1、 2024北京高考刺 基因工程 练习1.科研人员构建了可表达J-V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测,该质粒的部分结构如图甲所示。其中V5编码序列表达标签短肽V5。(1)与图甲中启动子结合的酶是。除图甲中标出的结构外,作为载体,质粒还需具备的结构有(答出2个结构即可)。(2)构建重组质粒后,为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确,需进行PCR检测,若仅用一对引物,应选择图甲中的引物。已知J基因转录的模板链位于b链,由此可知引物F1与图甲中J基因的(填“a链”或“b链”)相应部分的序列相同。(3)重组质粒在受体细胞内正确表达后,用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平,结果
2、如图乙所示。其中,出现条带1证明细胞内表达了,条带2所检出的蛋白(填“是”或“不是”)由重组质粒上的J基因表达的。答案(1)RNA聚合酶标记基因、复制原点(或限制性酶切位点)(2)F2和R1(或“F1和R2”)a链(3)J-V5融合蛋白不是解析(1)启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位,有了它才能驱动基因的转录。质粒作为载体,需要有复制原点、一个至多个限制酶切割位点和便于重组质粒筛选的标记基因等。(2)用PCR扩增分析法确定重组质粒中目的基因插入方向是否正确时,常设计一对引物,一个引物与目的基因序列互补,另一个引物与质粒序列互补,两引物延伸方向相反,以扩增出两引物间的序列,若插入方向正确,则可
3、扩增出相应序列,反之,则不能扩增出相应序列,故选用的引物应为F2、R1或F1、R2,若选用引物F1、R1,不论目的基因插入方向是否正确,都可扩增出目的基因序列。因为J基因的b链为转录的模板链,启动子在左侧,所以转录方向为从左到右,由于转录沿模板链3到5端方向合成RNA,所以J基因b链左侧为3端,引物要与DNA的3端互补配对,所以F1与b链互补,a链也与b链互补,由此推知引物F1与a链相应部分序列相同。(3)抗J蛋白抗体和抗V5抗体均能检测到条带1,说明条带1为J-V5融合蛋白,条带2仅能由抗J蛋白抗体检测到,说明该蛋白仅含J蛋白,不含V5标签,故条带2检出的蛋白不是由重组质粒上的J基因表达的。
4、2.基因递送是植物遗传改良的重要技术之一,我国多个实验室合作开发了一种新型基因递送系统(切浸生芽Cut-Dip-Budding,简称CDB法)。图1与图2分别是利用常规转化法和CDB法在某植物中递送基因的示意图。植株A 外植体 愈伤组织 愈伤组织与含重组载体的农杆菌共培养幼苗 转化植株A图1植株B植株上半部分浸入含重组载体的农杆菌液植株长出毛状根阳性毛状根段幼苗 转化植株B图2回答下列问题。(1)图1中,从外植体转变成愈伤组织的过程属于;从愈伤组织到幼苗的培养过程需要的激素有生长素和,该过程还需要光照,其作用是。(2)图1中的愈伤组织,若不经过共培养环节,直接诱导培养得到的植株可以保持植株A的
5、。图1中,含有外源基因的转化植株A若用于生产种子,其包装需标注。(3)图1与图2中,农杆菌侵染植物细胞时,可将外源基因递送到植物细胞中的原因是(4)已知某酶(PDS)缺失会导致植株白化。某团队构建了用于敲除PDS基因的CRISPR/Cas9基因编辑载体(含有绿色荧光蛋白标记基因),利用图2中的CDB法将该重组载体导入植株B,长出毛状根,成功获得转化植株B。据此分析,从毛状根中获得阳性毛状根段的方法是,图2中,鉴定导入幼苗中的基因编辑载体是否成功发挥作用的方法是,依据是。(5)与常规转化法相比,采用CDB法进行基因递送的优点是(答出2点即可)。答案 (1)脱分化细胞分裂素诱导叶绿素的形成,使幼苗
6、能够进行光合作用(2)遗传特性转基因种子(3)农杆菌细胞内含Ti质粒,当它侵染植物细胞后,能将Ti质粒上的T-DNA转移并整合到受体细胞染色体DNA上(4)检测毛状根段是否有绿色荧光植物PDS中靶区域测序(或根据PDS基因的碱基序列设计引物进行PCR扩增)若导入幼苗的基因编辑载体成功发挥作用,则PDS基因被敲除,靶区域的测序就会出现序列缺失,(或PCR无法扩增出条带)(5)不需要无菌操作、不需要进行植物组织培养、操作简便解析 (1)外植体经过脱分化形成愈伤组织,愈伤组织经过再分化形成幼苗,再分化培养基需要有一定比例的生长素和细胞分裂素。叶绿素的形成需要光,故再分化过程中需要适宜的光照以诱导叶绿
7、素的形成。(2)图1中,若不经过愈伤组织与含重组载体的农杆菌共培养环节,直接诱导培养植株,则获得的植株遗传物质全部来自植株A,这种无性繁殖的方式可以保持植株A的遗传特性。为遵守我国对农业转基因生物实行的标识制度,需对含有外源基因的转化植株A生产的种子的包装标注“转基因种子”。(3)见答案。(4)用含有重组载体的农杆菌液处理植株B后长出的毛状根中若含有基因编辑载体(阳性毛状根),则该基因编辑载体中的绿色荧光蛋白基因可以在毛状根中表达,故可通过观察其是否含有绿色荧光筛选阳性毛状根。若导入幼苗中的基因编辑载体成功发挥作用,则PDS基因被敲除,靶基因测序就会出现序列缺失,或用另一种方法,根据PDS基因
8、的碱基序列设计引物进行PCR扩增,不会出现扩增条带。(5)对比图1与图2知,与常规转化法相比,用CDB法进行基因递送不需要进行植物组织培养,不需要无菌操作,操作简便。3.某些植物根际促生菌具有生物固氮、分解淀粉和抑制病原菌等作用。回答下列问题:(1)若从植物根际土壤中筛选分解淀粉的固氮细菌,培养基的主要营养物质包括水和。(2)现从植物根际土壤中筛选出一株解淀粉芽孢杆菌H,其产生的抗菌肽抑菌效果见表。据表推测该抗菌肽对的抑制效果较好,若要确定其有抑菌效果的最低浓度,需在gmL-1浓度区间进一步实验。测试菌抗菌肽浓度(gmL-1)55.2027.6013.806.903.451.730.86金黄色
9、葡萄球菌-+枯草芽孢杆菌-+禾谷镰孢菌-+假丝酵母-+注:“+”表示长菌,“-”表示未长菌(3)研究人员利用解淀粉芽孢杆菌H的淀粉酶编码基因M构建高效表达质粒载体,转入大肠杆菌成功构建基因工程菌A。在利用A菌株发酵生产淀粉酶M过程中,传代多次后,生产条件未变,但某子代菌株不再产生淀粉酶M。分析可能的原因是(答出两点即可)。(4)研究人员通过肺上皮干细胞诱导生成肺类器官,可自组装或与成熟细胞组装成肺类装配体,如图所示。肺类装配体培养需要满足适宜的营养、温度、渗透压、pH以及(答出两点)等基本条件。肺类装配体形成过程中是否运用了动物细胞融合技术?(填“是”或“否”)。(5)耐甲氧西林金黄色葡萄球菌
10、(MRSA)是一种耐药菌,严重危害人类健康。科研人员拟用MRSA感染肺类装配体建立感染模型,来探究解淀粉芽孢杆菌H抗菌肽是否对MRSA引起的肺炎有治疗潜力。以下实验材料中必备的是。金黄色葡萄球菌感染的肺类装配体MRSA感染的肺类装配体解淀粉芽孢杆菌H抗菌肽生理盐水青霉素(抗金黄色葡萄球菌的药物)万古霉素(抗MRSA的药物)答案 (1)淀粉、无机盐(2)金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌1.733.45(3)淀粉酶M基因发生突变或含有M基因的表达载体丢失(4)适宜的气体和无菌、无毒的环境否(5)解析 (1)培养基的成分一般包含水、碳源、氮源和无机盐等营养成分,筛选分解淀粉的固氮细菌所需要的选择培养基中
11、,除含水、无机盐外,还应含有淀粉,而不能含有有机氮。(2)从表中数据可以看出,抗菌肽浓度为3.4555.20 gmL-1时,金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌均无法存活,禾谷镰孢菌和假丝酵母在抗菌肽浓度为55.20 gmL-1时无法存活,而在抗菌浓度低于27.6 gmL-1(含)时可存活,故抗菌肽对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌抑制效果较好。抗菌肽浓度为1.73 gmL-1时,金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌均能存活,而在3.45 gmL-1时均不能存活,所以若要确定抗菌肽有抑菌效果的最低浓度,应在1.733.45 gmL-1浓度区间进一步实验。(3)淀粉酶M基因发生突变或含有M基因的表达载体丢失时,菌株
12、不能再产生淀粉酶M。(4)动物细胞培养除需要满足适宜的营养、温度、渗透压和pH条件外,还需要适宜的气体环境(95%空气和5%CO2)以满足代谢需求和维持培养液pH,以及无菌、无毒的环境防止其他微生物的污染和细胞代谢物的危害。肺类装配体形成过程涉及两种或多种细胞的共培养,但并未运用动物细胞融合技术。(5)若要探究解淀粉芽孢杆菌H抗菌肽是否对MRSA引起的肺炎有治疗潜力,需至少取三组MRSA感染的肺类装配体进行培养,第一组加入解淀粉芽孢杆菌H抗菌肽,第二组加入万古霉素(作为有抗菌效果的对照),第三组加入等量生理盐水(作为无抗菌效果的对照),观察并比较三组肺类装配体的生长情况,若第一组肺类装配体生长
13、情况明显好于第三组,且与第二组类似或好于第二组,说明该抗菌肽对MRSA引起的肺炎有治疗潜力。4.接种疫苗是预防传染病的一项重要措施,乙肝疫苗的使用可有效阻止乙肝病毒的传播,降低乙型肝炎发病率。乙肝病毒是一种DNA病毒。重组乙肝疫苗的主要成分是利用基因工程技术获得的乙肝病毒表面抗原(一种病毒蛋白)。回答下列问题。(1)接种上述重组乙肝疫苗不会在人体中产生乙肝病毒,原因是。(2)制备重组乙肝疫苗时,需要利用重组表达载体将乙肝病毒表面抗原基因(目的基因)导入酵母细胞中表达。重组表达载体中通常含有抗生素抗性基因,抗生素抗性基因的作用是。能识别载体中的启动子并驱动目的基因转录的酶是。(3)目的基因导入酵
14、母细胞后,若要检测目的基因是否插入染色体中,需要从酵母细胞中提取进行DNA分子杂交,DNA分子杂交时应使用的探针是。(4)若要通过实验检测目的基因在酵母细胞中是否表达出目的蛋白,请简要写出实验思路。答案 (1)该疫苗不含乙肝病毒DNA,不会在人体细胞内增殖产生乙肝病毒(2)作为标记基因筛选出转化成功的酵母细胞RNA聚合酶(3)基因组DNA放射性同位素等标记的含有目的基因的DNA片段(4)从酵母细胞中提取蛋白质,用乙肝病毒表面抗原的特异性抗体进行抗原抗体杂交,若有杂交带出现,说明酵母细胞中表达出目的蛋白。解析 (1)只有乙肝病毒的DNA分子进入人体细胞,才能以其为模板进行DNA复制和外壳蛋白的表
15、达,然后装配形成子代乙肝病毒。重组乙肝疫苗只含有乙肝病毒表面抗原,不含乙肝病毒DNA分子,不会在人体细胞内产生乙肝病毒。(2)载体上的抗生素抗性基因常作为标记基因,用于将成功导入重组基因表达载体的细胞筛选出来。细胞中的RNA聚合酶可识别载体中的启动子,并以目的基因的一条链为模板进行转录。(3)由于不能确定目的基因是否插入染色体中,需提取酵母细胞的基因组DNA,加热变性,用基因探针进行检测。该探针中需要含有目的基因中的特异性片段,且带有放射性同位素等标记。若受体细胞的染色体中含有目的基因,该探针就会与目的基因通过碱基互补配对结合在一起,从而在放射性等检测中观察到杂交带。(4)抗乙肝病毒表面抗原的
16、抗体可与乙肝病毒表面抗原特异性结合,故可用该抗体与酵母细胞中提取出来的蛋白质进行抗原抗体杂交,若出现杂交带,则可证明酵母细胞中表达出目的蛋白。5.GFP是水母体内存在的能发绿色荧光的一种蛋白。科研人员以GFP基因为材料,利用基因工程技术获得了能发其他颜色荧光的蛋白,丰富了荧光蛋白的颜色种类。回答下列问题。(1)构建突变基因文库。科研人员将GFP基因的不同突变基因分别插入载体,并转入大肠杆菌制备出GFP基因的突变基因文库。通常,基因文库是指。(2)构建目的基因表达载体。科研人员从构建的GFP突变基因文库中提取目的基因(均为突变基因)构建表达载体,其模式图如下所示(箭头为GFP突变基因的转录方向)
17、。图中为;为,其作用是;图中氨苄青霉素抗性基因是一种标记基因,其作用是。(3)目的基因的表达。科研人员将构建好的表达载体导入大肠杆菌中进行表达,发现大肠杆菌有的发绿色荧光,有的发黄色荧光,有的不发荧光。请从密码子特点的角度分析,发绿色荧光的可能原因是(答出1点即可)。(4)新蛋白与突变基因的关联性分析。将上述发黄色荧光的大肠杆菌分离纯化后,对其所含的GFP突变基因进行测序,发现其碱基序列与GFP基因的不同,将该GFP突变基因命名为YFP基因(黄色荧光蛋白基因)。若要通过基因工程的方法探究YFP基因能否在真核细胞中表达,实验思路是。答案 (1)将含有某种生物不同基因的许多DNA片段,导入受体菌的
18、群体中储存,各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因(2)终止子启动子识别和结合RNA聚合酶,驱动基因的转录将含有目的基因的细胞筛选出来(3)密码子的简并性(4)获取YFP基因并构建表达载体,导入真核细胞,检验其能否发出黄色荧光解析(1)见答案。(2)基因表达载体中,启动子和终止子分别位于目的基因的上游和下游,由图中GFP突变基因的转录方向可判断,位于目的基因上游的为启动子,位于目的基因下游的为终止子,启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位,能驱动基因的转录。氨苄青霉素抗性基因属于标记基因,用于筛选含目的基因的受体细胞。(3)绝大多数氨基酸都有几个密码子,若突变后的基因转录出的mRNA中的密码子与
19、原基因序列所对应的密码子编码的氨基酸相同,则性状不发生改变。(4)若要通过基因工程的方法探究YFP基因能否在真核细胞中表达,可用获得的YFP基因构建表达载体后导入真核细胞内,检验受体细胞能否发出黄色荧光。6.赖氨酸是人体不能合成的必需氨基酸,而人类主要食物中的赖氨酸含量很低,利用生物技术可提高食物中赖氨酸含量。回答下列问题:(1)植物细胞合成的赖氨酸达到一定浓度时,能抑制合成过程中两种关键酶的活性,导致赖氨酸含量维持在一定浓度水平,这种调节方式属于。根据这种调节方式,在培养基中添加,用于筛选经人工诱变的植物悬浮细胞,可得到抗赖氨酸类似物的细胞突变体,通过培养获得再生植株。(2)随着转基因技术与
20、动物细胞工程结合和发展,2011年我国首次利用转基因和体细胞核移植技术成功培育了高产赖氨酸转基因克隆奶牛。其基本流程为:构建乳腺专一表达载体。 随着测序技术的发展,为获取富含赖氨酸的酪蛋白基因(目的基因),可通过检索获取其编码序列,用化学合成法制备得到。再将获得的目的基因与含有乳腺特异性启动子的相应载体连接,构建出乳腺专一表达载体。表达载体转入牛胚胎成纤维细胞(BEF)。将表达载体包裹到磷脂等构成的脂质体内,与BEF膜发生,表达载体最终进入细胞核,发生转化。核移植。将转基因的BEF作为核供体细胞,从牛卵巢获取卵母细胞,经体外培养及去核后作为。将两种细胞进行电融合,电融合的作用除了促进细胞融合,
21、同时起到了重组细胞发育的作用。重组细胞的体外培养及胚胎移植。重组细胞体外培养至,植入代孕母牛子宫角,直至小牛出生。检测。DNA水平检测:利用PCR技术,以非转基因牛耳组织细胞作为阴性对照,以为阳性对照,检测到转基因牛耳组织细胞中存在目的基因。RNA水平检测:从非转基因牛乳汁中的脱落细胞、转基因牛乳汁中的脱落细胞和转基因牛耳组织细胞,提取总RNA,对总RNA进行处理,以去除DNA污染,再经逆转录形成cDNA,并以此为,利用特定引物扩增目的基因片段。结果显示目的基因在转基因牛乳汁中的脱落细胞内表达,而不在牛耳组织细胞内表达,原因是什么?。答案 (1)(负)反馈调节一定浓度的赖氨酸类似物(2)基因(
22、序列)数据库融合受体细胞激活桑葚胚或囊胚含酪蛋白基因的牛耳组织细胞DNA酶PCR的模板构建的表达载体只含有乳腺特异性启动子,只能在乳腺细胞中启动转录,而在牛耳组织细胞中不能表达解析(1)一个系统工作的效果反过来抑制该系统的工作称为负反馈调节,基于此原理,若在培养基中加入一定浓度的赖氨酸类似物作为选择培养基,就可筛选获得抗赖氨酸类似物的细胞突变体。(2)用化学方法合成目的基因时,需要已知其全部序列,所以可以通过基因(序列)数据库检索查询该序列。利用膜融合的方式可将脂质体包裹的表达载体转入特定受体细胞。核移植时常用的受体细胞为去核卵母细胞,携带转基因的BEF(核供体细胞)与受体细胞通过电融合法诱导
23、融合,使供体核进入卵母细胞,形成重组细胞,同时电刺激还可激活重组细胞,使其完成细胞分裂和发育进程。当重组细胞发育至桑葚胚或囊胚时进行胚胎移植。阳性对照是指含有目的基因的细胞,所以用含酪蛋白基因的牛耳组织细胞作为阳性对照,通过对比判断目的基因是否导入转基因牛组织细胞中。可从非转基因牛乳汁中的脱落细胞、转基因牛乳汁中的脱落细胞和转基因牛耳组织细胞中提取总RNA,对总RNA进行DNA酶处理,以除去细胞中的DNA,只剩下RNA,再通过逆转录形成cDNA,并以此为模板利用PCR技术扩增DNA检验基因是否表达。不同种类细胞中遗传信息的表达情况不同,含乳腺特异性启动子的表达载体只在乳腺细胞中表达。7.种子大
24、小是作物重要的产量性状。研究者对野生型拟南芥(2n=10)进行诱变,筛选到一株种子增大的突变体。通过遗传分析和测序,发现野生型DA1基因发生一个碱基G到A的替换,突变后的基因为隐性基因,据此推测突变体的表型与其有关,开展相关实验。回答下列问题:(1)拟采用农杆菌转化法将野生型DA1基因转入突变体植株,若突变体表型确由该突变造成,则转基因植株的种子大小应与植株的种子大小相近。(2)用PCR反应扩增DA1基因,用限制性核酸内切酶对PCR产物和进行切割,用DNA连接酶将两者连接。为确保插入的DA1基因可以正常表达,其上下游序列需具备。(3)转化后,T-DNA(其内部基因在减数分裂时不发生交换)可在基
25、因组单一位点插入也可以同时插入多个位点。在插入片段均遵循基因分离及自由组合定律的前提下,选出单一位点插入的植株,并进一步获得目的基因稳定遗传的植株(图1),用于后续验证突变基因与表型的关系。图1农杆菌转化T0代植株并自交,将T1代种子播种在选择培养基上,能够萌发并生长的阳性个体即表示其基因组中插入了。T1代阳性植株自交所得的T2代种子按单株收种并播种于选择培养基,选择阳性率约%的培养基中幼苗继续培养。将中选出的T2代阳性植株(填“自交”“与野生型杂交”或“与突变体杂交”)所得的T3代种子按单株收种并播种于选择培养基,阳性率达到%的培养基中的幼苗即为目标转基因植株。为便于在后续研究中检测该突变,
26、研究者利用PCR扩增野生型和突变型基因片段,再使用限制性核酸内切酶X切割产物,通过核酸电泳即可进行突变检测,相关信息见图2,在电泳图3中将酶切结果对应位置的条带涂黑。图2图3答案 (1)野生型(2)基因表达载体(或质粒,或载体)启动子、终止子(3)T-DNA片段(或DA1基因,或目的基因)75自交100(4)解析(1)野生型DA1基因为显性基因,若导入成功,转基因植株的种子大小应与野生型的一致。(2)用农杆菌转化法进行转基因需将目的基因插入Ti质粒的T-DNA中,所以需将二者用同种限制酶切割再用DNA连接酶连接。如要目的基因正常表达,其上游要有启动子驱动转录开始,下游要有终止子终止转录。(3)
27、能在选择培养基上萌发并生长的阳性个体说明其基因组中成功插入含有DA1基因的T-DNA片段。T0代植株自交后所得的T1代种子若能在选择培养基上存活,则为导入了DA1基因和卡那霉素抗性基因的阳性种子,但导入的数量未知,故用T1代植株继续自交,若某T1代植株为基因组单一位点插入,则其产生的T2代种子在选择培养基上的存活率(阳性率)为75%。目标转基因植株应为纯合阳性子代,T2代植株中存在杂合阳性和纯合阳性子代,应该用自交的方法筛选,若后代不再出现性状分离,即阳性率为100%,说明培养基中的幼苗为目标转基因植株。(4)野生型基因和突变型基因长度均为150 bp,野生型基因内部无限制酶X的酶切位点,突变
28、型基因在50 bp处有一个限制酶X的酶切位点,所以酶切后野生型出现1个150 bp的条带,而突变型出现100 bp和50 bp两个条带。8.研究者拟构建高效筛选系统,将改进的苯丙氨酸合成关键酶基因P1导入谷氨酸棒杆菌,以提高苯丙氨酸产量。(1)如图是该高效筛选系统载体的构建过程。载体1中含有KanR(卡那霉素抗性基因)和SacB两个标记基因, 为去除筛选效率较低的SacB,应选择引物和,并在引物的(5/3)端引入Xho酶识别序列,进行PCR扩增,产物经酶切、连接后环化成载体2。(2)PCR扩增载体3中筛选效率较高的标记基因RpsL(链霉素敏感基因)时,引物应包含(EcoR /Hind /Xho
29、 )酶识别序列,产物经单酶切后连接到载体2构建高效筛选载体4。(3)将改进的P1基因整合到载体4构建载体5。将载体5导入链霉素不敏感(由RpsL突变造成)、卡那霉素敏感的受体菌。为获得成功导入载体5的菌株,应采用含有的平板进行初步筛选。(4)用一定的方法筛选出如下菌株:P1基因脱离载体5并整合到受体菌拟核DNA,且载体5上其他DNA片段全部丢失。该菌的表型为。A.卡那霉素不敏感、链霉素敏感B.卡那霉素敏感、链霉素不敏感C.卡那霉素和链霉素都敏感D.卡那霉素和链霉素都不敏感(5)可采用技术鉴定成功整合P1基因的菌株。之后以发酵法检测苯丙氨酸产量。答案(1)14(以上两空可调换)5(2)Xho (
30、3)卡那霉素(4)B(5)PCR(聚合酶链式反应,答案合理即可)解析(1)结合题图中载体1分析,要去除SacB区域,应扩增SacB区域外的DNA片段,所选择的两种引物应方向相反,且位于扩增部位两端,故应选引物1和4。由于PCR扩增时,子链从引物的3端开始延伸,因此应在引物的5端引入合适的限制酶识别序列。(2)根据题图中构建载体4的过程可知,从载体3扩增出的RpsL片段插入了载体2的Xho位点,故以载体3为模板扩增RpsL时所需引物应包含Xho酶识别序列。(3)因受体菌的表型为链霉素不敏感、卡那霉素敏感,载体5上具有RpsL(链霉素敏感基因)和KanR(卡那霉素抗性基因),故成功导入载体5的菌株
31、链霉素敏感、卡那霉素不敏感,所以,为获得成功导入载体5的菌株,应利用含有卡那霉素的平板进行初步筛选,选择平板上出现的菌落即可。(4)P1基因整合到受体菌拟核DNA,且载体5上其他DNA片段全部丢失,所以该菌的表型依然是受体菌的表型,即链霉素不敏感、卡那霉素敏感,故B正确。(5)以受体菌拟核DNA为模板,采用P1基因特异性引物进行PCR扩增,若获得相应大小片段,即可表明该菌株成功整合了P1基因。9.纤毛是广泛存在的细胞表面结构,功能异常可引发多种疾病。因此,研究纤毛形成的作用机制具有重要意义。请回答下列问题。图(1)纤毛结构如图所示,由细胞膜延伸形成的纤毛膜主要由组成。基体由中心体转变而来,中心
32、体在有丝分裂中的功能是。(2)某病人肾小管上皮细胞纤毛异常,为了分析纤毛相关基因X是否发生了变异,对基因X进行了PCR扩增与产物测序。从细胞样品中分离DNA时,可通过交替调节盐浓度将与核蛋白结合的DNA分离出来,溶液中添加NaCl至2.0 mol/L的目的是。PCR扩增时,需在催化下,在引物的端进行DNA链的延伸,获得扩增产物用于测序。(3)为研究蛋白质X在细胞中的定位,构建绿色荧光蛋白GFP与X的融合蛋白,融合蛋白具有绿色荧光,可指示其在细胞内位置。将X-GFP基因融合片段M导入如图所示载体质粒Y,构建Y-M重组质粒(在EcoR位点插入片段)。请完成下表。图图分步实验目标简易操作、结果、分析
33、PCR鉴定正向重组质粒Y-M选择图引物;PCR目的产物约为bp确保M及连接处序列正确质粒测序,图中正确的是(选填序列编号)检测融合蛋白定位对照质粒Y-GFP(仅表达GFP)与实验质粒Y-M分别导入细胞,发现对照组整个细胞均有绿色荧光而实验组荧光集中在纤毛基部,说明(4)为研究另一纤毛病相关基因Z表达的变化,采用荧光定量PCR法检测健康人与病人基因Z的转录水平。采集样本、提取总RNA,经形成cDNA作为模板,PCR扩增结果显示,在总cDNA模板量相等的条件下,健康人Ct值为15,而病人Ct值为20(Ct值是产物荧光强度达到设定阈值时的PCR循环数)。从理论上估算,在PCR扩增20个循环的产物中,
34、健康人样品的目的产物大约是病人的倍。答案(1)脂质和蛋白质发出星射线,形成纺锤体(2)溶解DNATaq DNA聚合酶(或耐高温的DNA聚合酶)3(3)a、b1 100Q4蛋白X定位于纤毛基部(4)逆转录32解析(1)纤毛膜由细胞膜延伸形成,细胞膜的组成成分主要是脂质和蛋白质;在低等植物和动物细胞有丝分裂的前期,中心体发出星射线,形成纺锤体。(2)DNA在2.0 mol/L的NaCl溶液中溶解度很高,常用该浓度的NaCl溶液溶解DNA。PCR是体外大量扩增DNA分子的技术,PCR过程需要Taq DNA聚合酶(或耐高温的DNA聚合酶,可催化DNA子链的延伸)、引物(在PCR过程中为Taq DNA聚
35、合酶提供3-OH,使该酶能够从引物的3端开始连接脱氧核苷酸)、四种游离的脱氧核苷酸(合成DNA子链的原料)、缓冲液(提供液体环境及离子条件)、DNA母链(DNA复制的模板)。(3)片段M正向拼接和反向拼接结果如图:用PCR鉴定是否为正向重组质粒Y-M,可选用引物a和引物b,目的产物约为1 100 bp。若M与载体质粒Y正确连接,则上游连接处含有Hind +EcoR 的识别序列,即5AAGCTTGATATC3,即Q4,下游含有EcoR +BamH 的识别序列,即5GATATCGGATCC3,即质粒测序正确的是Q4。本实验的目的是借助绿色荧光蛋白检测蛋白质X在细胞中的位置,则实验组导入的是质粒Y-
36、M(M为X-GFP基因融合片段),表达X-GFP,对照组导入仅表达GFP的质粒Y-GFP,依据实验组绿色荧光集中在纤毛基部,而对照组整个细胞均有绿色荧光,可知蛋白X定位于纤毛基部。(4)提取细胞的总RNA,经逆转录获得cDNA,cDNA作为荧光定量PCR的模板。荧光定量PCR过程中,特定PCR循环次数下产物产生的荧光强度与模板量呈正相关,虽然限定了总cDNA模板量相等,但要注意由于健康人和病人基因Z的转录水平不同,相应的mRNA含量不同,因此基因Z的cDNA含量并不相同,设健康人基因Z的cDNA模板量为x,病人的为y,由“健康人Ct值为15,而病人Ct值为20”知,x215=y220,PCR扩
37、增20个循环的产物中,健康人样品的目的产物大约是病人的(x220)(y220)=(x220)(x215)=25=32倍。知识拓展在基因工程中常用绿色荧光蛋白基因作为标记基因或报告基因,用以检测目的基因是否完成表达,同时也可以检测目的蛋白在细胞中的分布及含量。10用DNA重组技术可以赋予生物以新的遗传特性,创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中需要使用多种工具酶,其中4种限制性核酸内切酶的切割位点如图所示。回答下列问题:(1)常用的DNA连接酶有E.coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶。上图中酶切割后的DNA片段可以用E.coli DNA连接酶连接。上图中酶切割后的DNA片段可以用T4
38、 DNA连接酶连接。(2)DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是。(3)DNA重组技术中所用的质粒载体具有一些特征。如质粒DNA分子上有复制原点,可以保证质粒在受体细胞中能;质粒DNA分子上有,便于外源DNA插入;质粒DNA分子上有标记基因(如某种抗生素抗性基因),利用抗生素可筛选出含质粒载体的宿主细胞,方法是。(4)表达载体含有启动子,启动子是指。答案(1)EcoR、PstEcoR、Sma、Pst、EcoR(2)磷酸二酯键(3)自我复制限制酶切割位点将待筛选的宿主细胞接种到含该抗生素的培养基中,能够生长的是含有质粒载体的宿主细胞(4)RNA聚合酶识别、结合并启动转录的D
39、NA片段解析(1)E.coli DNA连接酶只能将双链DNA片段互补的黏性末端连接起来。T4DNA连接酶既可以“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端,又可以“缝合”双链DNA片段的平末端。(2)DNA连接酶是通过催化两个核苷酸之间形成磷酸二酯键,将双链DNA片段“缝合”起来的。(3)作为载体,质粒DNA分子上必须有复制原点,才能使质粒在受体细胞中能进行自我复制;且质粒DNA分子上应具有一个至多个限制酶切割位点,便于外源DNA插入;质粒DNA分子上有标记基因,可以用添加特定抗生素的选择培养基培养经转化处理的宿主细胞,以达到筛选目的。(4)启动子是指RNA聚合酶识别、结合并启动转录的DNA片段。11
40、.PCR技术可用于临床的病原菌检测。为检测病人是否感染了某种病原菌,医生进行了相关操作:分析PCR扩增结果;从病人组织样本中提取DNA;利用PCR扩增DNA片段;采集病人组织样本。回答下列问题:(1)若要得到正确的检测结果,正确的操作顺序应该是(用数字序号表示)。(2)操作中使用的酶是。PCR反应中的每次循环可分为变性、复性、三步, 其中复性的结果是。(3)为了做出正确的诊断,PCR反应所用的引物应该能与特异性结合。(4)PCR(多聚酶链式反应)技术是指。该技术目前被广泛地应用于疾病诊断等方面。答案(1)(2)DNA聚合酶延伸引物通过碱基互补配对与单链DNA结合(3)病原菌DNA(4)在生物体
41、外大量快速扩增特定DNA片段的技术解析(1)根据题干中给出的信息分析,若要检测病人是否感染了某种病原菌,需要从病人体内获取组织样本,提取样本中的DNA,进行PCR扩增,再分析PCR扩增的结果。由此可知若要得到正确的检测结果,正确的操作顺序应该是。(2)操作利用PCR扩增DNA片段时需要使用的酶是(耐高温的)DNA聚合酶,即Taq DNA聚合酶。PCR反应中的每次循环可分为变性、复性、延伸三步,其中复性是指温度下降到5560 ,两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。(3)为了做出正确的诊断,应检测病原菌的遗传物质,所以PCR反应所用的引物应该能与病原菌DNA特异性结合。(4)PCR(多聚
42、酶链式反应)技术是指在生物体外大量快速扩增特定DNA片段的技术,它能以极少量的DNA为模板,在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝。12.人类基因启动子上游的调控序列中含有BCL11A蛋白结合位点,该位点结合BCL11A蛋白后,基因的表达被抑制。通过改变该结合位点的序列,解除对基因表达的抑制,可对某种地中海贫血症进行基因治疗。科研人员扩增了基因上游不同长度的片段,将这些片段分别插入表达载体中进行转化和荧光检测,以确定BCL11A蛋白结合位点的具体位置。相关信息如图所示。(1)为将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达,需在引物末端添加限制酶识别序列。据图可知,在F1F7末端添加的序列所对应的限制酶是,在R末端添加的序列所对应的限制酶是。本实验中,从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要种酶。(2)将构建的载体导入除去BCL11A基因的受体细胞,成功转化后,含F1F6与R扩增产物的载体表达荧光蛋白,受体细胞
