的
31、两性解离性质及等电点（pI） pH = pI 净电荷净电荷=0 pH pI 净电荷为负净电荷为负 CH R COOH NH3+ CH R COO NH2 CH R COO NH3+ + H+ + OH- + H+ + OH- (pK 1) (pK 2) 当氨基酸溶液在某一定当氨基酸溶液在某一定pH值时值时，使某特定氨基酸分子上所带使某特定氨基酸分子上所带 正负电荷相等正负电荷相等，成为两性兼离子成为两性兼离子，在电场中既不向阳极也不向阴极在电场中既不向阳极也不向阴极 移动移动，此时溶液的此时溶液的pH值即为该氨基酸的值即为该氨基酸的等电点等电点(isoelctric point)。 甘甘 氨氨
32、 酸酸 滴滴 定定 曲曲 线线 甘氨酸盐酸盐（甘氨酸盐酸盐（A+） 等电点甘氨酸（等电点甘氨酸（A ） 甘氨酸钠（甘氨酸钠（A-） 一氨基一羧基一氨基一羧基AA的的 等电点计算：等电点计算： pI= 2 pK 1+pK 2 谷氨酸（谷氨酸（A）和赖氨酸（）和赖氨酸（B）滴定曲线和等电点计算）滴定曲线和等电点计算 一氨基二羧基一氨基二羧基AA的的 等电点计算：等电点计算： pI= 2 pK 1+pK 2 二氨基一羧基二氨基一羧基AA的的 等电点计算：等电点计算： pI= 2 pK 2+pK 3 B A pK1 pK2 pI pI pK3 pK3 pK2 pK1 加入的加入的OH-mL数数 加入的
33、加入的OH-mL数数 pH pH 氨基酸光学活性和光谱性质氨基酸光学活性和光谱性质 1、旋光性旋光性：除：除甘氨酸甘氨酸外，所有天然外，所有天然-氨基酸都有不对称碳原子，因此所有天氨基酸都有不对称碳原子，因此所有天 然氨基酸都具有旋光性。然氨基酸都具有旋光性。 2、紫外吸收光谱紫外吸收光谱：参与蛋白质组成的：参与蛋白质组成的20种种 氨基酸中氨基酸中色氨酸色氨酸(Trp)、酪氨酸酪氨酸(Tyr)和和苯丙氨酸苯丙氨酸(Phe) 的的R基团中含有苯环共轭双键系统，在紫外光区显示基团中含有苯环共轭双键系统，在紫外光区显示 特征的吸收谱带，最大光吸收（特征的吸收谱带，最大光吸收（ max）分别为）分别
34、为280、275、和和257nm。由于大。由于大 多数蛋白质都含有这些氨基酸残基，因此用紫外分光多数蛋白质都含有这些氨基酸残基，因此用紫外分光 光度法可测定蛋白质含量光度法可测定蛋白质含量。 3、核磁共振（核磁共振（nuclear magnetic resonance,NMR）波）波 谱谱：原子核带有正电荷，只要自旋量子数不等于零，其行为就象饶轴自旋的原子核带有正电荷，只要自旋量子数不等于零，其行为就象饶轴自旋的 小磁体，因而能与外加磁场相互作用，产生核磁共振。例如小磁体，因而能与外加磁场相互作用，产生核磁共振。例如3H、13C、2H、 14H、 、32P的核都属于这一类。的核都属于这一类。
35、氨基酸与氨基酸与2,42,4一二硝基氟苯一二硝基氟苯(DNFB)(DNFB)的反应的反应 （sangersanger反应）反应） DNFB（dinitrofiuorobenzene） DNP-AA(黄色黄色) + + HF 弱硷中弱硷中 氨基酸氨基酸 氨基酸与苯异硫氰酯（氨基酸与苯异硫氰酯（PITCPITC）的反应）的反应 （EdmanEdman反应）反应） PITC（phenylisothiocyanate） + 苯乙内酰硫脲衍生物苯乙内酰硫脲衍生物(PTH-AA) （phenylisothiohydantion-AA） 弱硷中弱硷中 (400 C) (硝基甲烷硝基甲烷 400 C) H+
36、氨基酸与茚三酮反应氨基酸与茚三酮反应 + 3H20 茚三酮茚三酮(无色无色) NH3 CO2 RCHO + 还原性茚三酮还原性茚三酮 紫色化合物紫色化合物 (弱酸弱酸) 加热加热 + 2NH3 + 还原性茚三酮还原性茚三酮 还原性茚三酮还原性茚三酮 将肽段顺序进行叠联以确定完整的顺序将肽段顺序进行叠联以确定完整的顺序 将肽段分离并测出顺序将肽段分离并测出顺序 专一性裂解专一性裂解 末端氨基酸测定末端氨基酸测定 二硫键拆开二硫键拆开 纯蛋白质纯蛋白质 蛋白质顺序测定蛋白质顺序测定 基本方法路线基本方法路线 基本策略基本策略： 片段重叠法氨基酸顺序直测法片段重叠法氨基酸顺序直测法 基本步骤：基本步
37、骤： ( (1 1) ) 测定蛋白质分子中多肽链数目；测定蛋白质分子中多肽链数目； ( (2 2) )拆分蛋白质的多肽链拆分蛋白质的多肽链，断开多肽链内二硫键；断开多肽链内二硫键； ( (3 3) )分析每一条多肽链的氨基酸组成；分析每一条多肽链的氨基酸组成； ( (4 4) )鉴定多肽链鉴定多肽链N N末端末端、C C末端氨基酸残基；末端氨基酸残基； ( (5 5) )裂解多肽链成较小的片段；裂解多肽链成较小的片段； ( (6 6) )测定各肽段的氨基酸顺序；测定各肽段的氨基酸顺序； ( (7 7) )片段重叠法片段重叠法重建完整多肽链一级结构；重建完整多肽链一级结构； ( (8 8) )确
38、定半胱氨酸残基间形成二硫键交联桥的位置确定半胱氨酸残基间形成二硫键交联桥的位置。 蛋白质一级结构测定蛋白质一级结构测定 胰岛素胰岛素 -巯基乙醇巯基乙醇 碘乙酸碘乙酸 二二 硫硫 键键 的的 断断 裂裂 多肽多肽N、C-末端氨基酸的测定末端氨基酸的测定 N端端 Sanger法法（二硝基氟苯反应二硝基氟苯反应） DNS法法（丹磺酰氯反应丹磺酰氯反应） Edman法法（苯异硫氰酸脂反应苯异硫氰酸脂反应） 氨肽酶法氨肽酶法 C端端 肼解法肼解法 还原法还原法 羧肽酶法羧肽酶法 蛋白质的重要性质蛋白质的重要性质 两性解离性质及等电点两性解离性质及等电点 蛋白质胶体性质蛋白质胶体性质 蛋白质的沉淀蛋白质
39、的沉淀 蛋白质的变性与复性蛋白质的变性与复性 蛋白质的紫外吸收特性蛋白质的紫外吸收特性 蛋白质呈色反应蛋白质呈色反应 蛋白质两性解离性质和等电点蛋白质两性解离性质和等电点 pH = pI 净电荷净电荷=0 pH pI 净电荷为负净电荷为负 Pr COOH NH3+ + H+ + OH- + H+ + OH- Pr COO- NH2 Pr COO- NH3+ 当蛋白质溶液在某一定当蛋白质溶液在某一定pH值时值时，使某特定蛋白质分子上所带正负使某特定蛋白质分子上所带正负 电荷相等电荷相等，成为两性离子成为两性离子，在电场中既不向阳极也不向阴极移动在电场中既不向阳极也不向阴极移动， 此时溶液的此时溶
40、液的pH值即为该蛋白质的值即为该蛋白质的等电点等电点 （isoelectric point，pI） 问题 1、什么是蛋白质的等电点？（专科） 2、一个蛋白质的pI 4.6,在pH 8.0的缓冲液中， 该蛋白质带什么电荷？（本科） 3、一个蛋白质，完全溶解于pH 7.0的水中， 溶液的pH变为了pH 7.8，请问该蛋白质的 pI在什么的pH范围？请写出推导过程（研 究生） 蛋白质胶体性质蛋白质胶体性质 蛋白质是相对分子质量较高的有机化合物蛋白质是相对分子质量较高的有机化合物，分子量分子量 在在1010kDkD- -10001000kDkD，其分子的直径可达其分子的直径可达1 1100100nmn
41、m，属胶体颗粒属胶体颗粒 。可溶性蛋白质分子表面分布着大量极性氨基酸残基可溶性蛋白质分子表面分布着大量极性氨基酸残基，对水对水 有很高的亲和性有很高的亲和性，通过水合作用在蛋白质颗粒外面形成一层通过水合作用在蛋白质颗粒外面形成一层 水化层水化层，同时这些颗粒带有同时这些颗粒带有电荷电荷，二者是蛋白质胶体溶液的二者是蛋白质胶体溶液的 稳定因素稳定因素。 + + + + + + + 带正电荷的蛋白质带正电荷的蛋白质 带负电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质 在等电点的蛋白质在等电点的蛋白质 水化膜水化膜 + + + + + + + + 带正电荷的蛋白质带正电荷的蛋白质 带负电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质 不
42、稳定的蛋白质颗粒不稳定的蛋白质颗粒 酸酸 碱碱 酸酸 碱碱 酸酸 碱碱 脱水作用脱水作用 脱水作用脱水作用 脱水作用脱水作用 溶液中蛋白质的聚沉溶液中蛋白质的聚沉 蛋白质胶体性质的应用蛋白质胶体性质的应用 盐析法盐析法: :在蛋白质溶液中加入高浓度的硫酸铵、氯化钠等中性盐，可有效在蛋白质溶液中加入高浓度的硫酸铵、氯化钠等中性盐，可有效 地破坏蛋白质颗粒的水化层。同时又中和了蛋白质表面的电荷，从而使蛋地破坏蛋白质颗粒的水化层。同时又中和了蛋白质表面的电荷，从而使蛋 白质颗粒集聚而生成沉淀，这种现象称为盐析（白质颗粒集聚而生成沉淀，这种现象称为盐析（salting outsalting out）。
43、）。 蛋白质的透析： 利用蛋白质不能透过半透膜不能透过半透膜的性质，将含有小分子杂质 的蛋白质溶液放入透析袋再置于流水中，小分子杂质被透析出， 大分子蛋白质留在袋中，以达到纯化蛋白质的目的。 蛋白质胶体性质的应用蛋白质胶体性质的应用 意义：这种性质使 各种蛋白质分别存在于细胞 内外不同的部位，对维持细 胞内外水和电解质分布的平 衡、物质代谢的调节都起着 非常重要的作用。 蛋白质大分子溶液在一定溶剂中超速离心时 可发生沉降。沉降速度与向心加速度之比值即为 蛋白质的沉降系数S。 蛋白质分子愈大，沉降系数愈高，故可根据 沉降系数来分离和检定蛋白质。 蛋白质胶体性质的应用蛋白质胶体性质的应用 可根据沉
44、降系数来分离和检定蛋白质可根据沉降系数来分离和检定蛋白质 蛋白质的沉淀蛋白质的沉淀 如果加入适当的试剂使蛋白质分子处于等电点状态或如果加入适当的试剂使蛋白质分子处于等电点状态或 失去水化层失去水化层（消除相同电荷消除相同电荷，除去水膜除去水膜），蛋白质胶体溶蛋白质胶体溶 液就不再稳定并将产生沉淀液就不再稳定并将产生沉淀。 沉淀方法类别沉淀方法类别: : 1 1、高浓度中性盐高浓度中性盐（盐析盐析、盐溶盐溶） 2 2、酸碱酸碱（等电点沉淀等电点沉淀） 3 3、有机溶剂沉淀有机溶剂沉淀 4 4、重金属盐类沉淀重金属盐类沉淀 5 5、生物碱试剂和某些酸类沉淀生物碱试剂和某些酸类沉淀 6 6、加热变性
45、沉淀加热变性沉淀 1 1. .中性盐沉淀蛋白质中性盐沉淀蛋白质 - 盐析盐析 蛋白质溶液中加入大量中性盐时蛋白质溶液中加入大量中性盐时，蛋白质便从溶蛋白质便从溶 液中沉淀出来液中沉淀出来，这个过程称为盐析这个过程称为盐析。 作用机制：中性盐夺取蛋白质的水化膜并中和电作用机制：中性盐夺取蛋白质的水化膜并中和电 荷荷，通常在蛋白质的等电点附近进行盐析通常在蛋白质的等电点附近进行盐析。 常用的中性盐有：硫酸铵常用的中性盐有：硫酸铵、硫酸钠硫酸钠、氯化钠等氯化钠等。 根据各种蛋白质的颗粒大小、亲水性的程度不同，在盐根据各种蛋白质的颗粒大小、亲水性的程度不同，在盐 析时需要盐的浓度也不一致。因此，调节中
46、性盐的浓度，可析时需要盐的浓度也不一致。因此，调节中性盐的浓度，可 使蛋白溶液中的几种蛋白质分段析出，这种方法称分段盐析使蛋白溶液中的几种蛋白质分段析出，这种方法称分段盐析 法。法。 临床检验中常用此法来分离和纯化蛋白质。临床检验中常用此法来分离和纯化蛋白质。 2. 2.重金属盐沉淀蛋白质重金属盐沉淀蛋白质 蛋白质可以与重金属离子(如汞、铅、铜、锌等)结合生 成不溶性盐而沉淀。此反应的条件是溶液的pH值应稍大于该 蛋白质的等电点，使蛋白质带较多的负电荷，易与金属离子 结合。 临床应用： 常用蛋清或牛乳解救误服重金属盐的病人，然后，用洗 胃或催吐的方法，将重金属离子的蛋白质盐从胃内清除出去， 也可用导泻药将毒物从肠管排出。 3. 3.某些酸类沉淀蛋白质某些酸类沉淀蛋白质 蛋白质可与钨酸、苦味酸、鞣酸、三氯醋酸、磺基水杨 酸等发生沉淀。 反应条件是溶液的pH值应小于该蛋白质的等电点，使蛋 白质带正电荷，与酸根结合生成不溶盐而沉淀。 生化检验中常用钨酸或三氯醋酸作为蛋白沉淀剂，以制 备无蛋白血滤液。 4. 4.有机溶剂沉淀蛋白质有
