1、-1-第第1 1节重组节重组DNADNA技术的基本工具技术的基本工具学习目标1.概述基因工程是在微生物学、生物化学和分子生物学等学科的基础上发展而来的。2.结合课本插图,掌握限制酶及DNA连接酶的作用。识记重组DNA技术中,载体需要具备的条件。3.模拟制作重组DNA模型。4.实验探究DNA的粗提取与鉴定。一、基因工程的概念和发展1.基因工程的概念基因工程又叫作重组DNA技术。基因工程是按照人们的愿望,通过转基因等技术,赋予生物新的遗传特性,创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。2.基因工程的发展 时间 理论基础和相关技术的发展1944艾弗里等人通过肺炎链球菌转化实验,不仅证明了遗传物质
2、是DNA,还证明了DNA可以在同种生物的不同个体之间转移1953沃森和克里克建立了DNA双螺旋结构模型并提出了遗传物质自我复制的假说1958梅塞尔森和斯塔尔证明了DNA的半保留复制。克里克提出中心法则1961尼伦伯格和马太破译了第一个编码氨基酸的密码子1967科学家发现,在细菌拟核DNA之外的质粒有自我复制能力,并可以在细菌细胞间转移时间 理论基础和相关技术的发展1970科学家发现了第一个限制性内切核酸酶(简称限制酶)。之后多种限制酶、DNA连接酶和逆转录酶被相继发现1972伯格构建了第一个体外重组DNA分子1973基因工程正式问世1977桑格等发明DNA序列分析的方法。DNA合成仪的问世为体
3、外合成DNA提供了方便1982第一个基因工程药物重组人胰岛素被批准上市1983科学家采用农杆菌转化法培养出第一例转基因烟草,此后,基因工程进入迅速发展阶段1985穆里斯等人发明PCR,为获取目的基因提供了有效手段预习反馈1.判断正误。(1)通过基因工程产生的变异是不定向的。( )分析该变异类型按人们的意愿进行,是定向的。(2)通过基因工程改造成的生物为新物种。( )分析通过基因工程改造成的生物,产生了新的性状,该生物与原来的生物之间不存在生殖隔离,不属于新物种。(3)基因工程育种与杂交育种相比的优点是打破了生殖隔离。( )2.基因工程是一种新兴的生物技术,实施该工程的最终目的是()A.定向提取
4、生物体的DNA分子B.定向对DNA分子进行人工“剪切”C.在生物体外对DNA分子进行改造D.定向改造生物的遗传性状答案D解析基因工程也称重组DNA技术,它是按照人类的意愿,将某种基因有计划地转移到另一种生物中去的新技术,故实施基因工程的最终目的是定向改造生物的遗传性状。二、重组DNA技术的基本工具1.限制性内切核酸酶“分子手术刀”(1)来源:主要来自原核生物。(2)作用特点:具有专一性。识别双链DNA分子的特定核苷酸序列。使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。(3)结果:切割产生的DNA片段,并在末端产生黏性末端或平末端。2.DNA连接酶“分子缝合针”(1)种类(2)作用:在两个DNA 片段之
5、间形成磷酸二酯键。(3)结果:将DNA片段拼接成新的DNA分子。种类来源 特点E.coli DNA连接酶大肠杆菌只能“缝合”具有互补黏性末端的双链DNA片段T4 DNA连接酶T4噬菌体既可以“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端,又可以“缝合”双链DNA片段的平末端3.基因进入受体细胞的载体“分子运输车”(1)种类:质粒、噬菌体、动植物病毒等。(2)常用载体质粒本质:质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外,并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。质粒作为载体所具备的条件a.能自我复制:能够在受体细胞中进行自我复制,或整合到受体DNA上,随受体DNA同步复制。b.
6、有限制酶切割位点:有一个至多个限制酶切割位点,供外源DNA片段(基因)插入其中。c.具有标记基因:具有特殊的标记基因,便于重组DNA分子的筛选。4.重组DNA分子的模拟操作(1)材料用具:剪刀代表EcoR(限制酶),透明胶条代表DNA连接酶。(2)操作过程分别从两张纸上的两段DNA链上找出 序列,并选GA之间作切口进行“切割”。将来自不同DNA链的两个DNA片段的切口互补拼接,用透明胶条将切口粘起来,形成重组DNA分子。(3)操作结果:若操作正确,连接的两切口处黏性末端应能互补配对;否则,说明操作有误。预习反馈1.判断正误。(1)重组DNA技术所需要的工具酶有限制酶、DNA连接酶和载体。( )
7、(2)不同限制酶切割后一定形成不同的黏性末端。( )(3)限制酶和DNA连接酶的作用部位一致,但作用相反。( )(4)T4 DNA连接酶既能连接黏性末端,又能连接平末端。( )(5)DNA连接酶能连接互补的黏性末端或平末端,故该酶没有专一性。( )2.下列关于重组DNA技术的基本工具的说法,正确的是()A.DNA连接酶只能连接双链DNA片段互补的黏性末端B.微生物中的限制酶对自身DNA无损害作用C.限制酶切割DNA后一定能产生黏性末端D.质粒是基因工程中唯一的载体答案B解析常用的DNA连接酶分为两类:E.coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶。前者只能将双链DNA片段互补的黏性末端连接起来
8、,而后者既可以连接双链DNA片段互补的黏性末端,也可以连接双链DNA片段的平末端。微生物中的限制酶通常能限制异源DNA的侵入并使之失活,即能将外源DNA切断,从而保护自身的遗传特性。经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式,即黏性末端和平末端。质粒是常用的载体,除此之外,重组DNA技术中用到的载体还有噬菌体和动植物病毒等。三、DNA的粗提取与鉴定1.实验原理(1)提取原理DNA不溶于酒精,某些蛋白质溶于酒精。DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同。(2)鉴定原理: DNA+二苯胺试剂 蓝色。2.实验流程(1)实验材料的选取。选用DNA含量相对较高的生物材料,如新鲜洋葱。(2)破碎细胞
9、,获取含DNA的滤液。称取约30 g洋葱切碎,然后放入研钵中,倒入10 mL研磨液,充分研磨,纱布过滤后收集研磨液,在4 冰箱中放置几分钟,获取上清液。也可以直接将研磨液倒入离心管中,1 500 r/min离心5 min,再取上清液。(3)去除滤液中的杂质。在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液(体积分数为95%),静置23 min,溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌,卷取丝状物,用滤纸吸去上面的水分;或者将溶液倒入塑料离心管中,10 000 r/min离心5 min,取沉淀物晾干)。(4)DNA的鉴定。将丝状物或沉淀物溶解于5 mL物质的量浓度为2 mol/L
10、的NaCl溶液中,再加入4 mL的二苯胺试剂,将试管置于沸水中加热5 min,冷却后观察溶液的颜色,注意要同时设置对照实验。 预习反馈1.判断正误。(1)用兔的成熟红细胞可提取DNA。( )分析哺乳动物成熟的红细胞无细胞核。可选用鸡血细胞作提取DNA的材料。(2)进行DNA粗提取和鉴定实验时,加入酒精溶液后用力进行快速、充分的搅拌。( )分析加入酒精用玻璃棒搅拌时,动作要轻缓,以免加剧DNA分子的断裂。(3)在溶有DNA的 NaCl溶液中,加入二苯胺试剂即呈蓝色。( )分析在溶有DNA的 NaCl溶液中,加入二苯胺试剂,沸水浴加热5 min,冷却后观察溶液的颜色,呈现蓝色。2.下列关于“DNA
11、的粗提取与鉴定”实验叙述,错误的是()A.酵母和菜花均可作为提取DNA的材料B.DNA既溶于2 mol/L NaCl溶液也溶于蒸馏水C.向鸡血细胞液中加蒸馏水搅拌,可见玻璃棒上有白色絮状物D.DNA溶液加入二苯胺试剂,沸水浴加热,冷却后变蓝答案C解析原则上含DNA的生物材料都可用来提取DNA,只是选用DNA含量高的生物组织,成功的可能性更大;DNA在2 mol/L NaCl溶液和蒸馏水中溶解度都较大;向鸡血细胞液中加蒸馏水搅拌,鸡血细胞会吸水破裂,但在蒸馏水中不会析出DNA;DNA溶液加入二苯胺试剂后需沸水浴加热,待冷却后溶液变蓝。探究点一探究点二基因工程的诞生和发展基因工程的诞生和发展情境导
12、引转基因单价抗虫棉培育过程是将一种细菌来源的、可专门破坏棉铃虫消化道的Bt杀虫蛋白的基因经过改造,转到了棉花中,使棉花细胞中存在这种杀虫蛋白质。这种杀虫蛋白质专门破坏棉铃虫等鳞翅目害虫的消化系统,导致这些害虫死亡,而对人畜无害。抗虫棉的研究开发是中国发展农业转基因技术,打破跨国公司垄断,抢占国际生物技术制高点的成功事例。抗虫棉的应用使棉铃虫得到了有效控制,使杀虫剂用量降低了70%80%,有效保护了农业生态环境,减少了农民喷药中毒事故,为棉花生产和农业的可持续发展做出了巨大贡献。探究点一探究点二请讨论回答下列问题。1.转基因抗虫棉是通过基因工程技术培育的,请完善下表,以准确把握基因工程的概念。别
13、名重组DNA技术操作环境 生物体外操作对象 操作水平 DNA分子水平原理 结果创造出人类需要的新的生物类型和生物产品,生物性状 答案基因基因重组定向改变 探究点一探究点二2.不同生物的DNA分子能拼接起来的原因是什么?提示(1)不同生物的DNA分子的基本组成单位都是4种脱氧核苷酸;(2)不同生物的双链DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构;(3)不同生物的DNA碱基对均遵循严格的“碱基互补配对原则”。3.外源基因能够在受体内表达,并使受体表现出相应的性状,为什么?提示(1)基因是控制生物体性状的结构和功能的基本单位,具有相对独立性;(2)遗传信息的传递都遵循中心法则;(3)生物界共用一套遗传
14、密码。探究点一探究点二归纳提升1.基因工程突破了生殖隔离,实现了不同种生物间的基因重组,可以定向改变生物性状。2.不同生物基因能拼接在一起的理论基础是DNA分子都是由4种脱氧核苷酸构成的规则的双螺旋结构。3.外源DNA导入受体细胞能成功表达的理论基础是密码子的通用性。易错提醒(1)有性生殖中的基因重组是随机的,并且只能在同一物种间进行。(2)基因工程可以定向地改变生物的性状,可以在不同物种间进行基因重组。探究点一探究点二典例剖析下列对基因工程的说法,错误的是()A.基因工程是在分子水平上进行设计和施工 B.基因工程属于染色体变异C.基因工程可以导入不同种生物的基因D.基因工程可定向改变生物性状
15、答案B解析基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工,A项正确;基因工程属于突破物种界限的基因重组,B项错误;基因工程可以导入不同种生物的基因,C项正确;基因工程可按照人们的意愿,定向改变生物性状,D项正确。探究点一探究点二活学活练1.以下有关基因工程的叙述,正确的是()A.基因工程是细胞水平上的生物工程B.基因工程的产物对人类都是有益的C.基因工程育种的优点之一是目的性强D.基因工程产生的变异属于人工诱变答案C解析基因工程是分子水平上的生物工程,其产生的变异属于基因重组,而不属于人工诱变;基因工程虽是按照人的意愿改造生物,目的性强,但并不是所有的基因产物对人类都有益。探究点一探究点二2.以下
16、事实与基因工程的诞生无关的是()肺炎双球菌的转化实验中心法则的确立克隆羊“多利”的诞生精子获能机理的揭示遗传密码的破译质粒、限制酶、连接酶及逆转录酶的发现DNA合成仪的问世体外重组DNA分子构建的成功重组DNA进入受体细胞并成功表达A. B.C.D.探究点一探究点二答案C解析肺炎双球菌的转化实验证明了一个生物的遗传物质可在同种的另一个生物的细胞中发挥作用,证明了转基因技术的可能性,有关;中心法则的确立使人们认识了遗传信息的表达过程,奠定了基因工程的理论基础,有关;克隆羊“多利”的诞生、精子获能机理的揭示都属于细胞水平的研究成果,与基因工程的诞生无关,无关;遗传密码的破译使人们认识到核酸与蛋白质
17、中的氨基酸的对应关系,这也是基因工程诞生的理论基础,有关;质粒、限制酶、连接酶及逆转录酶的发现、DNA合成仪的问世为基因工程诞生提供了技术支持,有关;体外重组DNA分子构建的成功、重组DNA进入受体细胞并成功表达标志着基因工程的诞生,有关。探究点一探究点二重组重组DNA技术的基本工具技术的基本工具情境导引基因工程又叫作重组DNA技术,DNA的双螺旋的直径只有2 nm,对如此微小的分子进行操作,是一项非常精细的工作,需要专门的“分子工具”。请讨论回答下列问题。1.重组DNA技术所需要的基本工具是什么?提示限制性内切核酸酶“分子手术刀”、DNA连接酶“分子缝合针”和基因进入受体细胞的载体“分子运输
18、车”。探究点一探究点二2.回答关于限制性内切核酸酶的问题。(1)请举例说明限制性内切核酸酶的“限制性”表现在什么地方。这体现了酶的哪种特性?提示表现在两方面:限制性内切核酸酶只能识别双链DNA分子上某种特定的脱氧核苷酸序列;限制性内切核酸酶只能在识别序列上特定的两个脱氧核苷酸之间进行切割。如EcoR 只能识别GAATTC序列,且只切割GA之间的磷酸二酯键。这体现了酶具有专一性。探究点一探究点二(2)限制性内切核酸酶的切割位置及结果有哪些种类?请举例说明。提示切割位置:识别序列的中轴线两侧切割位置:识别序列的中轴线处 探究点一探究点二(3)在切割含目的基因的DNA分子时,限制性内切核酸酶要切割几
19、个磷酸二酯键?为什么?提示4个。DNA分子为双链,且目的基因两端均含有限制性内切核酸酶的识别位点。探究点一探究点二3.回答关于DNA连接酶的问题。(1)DNA连接酶和限制酶的作用和作用部位是否相同?提示DNA连接酶和限制酶作用部位相同,都是特定部位的磷酸二酯键(下图所示位置)。但二者作用正好相反,前者是“缝合”,后者是“切割”。如下图所示。探究点一探究点二(2)DNA连接酶的识别有无特异性?能否催化连接不同限制酶切割形成的黏性末端?提示DNA连接酶无识别的特异性,对于互补的黏性末端以及平末端(T4 DNA连接酶可连接)都能连接,连接的是磷酸二酯键。不同限制酶切割形成的黏性末端只要互补,DNA连
20、接酶就可催化二者连接。探究点一探究点二4.回答关于基因进入受体细胞的载体“分子运输车”的问题。(1)具备什么条件才能充当“分子运输车”?提示能够在宿主细胞中复制并稳定地保存。具多种限制酶切割位点,以便与外源基因连接。具有特殊标记基因,便于重组DNA分子筛选。载体是安全的,不能对受体细胞有害。载体DNA分子大小应合适,以便提取和在体外进行操作。(2)什么叫质粒?天然质粒能直接用于基因工程中吗?提示 一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核之外,并具有自我复制能力的很小的双链环状DNA分子,主要存在于细菌和酵母菌体内。因为质粒上一般没有特殊的标记基因,不能直接用于基因工程中。探究点一探究点二归纳提升1
21、.与DNA分子相关的四种酶的比较比较项目 限制酶DNA连接酶 DNA聚合酶 解旋酶作用底物 DNA分子DNA分子脱氧核苷酸DNA分子作用部位 磷酸二酯键磷酸二酯键磷酸二酯键氢键作用特点切割目的基因及质粒载体,识别特定核苷酸序列,使特定部位的磷酸二酯键断开将双链DNA片段“缝合”起来,恢复磷酸二酯键将单个脱氧核苷酸添加到脱氧核苷酸链上将DNA两条链之间的氢键打开作用结果形成黏性末端或平末端形成重组DNA分子形成新的DNA分子形成单链DNA分子应用基因工程DNA复制探究点一探究点二2.标记基因用于重组DNA分子筛选的原理(1)载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。未转入目的基因的受体细胞没有
22、抵抗相应抗生素的能力。(2)含有某抗生素抗性基因的重组质粒导入受体细胞,抗性基因在受体细胞内表达,该受体细胞获得抗性。(3)在含该抗生素的培养基上,不能生长的是没有抗性的细胞,能生长的具有抗性的受体细胞。探究点一探究点二探究点一探究点二易错提醒 (1)不同DNA分子用同一种限制酶切割产生的黏性末端相同,同一个DNA分子用不同的限制酶切割,产生的黏性末端一般不相同,即同一种限制酶一定能切出相同的黏性末端,相同的黏性末端不一定来自同一种限制酶的切割。(2)如果不同限制酶切割形成的黏性末端互补,则可以重新配对,由DNA连接酶连接。探究点一探究点二典例剖析1.(多选)下列有关限制酶和DNA连接酶的叙述
23、,正确的是()A.用限制酶剪切获得一个目的基因时得到两个切口,有4个磷酸二酯键被断开B.限制酶识别序列越短,则该序列在DNA中出现的概率就越大C.序列CATG和GGATCC被限制酶切出的黏性末端碱基数不同D.T4 DNA连接酶和E.coli DNA连接酶都能催化平末端和黏性末端的连接探究点一探究点二答案AB解析用限制酶剪切获得一个目的基因时得到两个切口,有4个磷酸二酯键被断开,A项正确;限制酶识别序列越短,则该序列在DNA中出现的概率就越大,B项正确;序列CATG和GGATCC被限制酶切出的黏性末端碱基数相同,都是4个,C项错误;T4 DNA连接酶和E.coli DNA连接酶都能催化黏性末端的
24、连接,其中只有T4 DNA连接酶可以连接平末端,D项错误。探究点一探究点二2.质粒是基因工程中最常用的目的基因运载工具。下列有关叙述正确的是()A.质粒是只存在于细菌细胞质中能自主复制的小型环状双链DNA分子B.在质粒上总能找到一个或多个限制酶切割位点C.携带目的基因的重组质粒只有整合到宿主细胞的染色体DNA上才会随后者的复制而复制D.质粒上的抗性基因常作为标记基因,便于重组DNA的鉴定和选择探究点一探究点二答案D解析质粒不只分布于原核生物中,在真核生物(如酵母菌)细胞内也有分布,A项错误;并不是每个质粒上都有限制酶的切割位点,B项错误;重组质粒进入受体细胞后,有的是在细胞内自我复制,有的是整
25、合到宿主细胞染色体DNA上随染色体DNA复制,C项错误;质粒上的抗性基因常作为标记基因,便于重组DNA的鉴定和选择,D项正确。探究点一探究点二活学活练1.下列有关基因工程中限制酶的描述,错误的是()A.一种限制酶只能识别一种特定的核糖核苷酸序列B.限制酶的活性受温度、pH的影响,总有一个最合适的条件C.限制酶能破坏DNA上相邻脱氧核苷酸之间的化学键D.限制酶不只存在于原核生物中,其合成场所是核糖体探究点一探究点二答案A解析基因工程中的限制酶只能识别双链DNA分子的某种特定的脱氧核苷酸序列,不能识别RNA分子的核糖核苷酸序列,A项错误;同其他的酶一样,限制酶的活性同样受温度和pH的影响,而且在最
26、适条件时,酶活性最高,B项正确;限制酶催化的是特定部位的相邻脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键的断裂,C项正确;限制酶主要是从原核生物中分离纯化出来的,也有来自真核细胞的,其本质是蛋白质,在核糖体上合成,D项正确。探究点一探究点二2.下列有关下图所示的黏性末端的说法,错误的是()A.甲、乙、丙黏性末端分别是由不同的限制酶切割产生的B.甲、乙具有相同的黏性末端,可形成重组DNA分子,但甲与丙的黏性末端不互补C.DNA连接酶的作用位点是b处D.切割产生甲的限制酶不能识别由甲、乙黏性末端互补结合形成的核苷酸序列探究点一探究点二答案C解析据图可知,切割形成甲、乙、丙黏性末端的限制酶的识别序列与切割位点分别是G
27、AATTC(在G与A之间切割)、CAATTG(在C与A之间切割)、CTTAAG(在C与T之间切割),即甲、乙、丙是由不同的限制酶切割产生的,A项正确。甲、乙的黏性末端互补,所以甲、乙可以形成重组DNA分子;甲、丙的黏性末端不互补,所以甲、丙无法形成重组DNA分子,B项正确。DNA连接酶可以恢复被限制酶切开的磷酸二酯键,而b处是氢键,C项错误。甲、乙黏性末端互补形成的核苷酸序列为 ,该序列中没有切割产生甲的限制酶的识别序列及酶切位点,所以切割产生甲的限制酶不能识别由甲、乙黏性末端互补形成的核苷酸序列,D项正确。探究点一探究点二3.下面是四种不同质粒的示意图,其中ori为复制必需的序列,amp为氨
28、苄青霉素抗性基因,tet为四环素抗性基因,箭头表示一种限制性核酸内切酶的酶切位点。若要得到一个能在四环素培养基上生长而不能在氨苄青霉素培养基上生长的含重组DNA的细胞,应选用的质粒是()探究点一探究点二答案C解析根据题意,选用的质粒上应有复制必需序列和四环素抗性基因,且不含氨苄青霉素抗性基因。A项破坏了复制必需的序列,B项氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因都完好,C项氨苄青霉素抗性基因被破坏,四环素抗性基因完好,D项氨苄青霉素抗性基因完好,四环素抗性基因被破坏。综上所述C项符合题意。探究点一探究点二4.基因工程中,需使用特定的限制酶切割目的基因和质粒,便于重组和筛选。已知限制酶的识别序列和切割位点是GGATCC,限制酶的识别序列和切割位点是GATC。根据下图判断下列操作正确的是()探究点一探究点二A.目的基因和质粒均用限制酶切割B.目的基因和质粒均用限制酶切割C.质粒用限制酶切割,目的基因用限制酶切割D.质粒用限制酶切割,目的基因用限制酶切割答案D解析解答此题要明确目的基因要切下,质粒要切开且至少保留一个标记基因。限制酶的识别序列和切点是GATC,单独使用时可以把目的基因切下,质粒中Gene和Gene也被破坏;限制酶的识别序列和切点是GGATCC,只能把目的基因左侧切开,破坏质粒Gene,所以目的基因用限制酶切割,质粒用限制酶切割。
