1、山东省立医院检验科微生物室山东省立医院检验科微生物室 邵春红邵春红2022-4-121临床意义低的标本临床意义低的标本痰、咽拭子痰、咽拭子粪便、肛拭子粪便、肛拭子 临床意义中等的标本临床意义中等的标本尿尿脓、伤口分泌物、脓、伤口分泌物、气管吸取物气管吸取物临床有意义的标本临床有意义的标本血、脑脊液、血、脑脊液、组织、肺泡灌洗液、胸水组织、肺泡灌洗液、胸水、腹水、无菌体、腹水、无菌体液液2022-4-122呼吸道标本的送检情况呼吸道标本的送检情况检验方法检验方法涂片涂片细菌涂片细菌涂片真菌涂片真菌涂片抗酸染色抗酸染色奴卡菌涂片奴卡菌涂片六胺银染色六胺银染色培养培养细菌培养细菌培养真菌培养真菌培养
2、厌氧培养厌氧培养分枝杆菌培养分枝杆菌培养奴卡菌培养奴卡菌培养2022-4-124呼吸道标本涂片与培养的目的呼吸道标本涂片与培养的目的呼吸道感染肺炎、气管炎抗生素使用后菌群变化用于肺部感染的鉴别诊断 帮助临床正确诊断和治疗帮助临床正确诊断和治疗2022-4-125痰标本送检指征痰标本送检指征咳嗽咳痰：下呼吸道感染最常见的症状。咯血：包括泡沫血痰、鲜血和痰中带血等。呼吸困难：呼吸急促或哮喘，常伴有胸痛。发热伴白细胞增高尤其是中性粒细胞或CRP明显增高。胸部影像学检查提示有感染可能。肺部渗出性影像学改变伴咳嗽咳痰脓性痰2022-4-126呼吸道标本的种类呼吸道标本的种类痰：痰： 自然咳痰法 支气管镜
3、采集法 气管穿刺法 胃内采痰法 做TB菌培养其阳性率比咳痰高10%左右鼻咽拭子鼻咽拭子气管和支气管分泌物抽吸液气管和支气管分泌物抽吸液纤维支气管镜刷检物纤维支气管镜刷检物肺泡灌洗液肺泡灌洗液 ：定量接种，菌落计数肺组织：肺组织：延长培养时间，排除污染的可能 采集标本以清晨为宜，这个时间段痰量较多。采集标本以清晨为宜，这个时间段痰量较多。2022-4-127支气管镜采集标本支气管镜采集标本支气管肺泡灌洗液支气管肺泡灌洗液：定量培养，104CFU/ml，具有诊断意义。保护性毛刷保护性毛刷：毛刷约仅能获得0.001ml标本，在空气中很快会干燥导致细菌死亡，从而影响检出率，应放置于1ml液体运送培养基
4、（如生理盐水和无菌肉汤）。经气管肺组织活检经气管肺组织活检：滴加少量无菌生理盐水保持标本湿润，室温送往实验室，禁止冷藏。82022-4-12支气管肺泡灌洗液和保护性毛刷定量支气管肺泡灌洗液和保护性毛刷定量培养，比痰培养更有临床诊断价值。培养，比痰培养更有临床诊断价值。及时送检，晨痰如果不能在及时送检，晨痰如果不能在2 2小时内送检或小时内送检或接种，应冷藏保存，但会影响苛养菌的检出接种，应冷藏保存，但会影响苛养菌的检出率，也可考虑留取随机痰率，也可考虑留取随机痰自肺部咳出的痰自肺部咳出的痰2022-4-129肺部感染常见病原菌肺部感染常见病原菌CAP：肺炎链球菌，流感嗜血杆菌，卡他莫拉菌，军团
5、菌，肺炎支原体，肺炎衣原体，金黄色葡萄球菌HAP：肺炎克雷伯菌，大肠埃希菌，铜绿假单胞菌，鲍曼不动杆菌，嗜麦芽窄食单胞菌，MRSA免疫缺陷患者感染免疫缺陷患者感染：卡氏肺孢子菌，结核分枝杆菌，奴卡菌，曲霉菌肺部特殊病原体感染肺部特殊病原体感染：放线菌，组织胞浆菌，结核分枝杆菌，奴卡菌，隐球菌，马红球菌，立克次体2022-4-121018571857株呼吸道标本分离的病原菌构成株呼吸道标本分离的病原菌构成2022-4-1211痰涂片的目的痰涂片的目的确定标本是否合格：帮助鉴定确定标本是否合格：帮助鉴定初步判定是否有病原菌存在：初步判定是否有病原菌存在：细菌、真菌、分枝杆菌等细菌、真菌、分枝杆菌等
6、2022-4-12122022-4-1213痰涂片的影响因素痰涂片的影响因素痰涂片痰涂片制备制备镜下检查镜下检查标本是标本是否合格否合格2022-4-1214另外，还有好的染色结果，正确的回报。另外，还有好的染色结果，正确的回报。2022-4-1215162022-4-12痰涂片的局限性痰涂片的局限性 病原菌复杂多变：病原菌复杂多变：我们查到的病原菌常常是气道的炎症而不一定是肺部的炎症。另外，临床上肺部感染复杂多变，常常是混合感染混合感染。革兰氏染色的局限性：革兰氏染色的局限性：非典型病原体如支原体、衣原体、立克次体、病毒、马内菲青霉菌、军团菌、利士曼原虫、卡氏肺孢子菌、隐球菌等均存在很大的缺
7、陷，还需要其他染色方法进行补充。172022-4-12根据痰涂片评价标本质量注释：分类中注释：分类中1-31-3类不做培养，要求重新留取标本；类不做培养，要求重新留取标本；4 4、5 5类为合格标类为合格标本；本；6 6类为气管穿刺时，如未见白细胞，而鳞状上皮细胞类为气管穿刺时，如未见白细胞，而鳞状上皮细胞10/10/低倍视低倍视野应重新留取标本。野应重新留取标本。2022-4-12182022-4-12192022-4-12202022-4-12212022-4-12222022-4-12232022-4-12242022-4-12252022-4-12262022-4-12272022-4
8、-12282022-4-12292022-4-12302022-4-12312022-4-12322022-4-12332022-4-12342022-4-12352022-4-12362022-4-1237382022-4-12.如何报告痰涂片中的真菌？如何报告痰涂片中的真菌？孢子孢子酵母样孢子念珠菌，隐球菌，毛孢子菌，双向真菌，马拉色菌非酵母样孢子曲霉菌的孢子菌丝菌丝假菌丝-有菌丝生成的念珠菌曲霉菌丝有隔真菌丝，成45度角分枝毛霉菌丝-宽大的分支不分隔的菌丝，飘带样。暗色真菌菌丝-菌丝本身现暗茶色或棕色，提示暗色真菌感染2022-4-12392022-4-12402022-4-124120
9、22-4-12422022-4-12432022-4-12442022-4-1245六胺银染色法六胺银染色法真菌的细胞壁富含多糖，经过碘酸氧化后释出醛基，真菌的细胞壁富含多糖，经过碘酸氧化后释出醛基，直接将硝酸银还原成金属银，而使真菌或肺孢子菌细直接将硝酸银还原成金属银，而使真菌或肺孢子菌细胞染成棕黑色，使其轮廓更加清晰，与浅绿色背景形胞染成棕黑色，使其轮廓更加清晰，与浅绿色背景形成反差而易辨认。成反差而易辨认。操作步骤操作步骤1. 1%过碘酸染色10min，弃去溶液，流水冲洗。2. 硝酸银溶液56 染色40min，弃去溶液，流水冲洗。3. 0.25%氯化金溶液染1-2min，回收染液，流水冲
10、洗。4. 3%硫代硫酸钠溶液染色1min，弃去溶液，流水冲洗。5.0.1亮绿染色1min，回收染液，流水冲洗。2022-4-12482022-4-12492022-4-1250THANK YOUSUCCESS2022-4-12检验方法检验方法涂片涂片细菌涂片细菌涂片真菌涂片真菌涂片抗酸染色抗酸染色奴卡菌涂片奴卡菌涂片六胺银染色六胺银染色培养培养细菌培养细菌培养真菌培养真菌培养厌氧培养厌氧培养TB培养培养奴卡菌培养奴卡菌培养2022-4-1252非常必要可通过颜色判断费时费力影响苛养菌的分离生物安全延长处理时间影响苛养菌分离稀释痰液涂涂片片痰消痰消化化洗洗痰痰涂片与接种同时进行，不洗痰，消化视情
11、况而定涂片与接种同时进行，不洗痰，消化视情况而定2022-4-1253呼吸道标本细菌培养呼吸道标本细菌培养血平板血平板 肺炎链球菌 溶血链球菌 金黄色葡萄球菌 卡他莫拉菌 奴卡菌万古巧克力万古巧克力 流感嗜血杆菌 副流感嗜血杆菌 卡他莫拉菌中国兰中国兰 肠杆菌科 假单胞菌 不动杆菌真菌真菌2022-4-1254真菌培养真菌培养沙保弱沙保弱培养基培养基念显色念显色培养基培养基2022-4-1255cglcalckrctr放线菌培养放线菌培养2022-4-1256奴卡菌培养奴卡菌培养2022-4-1257支气管肺泡灌洗液支气管肺泡灌洗液保护性毛刷保护性毛刷肺组织活检肺组织活检582022-4-12
12、定量定量接种接种研磨后研磨后接种接种痰培养的难点痰培养的难点合格率低易受上呼吸道正常菌群污染， 难以判断定植还是感染病原菌多样，阳性检出率低判断标准不统一2022-4-1259呼吸道细菌呼吸道细菌主要致主要致病菌病菌肺炎链球菌肺炎链球菌金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌溶血链球菌溶血链球菌放线菌放线菌奴卡菌奴卡菌厌氧球菌厌氧球菌棒状杆菌棒状杆菌酵母样菌酵母样菌肠杆菌科肠杆菌科假单胞菌假单胞菌不动杆菌不动杆菌卡他莫拉菌卡他莫拉菌流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌上呼吸道上呼吸道正常菌群正常菌群链球菌链球菌奈瑟菌奈瑟菌微球菌微球菌表皮葡萄球菌表皮葡萄球菌棒状杆菌棒状杆菌梭杆菌梭杆菌酵母样菌酵母样菌2022-4-1
13、260痰细菌培养的价值痰细菌培养的价值排除排除 污染菌及污染菌及 定植菌定植菌细菌及药敏结果更多是提供一种变化趋势细菌及药敏结果更多是提供一种变化趋势指导总体用药的框架指导总体用药的框架 作为个体是否用药必须结合临床作为个体是否用药必须结合临床 只有合格标本培养出的病原菌才具有临床意只有合格标本培养出的病原菌才具有临床意义，其药敏结果才具有治疗价值。义，其药敏结果才具有治疗价值。 2022-4-1261寻找致病菌的条件寻找致病菌的条件标本是否合格标本是否合格患者情况：病房、年龄、临床诊断等患者情况：病房、年龄、临床诊断等细菌生长情况：优势菌细菌生长情况：优势菌细菌的致病性：苛养菌、少见菌细菌的
14、致病性：苛养菌、少见菌2022-4-12622022-4-12632022-4-1264分级分级划线区菌落数划线区菌落数第一区第一区第二区第二区第三区第三区少见（少见（+）10101051010555101055552022-4-1265痰培养如何确定致病菌痰培养如何确定致病菌 ？1. 1. 痰的性状、气味对诊断有一定帮助痰的性状、气味对诊断有一定帮助 脓性多为细菌性感染脓性多为细菌性感染 铁锈样痰：肺炎链球菌铁锈样痰：肺炎链球菌 红棕色胶冻样痰：肺炎克雷伯菌红棕色胶冻样痰：肺炎克雷伯菌 脓痰有恶臭：伴厌氧菌感染脓痰有恶臭：伴厌氧菌感染 痰中有血：结核分枝杆菌痰中有血：结核分枝杆菌2022-4
15、-1266痰培养如何确定致病菌痰培养如何确定致病菌 ？2. 2. 合格痰合格痰标本培养优势菌中度以上生长标本培养优势菌中度以上生长(+)(+)3. 3. 合格痰合格痰标本细菌少量生长，但与涂片镜检结果一标本细菌少量生长，但与涂片镜检结果一致致 ( (肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、卡他莫拉菌等肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、卡他莫拉菌等) )4. 4. 3d3d内多次培养或连续内多次培养或连续3 3次培养到同一细菌次培养到同一细菌高度怀高度怀疑疑5. 5. 痰培养与胸水或血培养结果一致，肯定是此菌痰培养与胸水或血培养结果一致，肯定是此菌感感染染2022-4-1267痰培养如何确定致病菌痰培养如何确定致病菌
16、健康人痰中约有健康人痰中约有20%-30%20%-30%可查见念珠菌可查见念珠菌诊断肺念珠菌病诊断肺念珠菌病: : * * 要求连续要求连续3 3次以上痰培养有念珠菌生长次以上痰培养有念珠菌生长 * * 涂片可见菌丝涂片可见菌丝 * * 肺部影像学有病变肺部影像学有病变2022-4-12682022-4-1269呼吸道致病菌鉴定顺序呼吸道致病菌鉴定顺序paepaepmapmaabaabapcepcesausau溶溶血链血链球菌球菌肠杆肠杆菌菌2022-4-1270多关注苛养菌多关注苛养菌肺炎链球菌肺炎链球菌流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌溶血链球菌溶血链球菌卡他莫拉菌卡他莫拉菌艾肯菌艾肯菌 因生长缓慢
17、，需延长培养时间因生长缓慢，需延长培养时间3-73-7天天2022-4-1271苛养菌的定义苛养菌的定义是一类对营养及生长环境要求较为苛刻，是一类对营养及生长环境要求较为苛刻， 普通培养条普通培养条件下在常规培养基上生长困难或根本不生长的一类细菌件下在常规培养基上生长困难或根本不生长的一类细菌必备条件必备条件特殊的选择性培养基如加入血液的平皿特殊的选择性培养基如加入血液的平皿特殊的生长环境：特殊的生长环境：CO2CO2孵箱孵箱足够的培养时间足够的培养时间 2-72-7天，或更长时间天，或更长时间 技术人员对菌落的识别、鉴别技术人员对菌落的识别、鉴别2022-4-1272苛养菌培养注意问题苛养菌
18、培养注意问题抗生素使用之前采集标本抗生素使用之前采集标本及时接种合适的培养基及时接种合适的培养基标本不可冷藏标本不可冷藏2022-4-1273链球菌链球菌2022-4-1274寄居在人的上呼吸道中，是大叶性肺炎、支气管寄居在人的上呼吸道中，是大叶性肺炎、支气管肺炎的病原菌。肺炎的病原菌。肺炎链球菌的侵袭力主要是荚膜，失去荚膜其毒肺炎链球菌的侵袭力主要是荚膜，失去荚膜其毒力减弱或丧失。力减弱或丧失。2022-4-1275肺炎链球菌肺炎链球菌肺炎链球菌肺炎链球菌2022-4-12762022-4-1277肺炎链球菌肺炎链球菌溶血链球菌溶血链球菌A A群群化脓性链球菌，化脓性链球菌，是引起化脓性感染
19、的主要病原菌，致病力最强，可引起痈、蜂窝织炎、急性咽炎、丹毒、脓疱疮、猩红热、医源性伤口感染和产后感染等。B B群群无乳链球菌，无乳链球菌，定居人体肠道和阴道，带菌率30%，鼻咽部也携带此菌。可引发新生儿败血症、肺炎、脑膜炎等。2022-4-1278菌落特点菌落特点菌落圆形、突起、边缘整齐，宽菌落圆形、突起、边缘整齐，宽阔清晰的溶血环，是菌落的阔清晰的溶血环，是菌落的2-42-4倍倍菌落比菌落比A A群大，但溶血环较窄小，群大，但溶血环较窄小，约有约有11%11%的的B B群链球菌不出现溶血群链球菌不出现溶血菌落细小、针尖状菌落细小、针尖状 、呈、呈、血血2022-4-1279ACGACG群群
20、F F群群B B群群2022-4-1280主要鉴定方法主要鉴定方法2022-4-12811.1.菌落特点：菌落大小，溶血环特点菌落特点：菌落大小，溶血环特点2.2.CAMPCAMP试验、试验、 杆菌肽、杆菌肽、SXTSXT3.3. 乳胶凝集试验乳胶凝集试验4.4.vitek GPvitek GP卡、卡、MSMS CAMP CAMP 杆杆 SXTSXTA A 群群 - S - S R RB B 群群 + R + R R R非非A.A.非非B R SB R S 2022-4-1282BASXT嗜血杆菌嗜血杆菌2022-4-1283Hin： 在呼吸道定植率可达人群的50%，主要 寄 生于 咽喉及口腔
21、粘膜， 主要引起人类 急性化脓性感染及继发感染Hpi：为上呼吸道正常菌群 偶可引起心内膜炎、尿道炎流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌2022-4-1284在含5-10%CO2环境中生长良好 HIN需X+V因子才能生长血中2个因子都有，但 X因子：血红蛋白衍生物，对热稳定。V因子：辅酶I或辅酶，对热不稳定，常处于抑 制状态。加热80-90，才能释放出来 血液加热后成为巧克力色巧克力平皿巧克力平皿生长生长流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌2022-4-1285卡他莫拉菌卡他莫拉菌2022-4-1286被认定为是有临床意义的条件致病菌被认定为是有临床意义的条件致病菌肺炎肺炎支气管炎支气管炎脓胸脓胸菌血症菌血症中耳炎中耳
22、炎结膜炎结膜炎脑膜炎脑膜炎心内膜炎心内膜炎卡他莫拉菌卡他莫拉菌2022-4-1287为 G-双球菌，肾形成对排列专性需氧菌 菌落：不透明、鼓起、光滑或亚光，颜色乳白、 粉红或褐色。特点：可平移，易碎、段切。卡他莫拉菌卡他莫拉菌2022-4-1288OXDNA酶酶硝酸盐硝酸盐卡他莫拉菌卡他莫拉菌+其他奈瑟菌其他奈瑟菌+-+主诉：反复咳嗽，咳黄脓臭痰8个月，咯血7个月起因：淋雨受凉无发热既往体健病初抗生素治疗有效（LEV无效，换头孢唑肟3w）v黄色脓痰（100ml/d）v间断咯血v无发热2008-42008-4病病 例例90入院时（08-12）v感染？ 细菌？结核？真菌？v肿瘤？v血管炎？91实验
23、室检查v血尿常规 (-)，血CRP 13.7mg/dl，ESR 44mm/hrv感染： 结核：结核抗体(-), 痰抗酸染色(-) 痰细菌涂片：G-杆菌，G-球杆菌； 真菌：痰真菌涂片、 G因子、GM试验（-） v免疫疾病 ANA+抗ds-DNA（-）； cANCA 1：20（+），PR3-ANCA 22RU/ml 复查cANCA 1：40（+），PR3/MPO-ANCA（-）病原学检查病原学检查涂片：可见细胞内吞噬大量G+杆菌，呈分枝状，不产芽孢，呈现多形性，G+球菌成堆，G-球菌可见 ；真菌涂片、抗酸染色（-）、弱抗酸（-）；厌氧培养：厌氧培养：衣氏放线菌中间普雷沃菌（拟杆菌）产黑素普雷沃菌
24、消化链球菌属 治疗：莫西沙星+哌拉西林/他唑巴坦+甲硝唑 静脉莫西沙星+阿莫西林/克拉维酸+甲硝唑 口服942022-4-12肺放线菌病的临床特点肺放线菌病的临床特点常因受凉、劳累后起病。也多见于酗酒，误吸的患者。易误诊为肿瘤、结核、真菌、奴卡菌。肺放线菌病可以比较“温和”，可以是较长的病程。常与其他病原体共同感染导致复杂或不典型的临床表现。可以是肺脓肿也可以是支气管炎。2022-4-1295放线菌感染长期以来不被大家认识，呼吸道标本常放线菌感染长期以来不被大家认识，呼吸道标本常规不做厌氧培养。对于这一部分感染临床诊断存在规不做厌氧培养。对于这一部分感染临床诊断存在困难。困难。呼吸道是开放腔道
25、，有大量正常菌群定植，放线菌呼吸道是开放腔道，有大量正常菌群定植，放线菌的分离相对不易，本身也常与其他细菌混合感染，的分离相对不易，本身也常与其他细菌混合感染，易被忽略。易被忽略。2022-4-1296肺放线菌病很少见吗？肺放线菌病很少见吗？放线菌的多变性放线菌的多变性2022-4-1297培养条件：培养条件：厌氧或微需氧。对于需氧培养可以生长的放线菌又常常不会想到用厌氧菌鉴定系统鉴定。镜检观察：镜检观察：Gram染色形态多变，可以是分支状的，也可以是棒状的，或球杆样。菌落特点：菌落特点：菌落形态多变，粗糙样，呈磨牙样.太多的不定性是临床分离放线菌阳性率偏低的主要原因太多的不定性是临床分离放线菌阳性率偏低的主要原因肺放线菌病的治疗肺放线菌病的治疗2022-4-1298Guidline：一线药为青霉素一线药为青霉素，二线为克林霉素、红霉素、多西环素，3-63-6个月疗程个月疗程。放线菌的抗菌谱：青霉素类、四环素类、大环内酯类青霉素过敏者可用红霉素、四环素、克林霉素替换治疗。外科引流非常重要外科引流非常重要头孢菌素和喹诺酮类临床无效！头孢菌素和喹诺酮类临床无效！2022-4-1299THANK YOUSUCCESS2022-4-12
