1、第第1节节 植物细胞工程植物细胞工程一一 植物细胞工程的基本技术植物细胞工程的基本技术细胞工程细胞工程 细胞工程是指应用细胞工程是指应用细胞生物学细胞生物学、分子生物分子生物学和学和发育生物发育生物学学等多学科的原理和方法，通过等多学科的原理和方法，通过细胞器、细胞或组织水平细胞器、细胞或组织水平上上的操作，的操作，有目的地获得特定的细胞、组织、器官、个体或其有目的地获得特定的细胞、组织、器官、个体或其产品产品的一门综合性生物工程。的一门综合性生物工程。1.1.原理方法：原理方法：细胞生物学、分子生物学和发育生物学细胞生物学、分子生物学和发育生物学2.2.操作水平：操作水平：细胞器、细胞或组织
2、水平细胞器、细胞或组织水平3.3.目的：目的：获得特定的细胞、组织、器官、个体或其产品获得特定的细胞、组织、器官、个体或其产品4.4.分类：分类：植物细胞工程、动物细胞工程植物细胞工程、动物细胞工程从社会中来 “其其芽葺葺，其叶青青，犹绿衣郎，挺节独立，可敬可芽葺葺，其叶青青，犹绿衣郎，挺节独立，可敬可慕。迨夫花开慕。迨夫花开, ,凝晴瀼露凝晴瀼露, ,万态千妍万态千妍, ,薰风自来薰风自来, ,四坐芬郁四坐芬郁, ,岂岂非入兰室乎非入兰室乎! !岂非有国香乎岂非有国香乎!”!”这是我国历史上第一部兰这是我国历史上第一部兰谱谱金漳兰谱（宋金漳兰谱（宋赵时庚）中对兰花的一段描述。赵时庚）中对兰花
3、的一段描述。从古至今，我国人民都把兰花看作高洁、典雅的象征，很从古至今，我国人民都把兰花看作高洁、典雅的象征，很多人喜欢兰花。但是兰花种子通常发育不全，在自然条件多人喜欢兰花。但是兰花种子通常发育不全，在自然条件下萌发率极低；传统分株繁殖的方法又存在繁殖周期长，下萌发率极低；传统分株繁殖的方法又存在繁殖周期长，繁殖率低等问题，如果靠自然繁殖，兰花的价格可想而知繁殖率低等问题，如果靠自然繁殖，兰花的价格可想而知了。如何能让名贵的兰花大量、快速地繁殖，从而走入寻了。如何能让名贵的兰花大量、快速地繁殖，从而走入寻常百姓家呢？常百姓家呢？ 兰花是观赏植物中最常见的一类依靠植物组织培养繁育兰花是观赏植物
4、中最常见的一类依靠植物组织培养繁育种苗的植物，其组培苗的数量约占观赏植物组培苗总量的种苗的植物，其组培苗的数量约占观赏植物组培苗总量的40%40%利用植物组织培养技术可以大量、快速地培育兰花。利用植物组织培养技术可以大量、快速地培育兰花。一、一、细胞的全能性细胞的全能性1.1.概念：概念： 细胞细胞经分裂和分化后经分裂和分化后，仍，仍然然具有具有产生完整生物体产生完整生物体或或分化成其他各种细胞分化成其他各种细胞的潜能。的潜能。2.2.原因：原因： 一般来说，生物体的一般来说，生物体的每个细胞中都含有发育成为完每个细胞中都含有发育成为完整个体所需的全部遗传信息整个体所需的全部遗传信息。3.3.
5、生物体生长发育过程中并不是所有细胞都表现出全能性生物体生长发育过程中并不是所有细胞都表现出全能性（1）不体现全能性的实例： 芽原基只能发育为芽，叶原基只能发育为叶（2）不体现全能性的原因：基因在特定时间、空间条件下选择性表达二、植物组织培养技术二、植物组织培养技术1.1.概念：概念： 指将指将离体的植物器官、组织或细胞离体的植物器官、组织或细胞（称为（称为外植体外植体）等，）等，培养在培养在人工配制的培养基人工配制的培养基上，给予上，给予适宜的培养条件适宜的培养条件，诱导其，诱导其形形成完整植株成完整植株的技术。的技术。2.2.原理：原理： 植物细胞的全能性植物细胞的全能性。3.3.过程：过程
6、：外植体外植体脱分化脱分化愈伤愈伤组织组织再分化再分化根、芽根、芽幼苗幼苗完整植株完整植株移栽成活移栽成活 离体离体、无菌无菌条件、种类和比例适宜的条件、种类和比例适宜的营养物质营养物质、植物激素植物激素（主要是（主要是生长素和细胞分裂素生长素和细胞分裂素）的诱导和调节、适宜的）的诱导和调节、适宜的外外界条件界条件（温度、（温度、pHpH、光照光照等）。等）。脱分化脱分化：在在_条件的诱导条件的诱导下，下，已经分化的细胞已经分化的细胞_，转变为转变为_，进，进而形成而形成_的过程。的过程。一定的激素和营养等一定的激素和营养等失去其特有的结构和功能失去其特有的结构和功能未分化的细胞未分化的细胞愈
7、伤组织愈伤组织愈伤组织愈伤组织： 不定形不定形的的薄壁组织薄壁组织团块团块。再分化再分化： 愈伤组织重新分化成芽、根等器官的过程。愈伤组织重新分化成芽、根等器官的过程。适宜的培养条件适宜的培养条件：脱分化脱分化过程一般过程一般不需要光照不需要光照、再分化再分化过程过程需要光照需要光照。菊花的组织培养菊花的组织培养1.1.实验原理：实验原理：植物细胞一般具有植物细胞一般具有_；全能性全能性在一定的激素和营养等条件的诱导下，已经分化的细胞可以经过在一定的激素和营养等条件的诱导下，已经分化的细胞可以经过_和和_，形成，形成_，长出，长出_，进而发育成，进而发育成_；脱分化脱分化再分化再分化胚状体胚状
8、体芽和根芽和根完整的植株完整的植株植物激素中植物激素中_和和_是启动是启动_、_和和_的关键的关键激素，它们的激素，它们的_、_等都会影响植物细胞的发育方向；等都会影响植物细胞的发育方向；生长素生长素细胞分裂素细胞分裂素细胞分裂细胞分裂脱分化脱分化再分化再分化浓度浓度比例比例生长素生长素/ /细胞分裂素细胞分裂素 结果结果比值高比值高( (1 1) )比值低比值低( (1) )比值适中比值适中( (= =1 1) )有利于根的分化，抑制芽的形成有利于根的分化，抑制芽的形成有利于芽的分化，抑制根的形成有利于芽的分化，抑制根的形成促进愈伤组织的形成促进愈伤组织的形成2.2.材料用具材料用具外植体：
9、外植体：幼嫩的菊花茎段幼嫩的菊花茎段 ( (容易诱导形成愈伤组织容易诱导形成愈伤组织) )体积分数为体积分数为70%70%的酒精的酒精： 对手、超净工作台、外植体进行对手、超净工作台、外植体进行消毒消毒质量分数为质量分数为5%5%左右的次氯酸钠溶液左右的次氯酸钠溶液: :对外植体进行对外植体进行消毒消毒无菌水无菌水: : 清洗外植体清洗外植体培养基（参见本书附录培养基（参见本书附录1 1）包括包括无机营养成分无机营养成分（水和无机盐）、（水和无机盐）、有机营养成分有机营养成分（蔗糖、氨基酸、（蔗糖、氨基酸、维生素等）、特定浓度和比例的维生素等）、特定浓度和比例的激素激素（主要是生长素和细胞分裂
10、素）；（主要是生长素和细胞分裂素）；蔗糖的作用：蔗糖的作用：提供能量，调节渗透压提供能量，调节渗透压灭菌方法为：灭菌方法为：湿热灭菌法湿热灭菌法3.3.方法步骤方法步骤（1 1）消毒）消毒双手双手和和超净工作台台面超净工作台台面: : 用用酒精酒精擦拭擦拭外植体外植体: : 流水流水冲洗冲洗酒精酒精消毒消毒30s30s立即用立即用无无菌水菌水清洗清洗2 23 3次次次氯酸钠溶液次氯酸钠溶液处理处理30min30min立即用立即用无菌水无菌水清洗清洗2 23 3次。次。（2 2）外植体切段）外植体切段 将消过毒的外植体置于无菌的培养皿中将消过毒的外植体置于无菌的培养皿中用用无菌滤纸吸去表面的水分
11、无菌滤纸吸去表面的水分用解剖刀将外植体用解剖刀将外植体切成切成0.50.51cm1cm长的小段。长的小段。（3 3）接种）接种外植体外植体 在在酒精灯火焰旁酒精灯火焰旁，将外植体的，将外植体的1/31/31/21/2插入插入诱导愈伤组织的培养基诱导愈伤组织的培养基中。用封口膜中。用封口膜或瓶盖或瓶盖封盖瓶口封盖瓶口，并在培养瓶上作好标记，并在培养瓶上作好标记。注意：注意：接种时注意外植体的方向，接种时注意外植体的方向，不要倒插不要倒插！（4 4）脱分化）脱分化 将接种了外植体的锥形瓶或植物组织将接种了外植体的锥形瓶或植物组织培养瓶置于培养瓶置于18182222的培养箱的培养箱中培养。在中培养。
12、在培养过程中，定期观察和记录愈伤组织的培养过程中，定期观察和记录愈伤组织的生长情况生长情况。注意：注意：该过程一般该过程一般不需要光照不需要光照，有光易形成维有光易形成维管组织，管组织，不易形成愈伤组织不易形成愈伤组织。（5 5）再分化）再分化 培养培养151520d20d后，将后，将生长良好的愈伤组织生长良好的愈伤组织转转接到接到诱导生芽的培养基诱导生芽的培养基上上长出芽后长出芽后将其转将其转接到接到诱导生根的培养基诱导生根的培养基上，进一步诱导形成试上，进一步诱导形成试管苗。管苗。注意：注意：注意顺序，注意顺序，先诱导生芽，再诱导生根先诱导生芽，再诱导生根；该过程；该过程每日每日需要给予适
13、当时间和强度的光照需要给予适当时间和强度的光照！（6 6）移栽培养移栽培养 移栽前移栽前先打开封口膜或瓶盖先打开封口膜或瓶盖，让试管苗，让试管苗在培养箱内生长几日。用流水清洗掉根部的在培养箱内生长几日。用流水清洗掉根部的培养基后，将幼苗移植到培养基后，将幼苗移植到消过毒的蛭石或珍消过毒的蛭石或珍珠岩等环境珠岩等环境中，待其长壮后再移栽入土。每中，待其长壮后再移栽入土。每天观察并记录幼苗的生长情况，适时浇水、天观察并记录幼苗的生长情况，适时浇水、施肥，直至开花施肥，直至开花。4 4. .结果分析与评价结果分析与评价（1 1）接种接种3 34d4d后，检查外植体的生长情况，统计有多少外植体后，检查
14、外植体的生长情况，统计有多少外植体被污染，被污染，有多少能正常生长，有多少能正常生长，试分析它们被污染的原因试分析它们被污染的原因。培养基、接种工具灭菌不彻底；培养基、接种工具灭菌不彻底；外植体消毒不彻底；外植体消毒不彻底；操作过程不符合无菌操作要求等；操作过程不符合无菌操作要求等；（2 2）你培养出愈伤组织了吗？如果培养出来了，）你培养出愈伤组织了吗？如果培养出来了，从刚接种的外植体从刚接种的外植体到长出愈伤组织经历到长出愈伤组织经历了了多少天？多少天？这些愈伤组织进一步分化出芽和根这些愈伤组织进一步分化出芽和根了吗？了吗？ 观察实验结果，看看是否培养出了愈伤组织，记录多长时间观察实验结果，
15、看看是否培养出了愈伤组织，记录多长时间长出了愈伤组织。从长出了愈伤组织。从刚接种刚接种的外的外植植体体到到长出长出愈伤组织愈伤组织一般一般需要需要2 2周左右的时间周左右的时间。统计更换培养基后。统计更换培养基后愈伤愈伤组织进一步分化成芽和组织进一步分化成芽和根的比例和时间根的比例和时间。（3 3）观察外植体的分化情况，填好结果记录表，并及时分析结果。）观察外植体的分化情况，填好结果记录表，并及时分析结果。 做好统计和对照，填好结果记录表，培养严谨的科学做好统计和对照，填好结果记录表，培养严谨的科学态度。从实验的第一步开始就要做好实验记录，可以分组配态度。从实验的第一步开始就要做好实验记录，可
16、以分组配制不同的培养基，如诱导愈伤组织的培养基、诱导生芽的培制不同的培养基，如诱导愈伤组织的培养基、诱导生芽的培养基等，还可以进行不同配方的比较。养基等，还可以进行不同配方的比较。（4 4）你培育的幼苗移栽到露地后，能够正常生长吗）你培育的幼苗移栽到露地后，能够正常生长吗？ 生根苗移栽技术的关键是生根苗移栽技术的关键是既要充分清洗根系表面的培养基，既要充分清洗根系表面的培养基，又不能伤及根系。又不能伤及根系。一般使用无土栽培的办法。培养基质要提前一般使用无土栽培的办法。培养基质要提前消毒，可以向培养基质喷酒质量分数为消毒，可以向培养基质喷酒质量分数为5%5%的高锰酸钾，并用塑的高锰酸钾，并用塑
17、料薄膜覆盖料薄膜覆盖12h12h。掀开塑料薄膜。掀开塑料薄膜24h24h后才能移栽。新移后才能移栽。新移栽栽的组培的组培苗要在温室过渡几天，待其长壮后再移植到大田或盆中。可以苗要在温室过渡几天，待其长壮后再移植到大田或盆中。可以在课后统计移栽的成活率，看看移栽是否合格。在课后统计移栽的成活率，看看移栽是否合格。 若细胞不离体，若细胞不离体，细胞中的基因会选择性地表达，从而细胞中的基因会选择性地表达，从而形成生物体的不同组织和器官，不能表现出全能性形成生物体的不同组织和器官，不能表现出全能性；5.5.进一步探究进一步探究 若想探究生长素与细胞分裂素的使用比例对植物组织培养的影响，则应若想探究生长
18、素与细胞分裂素的使用比例对植物组织培养的影响，则应如何设计对照实验？如何设计对照实验？空白对照：不加任何激素空白对照：不加任何激素；实验组实验组1 1：生长素用量与细胞分裂素用量的比值为：生长素用量与细胞分裂素用量的比值为1 1；实验组实验组2 2：生长素用量与细胞分裂素用量的比值大于：生长素用量与细胞分裂素用量的比值大于1 1；实验组实验组3 3：生长素用量与细胞分裂素用量的比值小于：生长素用量与细胞分裂素用量的比值小于1 1。6.6.植物组织培养中植物组织培养中细胞表现出全能性的条件细胞表现出全能性的条件（1 1）离体（最关键）离体（最关键）: :（2 2）严格的无菌条件）严格的无菌条件:
19、 : 对操作环境、双手、外植体进行对操作环境、双手、外植体进行消毒消毒；对培养基；对培养基和器械进行和器械进行灭菌灭菌；接种操作必须在；接种操作必须在酒精灯火焰旁酒精灯火焰旁进行；进行；（3 3）适宜的培养条件）适宜的培养条件: :（4 4）适宜浓度和比例的激素）适宜浓度和比例的激素: :（5 5）一定的营养条件）一定的营养条件: :温度温度, ,光照光照包括包括有机有机营养成分、营养成分、无机无机营养成分营养成分主要是生长素和细胞分裂素主要是生长素和细胞分裂素 2020世纪世纪6060年代，科学家尝试将番茄和年代，科学家尝试将番茄和马铃薯杂交，希望培育出一种地上结番马铃薯杂交，希望培育出一种
20、地上结番茄、地下长马铃薯的超级作物。茄、地下长马铃薯的超级作物。讨论：讨论：用传统的用传统的有性杂交有性杂交方法能得到杂种后方法能得到杂种后代吗？为什么？代吗？为什么？ 不能；不能； 因为两种生物之间存在着生殖隔离；因为两种生物之间存在着生殖隔离； 有没有方法可以打破生殖隔离，实现远缘杂交育种，获得有没有方法可以打破生殖隔离，实现远缘杂交育种，获得“番茄番茄- -马铃薯杂种植株马铃薯杂种植株”呢？呢？三、植物体细胞杂交技术三、植物体细胞杂交技术1.1.过程过程A细胞细胞B细胞细胞纤维素酶纤维素酶果胶酶果胶酶1.去壁：去壁： 酶解法酶解法正在融合的正在融合的原生质体原生质体再生出细胞壁再生出细胞
21、壁2.诱融诱融物理法：物理法：化学法：化学法：电融合法、离心法电融合法、离心法聚乙二醇（聚乙二醇（PEG）融合法、）融合法、高高Ca2+ 高高PH融合法等融合法等脱分化脱分化再分化再分化移栽植物细胞融合植物组织培养杂种植株杂种植株愈伤组织愈伤组织A原生质体原生质体B原生质体原生质体移栽后的植株移栽后的植株2.2.植物体细胞杂交的概念：植物体细胞杂交的概念： 植物体细胞杂交是指将植物体细胞杂交是指将不同来源的植物体细胞不同来源的植物体细胞，在，在一定条一定条件下融合件下融合成成杂种细胞杂种细胞，并把，并把杂种细胞杂种细胞培育成培育成新植物体新植物体的技术。的技术。3.3.原理：原理：细胞膜具有一定的流动性细胞膜具有一定的流动性植物细胞膜的全能性植物细胞膜的全能性4.4.两个标志两个标志（1 1）植物细胞融合完成的标志：植物细胞融合完成的标志： 再生出新的细胞壁再生出新的细胞壁（2 2）植物体细胞杂交完成的标志：植物体细胞杂交完成的标志： 培育成新植物体培育成新植物体5.5.实例：实例：白菜白菜甘蓝、普通小麦甘蓝、普通小麦长穗偃麦草等。长穗偃麦草等。6.6.意义：意义： 打破生殖隔离打破生殖隔离，实现远缘杂交育种实现远缘杂交育种
