浙科版生物选修基因工程课件(ppt).ppt

1、浙科版生物选修基因工程课件(ppt)浙科版生物选修基因工程课件目目 录录专题专题1 基因工程基因工程专题专题2 细胞工程细胞工程专题专题3 胚胎工程胚胎工程专题专题4 生物技术的安全性和伦理问题生物技术的安全性和伦理问题专题专题5 生态工程生态工程专题1 基因工程基础理论和技术的发展催生了基因工程基础理论和技术的发展催生了基因工程2020世纪中叶，基础理论取得了重大突破世纪中叶，基础理论取得了重大突破1.DNA1.DNA是遗传物质的证明是遗传物质的证明2.DNA2.DNA双螺旋结构和中心法则的确立双螺旋结构和中心法则的确立3.3.遗传密码的破译遗传密码的破译技术发明使基因工程的实施成为可能技术

2、发明使基因工程的实施成为可能1.1.基因转移载体的发现基因转移载体的发现 2.2.工具酶的发现工具酶的发现3.DNA3.DNA合成和测序技术的发明合成和测序技术的发明4.DNA4.DNA体外重组的实现体外重组的实现 5.5.重组重组DNADNA表达实验的成功表达实验的成功6.6.第一例转基因动物问世第一例转基因动物问世 7.PCR7.PCR技术的发明技术的发明 基因工程又叫基因拼接技术或基因工程又叫基因拼接技术或DNA重组技术。该技术是在生重组技术。该技术是在生物体外，通过对物体外，通过对DNA分子进行人工分子进行人工“剪切剪切”和和“拼接拼接”，对生物，对生物的基因进行改造和重新组合，然后导

3、入受体细胞内进行无性繁殖，的基因进行改造和重新组合，然后导入受体细胞内进行无性繁殖，使重组基因在受体细胞内表达，产生出人类所需要的生物类型和使重组基因在受体细胞内表达，产生出人类所需要的生物类型和生物产品。生物产品。一、基因工程的概念一、基因工程的概念基因工程的别名基因工程的别名操作环境操作环境操作对象操作对象操作水平操作水平基本过程基本过程实质实质结果结果基因拼接技术或基因拼接技术或DNADNA重组技术重组技术生物体外生物体外基因基因DNADNA分子水平分子水平定向定向地改造生物的性状，获得人类所需要的品种。地改造生物的性状，获得人类所需要的品种。剪切剪切 拼接拼接 导入导入 表达表达基因重

4、组基因重组基本工具：基本工具：限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶“分子手术刀分子手术刀”DNADNA连接酶连接酶“分子缝合针分子缝合针”基因进入受体细胞的载体基因进入受体细胞的载体“分子运输车分子运输车”二、二、 DNADNA重组技术的基本工具重组技术的基本工具黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端：黏性末端：被限制酶切开的被限制酶切开的DNADNA两条单链的切口，带有几个伸出的两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。1 1、限制性核酸内切酶、限制性核酸内切酶“分子手术刀分子手术刀”当限制酶从识别序列

5、的中心轴线处切开时，产生的是平末端。当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，产生的是平末端。当限制酶从识别序列的中心轴线两侧切开时，产生的是黏性末端。当限制酶从识别序列的中心轴线两侧切开时，产生的是黏性末端。识别双链识别双链DNADNA分子的某种特定的核苷酸序列，并分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。磷酸二酯键断开。主要是从原核生物中分离纯化出来的一种酶。主要是从原核生物中分离纯化出来的一种酶。40004000种。种。 （1 1）来源：）来源： （2 2）种类：）种类： （3 3）作用：）作用：（4 4）结

6、果：）结果： 形成两种末端形成两种末端黏性末端黏性末端平末端平末端1 1、限制性核酸内切酶、限制性核酸内切酶“分子手术刀分子手术刀”（小结）（小结） 要想获得某个目的基因必须要用限制酶切几个切口？可要想获得某个目的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性末端？一个目的基因有几个黏性末端？产生几个黏性末端？一个目的基因有几个黏性末端？要切两个切口，产生四个黏性末端，两个。要切两个切口，产生四个黏性末端，两个。 如果把两种来源不同的如果把两种来源不同的DNADNA用同一种限制酶来切割，会用同一种限制酶来切割，会怎样呢？怎样呢？ 会产生相同的黏性末端。会产生相同的黏性末端。 是不是把两者的黏性末

7、端黏合起来，这样就真的合成是不是把两者的黏性末端黏合起来，这样就真的合成 重组的重组的DNADNA分子了分子了? ? 实际还不够实际还不够, ,还需要还需要DNADNA连接酶进行连接。连接酶进行连接。思考题：思考题：1、种类：、种类：2、作用部位：、作用部位：Ecoli DNA连接酶（黏性末端）连接酶（黏性末端）T4 DNA连接酶连接酶 （黏性末端和平末端黏性末端和平末端）磷酸二酯键磷酸二酯键 DNA连接酶可把黏性末端之间的缝隙连接酶可把黏性末端之间的缝隙“缝合缝合”起来，即把梯子两边扶手的断口连接起来，这样一起来，即把梯子两边扶手的断口连接起来，这样一个重组的个重组的DNA分子就形成了。分子

8、就形成了。2 2、 DNADNA连接酶连接酶“分子缝合针分子缝合针”3 3、基因进入受体细胞的运载体基因进入受体细胞的运载体“分子运输车分子运输车”（1 1）运载体的作用）运载体的作用u作为运载工具，将外源基因作为运载工具，将外源基因( (抗虫基因抗虫基因) )转移到受体细胞转移到受体细胞( (棉花细棉花细胞胞) )中去。中去。u利用运载体在受体细胞利用运载体在受体细胞( (棉花细胞棉花细胞) )内，对外源基因内，对外源基因( (抗虫基因抗虫基因) )进进行大量复制。行大量复制。（随载体的复制而复制）（随载体的复制而复制）（2）作为运载体必须具备的条件）作为运载体必须具备的条件u 能够在宿主细

9、胞中自我复制并稳定地保存。能够在宿主细胞中自我复制并稳定地保存。u 具有一个或多个限制酶切点，以便与外源基因连接。具有一个或多个限制酶切点，以便与外源基因连接。u 具有某些标记基因，便于进行筛选。具有某些标记基因，便于进行筛选。u 必需是安全的，不会对受体必需是安全的，不会对受体 细胞有害。细胞有害。u 大小应适合，便于提取和操作大小应适合，便于提取和操作（3）常用的运载体）常用的运载体 3 3、基因进入受体细胞的运载体基因进入受体细胞的运载体“分子运输车分子运输车”u细菌细胞质的质粒细菌细胞质的质粒u噬菌体的衍生物噬菌体的衍生物u动植物病毒动植物病毒注意：真正用作运载体的质粒都注意：真正用作

10、运载体的质粒都是人工改造过的。是人工改造过的。3 3、基因进入受体细胞的运载体基因进入受体细胞的运载体“分子运输车分子运输车” 最常用的质粒是大肠杆菌的质粒，最常用的质粒是大肠杆菌的质粒，其中常含有抗药基因，如四环素的其中常含有抗药基因，如四环素的标记基因。质粒的存在与否对宿主标记基因。质粒的存在与否对宿主细胞生存没有决定性作用，但复制细胞生存没有决定性作用，但复制只能在宿主细胞内成。只能在宿主细胞内成。质粒是一种裸露的、结构简单、独质粒是一种裸露的、结构简单、独立于细菌染色体（即拟核立于细菌染色体（即拟核DNADNA）之外，）之外，并且具有自我复制能力的双链环状并且具有自我复制能力的双链环状

11、DNADNA分子。分子。质粒是基因工程最常用的运载体。质粒是基因工程最常用的运载体。（补充知识）基因的结构（补充知识）基因的结构1 1、原核细胞的基因结构、原核细胞的基因结构非编码区非编码区非编码区非编码区编码区编码区编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 与与RNARNA聚合酶结合位点聚合酶结合位点启动子启动子终止子终止子RNARNA聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，并与其结聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，并与其结合。合。转录开始后，转录开始后，RNARNA聚合酶沿聚合酶沿DNADNA分子移动，并以分子移动，并以DNADNA分子分子的一条链为模板合成的一条链为模板合成RNARNA。

12、转录完毕后，转录完毕后，RNARNA链释放出来，紧接着链释放出来，紧接着RNARNA聚合酶也从聚合酶也从DNADNA模板链上脱落下来。模板链上脱落下来。原核原核细胞细胞的基的基因结因结构构能转录相应的信使能转录相应的信使RNARNA，能编码蛋白质，能编码蛋白质 编码区编码区非编码区非编码区不能转录为信使不能转录为信使RNARNA，不能编码蛋白质。，不能编码蛋白质。有调控遗传信息表达的核苷酸序列，有调控遗传信息表达的核苷酸序列，在该序列中，最重要的是位于编码区在该序列中，最重要的是位于编码区上游的上游的RNARNA聚合酶结合位点。聚合酶结合位点。启动子启动子2 2、真核细胞的基因结构、真核细胞的

13、基因结构编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区与与RNARNA聚合酶聚合酶结合位点结合位点内含子内含子 外显子外显子 启动子启动子终止子终止子编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 能够编码蛋白质的序列叫做外显子能够编码蛋白质的序列叫做外显子 不能够编码蛋白质的序列叫做内含子不能够编码蛋白质的序列叫做内含子内含子：内含子： 外显子：外显子： 真真核核细细胞胞的的 基基因因结结构构编码区编码区非编码区非编码区外显子：能编码蛋白质的序列外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列有调控作用的核苷酸序列，包括位于编有调控作用的核苷酸序列，包括位于编码区

14、上游的码区上游的RNARNA聚合酶结合位点。聚合酶结合位点。非编码序列：非编码序列：包括非编码区和内含子包括非编码区和内含子 启动子与起始密码启动子与起始密码 原核细胞原核细胞真核细胞真核细胞不同点不同点编码区是编码区是_的的编码区是间隔的、编码区是间隔的、_的的相同点相同点都由能够编码蛋白质的都由能够编码蛋白质的_和具和具有调控作用的有调控作用的_区组成的区组成的原核细胞与真核细胞的基因结构比较原核细胞与真核细胞的基因结构比较思思考考编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？细胞与真核细胞基因结构一样长吗？连续连续不连续不连续编码区编码区

15、非编码非编码二、基因工程基本操作的四个步骤二、基因工程基本操作的四个步骤目的基因的获取目的基因的获取基因表达载体的构建基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定（一）目的基因的获取（一）目的基因的获取1 1、目的基因主要是指、目的基因主要是指_人们所需要的特定基因人们所需要的特定基因2 2、获取目的基因的常用方法、获取目的基因的常用方法（1 1）从基因文库中获取）从基因文库中获取（2 2）利用）利用PCRPCR技术扩增技术扩增（3 3）人工合成）人工合成未知序列未知序列已知序列已知序列（1 1）从基因文库中获取目的基因：）从基因文库中

16、获取目的基因：基因文库基因文库: : 将含有某种生物不同基因的许多将含有某种生物不同基因的许多DNADNA片段片段, ,导入受体菌导入受体菌的群体中储存的群体中储存, ,各个受体菌分别含有这种生物的不同的基各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因因, ,称为基因文库称为基因文库(gene library)(gene library)基因组文库基因组文库: : 基因文库中包含了一种生物所有的基因基因文库中包含了一种生物所有的基因, ,这种基因文库这种基因文库叫做基因组文库叫做基因组文库. .部分基因文库部分基因文库: : 基因文库中包含了一种生物的一部分基因基因文库中包含了一种生物的一部分基因,

17、,这种基因文这种基因文库叫做部分基因文库库叫做部分基因文库. .基因组文库和部分基因文库基因组文库和部分基因文库(cDNA文库文库)比较比较 概念：概念：PCRPCR全称为全称为_，是在生物，是在生物_复制复制_的核酸合成技术的核酸合成技术 条件：条件：_、 _、_ _ 、 _ _ 等等 前提条件：前提条件： 。原理：原理：_方式：以方式：以_方式扩增，即方式扩增，即_（n n为扩增循环的次数）为扩增循环的次数）结果：结果：多聚酶链式反应多聚酶链式反应体外体外特定特定DNADNA片段片段DNADNA复制复制已知基因的核苷酸序列已知基因的核苷酸序列四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸一对引物一对引物热稳

18、定热稳定DNADNA聚合酶聚合酶指数指数2 2n n使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增(2)(2)利用利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因双链的解开双链的解开过程：过程：a a、DNADNA变性（变性（90-9590-95）：）：双链双链DNADNA模板在热作用下，模板在热作用下，_断裂，形成断裂，形成_b b、退火（复性、退火（复性55-6055-60）：）：系统温度降低，引物与系统温度降低，引物与DNADNA模板结合，形成局部模板结合，形成局部_。 c c、延伸（、延伸（70-7570-75）：）：在在TaqTaq酶的作用下，从引物

19、的酶的作用下，从引物的55端端33端延伸，合成端延伸，合成与模板互补的与模板互补的_。 氢键氢键单链单链DNADNA双链双链DNADNA链链（3）人工合成）人工合成反转录法：反转录法： 以目的基因转录成的以目的基因转录成的信使信使RNARNA为模板，反转录成为模板，反转录成互补的单链互补的单链DNADNA，然后在酶，然后在酶的作用下合成双链的作用下合成双链DNADNA，从，从而获得所需的基因。而获得所需的基因。目的基因的目的基因的mRNAmRNA杂交双链杂交双链( (单链单链RNA/RNA/单链单链DNA)DNA)单链单链DNADNA反转录酶反转录酶DNADNA聚合酶聚合酶双链双链DNADNA

20、( (目的基因目的基因) )（3）人工合成）人工合成根据已知的氨基酸序列合成根据已知的氨基酸序列合成DNADNA法法 ： 根据已知蛋白质的根据已知蛋白质的氨基酸序列，推测出相氨基酸序列，推测出相应的信使应的信使RNARNA序列，然序列，然后按照碱基互补配对原后按照碱基互补配对原则，推测出它的结构基则，推测出它的结构基因的核苷酸序列，再通因的核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷过化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。酸为原料合成目的基因。蛋白质的氨基酸序列蛋白质的氨基酸序列mRNAmRNA的核苷酸序列的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列推测推测推测推测目的基因目的基因化学合成化

21、学合成1.1.用一定的用一定的_切割切割 质粒，使其出现一个切质粒，使其出现一个切 口，露出口，露出_。2.2.用用_切断目切断目 的基因，使其产生的基因，使其产生_ _ _。二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建 核心核心3.3.将切下的目的基因片段插入将切下的目的基因片段插入质粒的质粒的_处，再加入适量处，再加入适量_，形成了一个重组，形成了一个重组 DNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）限制酶限制酶黏性末端黏性末端同一种限制酶同一种限制酶的黏性末端的黏性末端切口切口DNADNA连接酶连接酶相同相同4.一个基因表达载体的组成，除了目的一个基因表达载体的组成，除了目的基因外，还必

22、须有基因外，还必须有、以、以及及等。等。启动子启动子终止子终止子标记基因标记基因质粒质粒DNADNA分子分子一个切口一个切口两个黏性末端两个黏性末端两个切口两个切口获得目的基因获得目的基因DNADNA连接酶连接酶重组重组DNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）限制酶处理限制酶处理同一种同一种4.4.过程过程: :（二）基因表达载体的构建（二）基因表达载体的构建 核心核心5.5.基因表达载体的组成：基因表达载体的组成：复制原点复制原点+ +目的基因目的基因+ +启动子启动子+ +终止子终止子+ +标记基因标记基因（二）基因表达载体的构建（二）基因表达载体的构建 核心核心启动子：位于基因的首端

23、的一段特殊启动子：位于基因的首端的一段特殊的的DNA片断，它是片断，它是RNA聚合酶识别和聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转结合的部位，有了它才能驱动基因转录出录出mRNA，最终获得蛋白质，最终获得蛋白质终止子：位于基因的尾端的一段特殊终止子：位于基因的尾端的一段特殊的的DNADNA片断，能终止片断，能终止mRNAmRNA的转录的转录标记基因的作用是为了鉴别受体细胞标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来基因的细胞筛选出来( (三三) )将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞转化转化 方法方法将目的基因导

24、入将目的基因导入植物细胞植物细胞将目的基因导入将目的基因导入动物细胞动物细胞将目的基因导入将目的基因导入微生物细胞微生物细胞农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法显微注射法显微注射法感受态细胞感受态细胞目的基因进入目的基因进入_内，并且在受体细内，并且在受体细胞内维持胞内维持_和和_的过程的过程受体细胞受体细胞稳定稳定表达表达( (三三) )将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞1 1、将目的基因导入植物细胞的方法：、将目的基因导入植物细胞的方法： 农杆菌转化法农杆菌转化法（1 1）农杆菌转化法）农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法农杆菌介绍农杆

25、菌介绍:Ti质粒上有质粒上有T-DNA,称为可转移的称为可转移的DNA,它可转移到受体细它可转移到受体细胞胞,并整合到受体细并整合到受体细胞染色体胞染色体DNA上上.2 2、将目的基因导入动物细胞、将目的基因导入动物细胞( (受精卵受精卵) )显微注射法显微注射法 -世界上第一例世界上第一例“超级小鼠超级小鼠”的成功的成功设备设备: :显微注射仪显微注射仪3 3、将目的基因导入微生物细胞、将目的基因导入微生物细胞( (三三) )将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞原核生物的特点：原核生物的特点：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少等繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少等过程：过程：用用

26、Ca2+ 处理细胞处理细胞,以增大细菌细胞壁的通透性以增大细菌细胞壁的通透性,使细胞处于一种使细胞处于一种能吸收周围环境中能吸收周围环境中DNA分子的生理状态分子的生理状态,这种细胞称为感受态细胞这种细胞称为感受态细胞.是将是将重组表达载体重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合,在在一定的温度下促进感受态细胞吸收一定的温度下促进感受态细胞吸收DNADNA分子分子, ,完成转化过程完成转化过程. .目的基因在受体细胞内，随其繁殖而复制目的基因在受体细胞内，随其繁殖而复制，由于细菌繁殖的速度，由于细菌繁殖的速度非常快，在很短的时间内就能获得大量的目的基因

27、。非常快，在很短的时间内就能获得大量的目的基因。( (四四) )目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定检查是否成功检查是否成功通过目的基因上的标记基因，进行筛选和检测通过目的基因上的标记基因，进行筛选和检测 导入过程完成后，全部受体细胞都能摄入导入过程完成后，全部受体细胞都能摄入重组重组DNADNA分子吗？分子吗？真正能摄入重组真正能摄入重组DNADNA分子的受体细胞很少。分子的受体细胞很少。 所以要对受体细胞作怎样的处理？所以要对受体细胞作怎样的处理？对受体细胞中是否导入了目的基因进行检测对受体细胞中是否导入了目的基因进行检测 怎样进行检测？怎样进行检测？DNADNA分子杂交示意图分子杂交

28、示意图 采用一定的技术手段，将两种生物的采用一定的技术手段，将两种生物的DNADNA分子的单分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。的单链。 ( (四四) )目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定检查是否成功检查是否成功检测检测鉴定鉴定检测转基因生物染色体的检测转基因生物染色体的DNADNA上是否插入了目的基因上是否插入了目的基因检测目的基因是

29、否转录出了检测目的基因是否转录出了mRNAmRNA检测目的基因是否翻译成蛋白质检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等过程过程:A.首先取出转基因生物的基因组首先取出转基因生物的基因组DNAB.用含目的基因的用含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作标记片段用放射性同位素等作标记,以此做探针以此做探针C.使探针和转基因生物的基因组杂交使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带若显示出杂交带,表明染色体已插入染色体表明染色体已插入染色体DNA中中方法方法: : DNADNA分子杂交分子杂交方法方法: : 分分 子子 杂杂 交交方法方法: : 抗

30、原抗体杂交抗原抗体杂交过程过程:用上述探针和转基因生物的用上述探针和转基因生物的mRNA杂交杂交,若出现杂若出现杂交带交带,表明目的基因转录出了表明目的基因转录出了mRNA.为保证目的基因得到有效利用，通常用大量的受为保证目的基因得到有效利用，通常用大量的受体细胞来接受不多的目的基因。这样，处理的受体细体细胞来接受不多的目的基因。这样，处理的受体细胞中真正摄入了目的基因的很少，必须将它从中检测胞中真正摄入了目的基因的很少，必须将它从中检测出来。出来。无表达产物无表达产物无表达产物无表达产物有表达产物有表达产物无表达产物无表达产物细菌的检测，将每个受体细胞单独培养形成菌落，细菌的检测，将每个受体

31、细胞单独培养形成菌落，检测菌落中是否有目的基因的表达产物。淘汰无表达产检测菌落中是否有目的基因的表达产物。淘汰无表达产物的菌落，保留有表达产物的进一步培养、研究。物的菌落，保留有表达产物的进一步培养、研究。多细胞生物的检测，将每个受体细胞单独培多细胞生物的检测，将每个受体细胞单独培养并诱导发育成完整个体，检测这些个体是否摄养并诱导发育成完整个体，检测这些个体是否摄入目的基因，摄入的基因是否表达（是否表现出入目的基因，摄入的基因是否表达（是否表现出相应的性状）。淘汰无变化的个体，保留有相应相应的性状）。淘汰无变化的个体，保留有相应变化的个体进一步培养、研究。变化的个体进一步培养、研究。例：用棉铃

32、饲喂棉例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。抗虫基因并得到表达。苏云金杆菌苏云金杆菌基基因因工工程程的的基基本本操操作作程程序序目的基因的获取目的基因的获取基因表达载体的构建基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定1、从基因文库中获取目的基因、从基因文库中获取目的基因2、利用、利用PCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因3、化学方法人工合成

33、、化学方法人工合成复制原点复制原点 + + 目的基因目的基因 + + 启动子启动子 + + 终止子终止子 + + 标记基因标记基因农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法、显微注射法、农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法、显微注射法、CaCa2+2+处理法处理法DNADNA分子杂交技术、分子杂交技术、抗原分子杂交技术、分子杂交技术、抗原抗体杂交技术抗体杂交技术分子检测外的个体水平鉴定分子检测外的个体水平鉴定三、基因工程的应用三、基因工程的应用1 1、抗虫转基因植物、抗虫转基因植物方法：方法： 从某些生物中分离出具有杀虫活性的从某些生物中分离出具有杀虫活性的基因，将其导入农作物中，使其具有基因，将其

34、导入农作物中，使其具有抗虫性抗虫性BtBt毒蛋白基因、蛋白酶抑制剂基因、淀粉酶抑制剂基因、植物凝集毒蛋白基因、蛋白酶抑制剂基因、淀粉酶抑制剂基因、植物凝集素基因等素基因等（一）植物基因工程硕果累累（一）植物基因工程硕果累累2、抗病转基因生物、抗病转基因生物目的基因包括：目的基因包括：病毒外壳蛋白基因、病毒的复制酶基因、抗真菌转基因植物中的有病毒外壳蛋白基因、病毒的复制酶基因、抗真菌转基因植物中的有几丁质酶基因和抗毒素合成基因几丁质酶基因和抗毒素合成基因3 3、抗逆转基因作物、抗逆转基因作物4 4、利用转基因改良植物的品质、利用转基因改良植物的品质方法：方法：将必需氨基酸含量多的蛋白质编码基因，

35、导入植物中，或者将必需氨基酸含量多的蛋白质编码基因，导入植物中，或者改变这些氨基酸合成途径中某种酶的活性。改变这些氨基酸合成途径中某种酶的活性。1 1、用于提高动物生长速度、用于提高动物生长速度2 2、用于改善畜产品的品质、用于改善畜产品的品质目的基因：目的基因：生长激素基因生长激素基因（二）动物基因工程前景广阔（二）动物基因工程前景广阔举例举例:将将肠乳糖酶基因肠乳糖酶基因导入导入奶牛基因组奶牛基因组，获得转基因牛，其他营养，获得转基因牛，其他营养不变的情况下，乳糖含量大大降低。不变的情况下，乳糖含量大大降低。3 3、用转基因动物生产药物、用转基因动物生产药物-动物乳腺生物反应器动物乳腺生物

36、反应器获取目的基因获取目的基因（例如血清蛋白基因）（例如血清蛋白基因）构建基因表达载体构建基因表达载体（在血清白蛋白基因前（在血清白蛋白基因前加特异表达的启动子）加特异表达的启动子）显微注射导入哺乳显微注射导入哺乳动物受精卵中动物受精卵中形成胚胎形成胚胎将胚胎送入母体动物将胚胎送入母体动物发育成转基因动物（只有在产下的雌性动物个体中，转入发育成转基因动物（只有在产下的雌性动物个体中，转入的基因才能表达）的基因才能表达）4、用转基因动物作器官移植的供体、用转基因动物作器官移植的供体供体动物：供体动物：存在的难题：存在的难题：解决方法：解决方法：猪猪免疫排斥免疫排斥将供体基因组导入某种基因调节因子

37、，以抑制抗原将供体基因组导入某种基因调节因子，以抑制抗原决定基因的表达，或设法除去抗原决定基因，再结决定基因的表达，或设法除去抗原决定基因，再结合克隆技术，培育出没有免疫排斥反应的转基因克合克隆技术，培育出没有免疫排斥反应的转基因克隆猪器官。隆猪器官。（三）、基因工程药品异军突起（三）、基因工程药品异军突起工程菌：用基因工程的方法，使外源基因得到高效率表达的菌类细工程菌：用基因工程的方法，使外源基因得到高效率表达的菌类细胞株系。胞株系。我国已生产的产品我国已生产的产品：白细胞介素白细胞介素-2、干扰素、乙肝疫苗等、干扰素、乙肝疫苗等（四）基因诊断和基因治疗（四）基因诊断和基因治疗基因诊断基因诊

38、断定义：基因诊断是用放射性同位素定义：基因诊断是用放射性同位素( (如如3232P)P)、荧光分子等、荧光分子等标记的标记的DNADNA分子做探针，利用分子做探针，利用DNADNA分子杂交原理，鉴定被检分子杂交原理，鉴定被检测标本上的遗传信息，达到检测疾病的目的。测标本上的遗传信息，达到检测疾病的目的。 生物芯片生物芯片 从正常人的基因组中分离出从正常人的基因组中分离出DNA与与DNA芯片杂交就可以得出芯片杂交就可以得出标准图谱。从病人的基因组中分离出标准图谱。从病人的基因组中分离出DNA与与DNA芯片杂交就可芯片杂交就可以得出病变图谱。以得出病变图谱。 通过比较、分析这两种图谱，就可以得出病

39、变的通过比较、分析这两种图谱，就可以得出病变的DNA信息。信息。 基因芯片诊断技术以其快速、高效、敏感、经济、平行化、自基因芯片诊断技术以其快速、高效、敏感、经济、平行化、自动化等特点，将成为一项现代化诊断新技术。动化等特点，将成为一项现代化诊断新技术。 1、体外基因治疗：、体外基因治疗：2、体内基因治疗：、体内基因治疗：从病人体内获得某种细胞，进行培养，从病人体内获得某种细胞，进行培养，然后，在体外完成基因转移，然后，在体外完成基因转移，再筛选成功转移的细胞扩增培养，再筛选成功转移的细胞扩增培养，最后重新输入患者体内。最后重新输入患者体内。直接向人体组织细胞中转移基因的治直接向人体组织细胞中

40、转移基因的治病方法。病方法。用于基因治疗的基因种类用于基因治疗的基因种类A.A.从健康人体上分离得到的功能正常的基因，用以取代病变基因，从健康人体上分离得到的功能正常的基因，用以取代病变基因，或依靠其表达产物。或依靠其表达产物。B.B.反义基因。即通过产生的反义基因。即通过产生的mRNAmRNA分子，与病变基因产生的分子，与病变基因产生的mRNAmRNA进行进行互补，来阻断蛋白质合成。互补，来阻断蛋白质合成。C.C.编码可以杀死癌变细胞的蛋白酶基因，又叫做自杀基因。编码可以杀死癌变细胞的蛋白酶基因，又叫做自杀基因。（四）基因诊断和基因治疗（四）基因诊断和基因治疗基因治疗基因治疗1 1、环境监测

41、、环境监测 基因工程做成的基因工程做成的DNADNA探针能够十分灵敏地检测环境中探针能够十分灵敏地检测环境中的病毒、细菌等污染。的病毒、细菌等污染。 利用基因工程培育的利用基因工程培育的“指示生物指示生物”能十分灵敏地反能十分灵敏地反映环境污染的情况，却不易因环境污染而大量死亡，甚映环境污染的情况，却不易因环境污染而大量死亡，甚至还可以吸收和转化污染物。至还可以吸收和转化污染物。2 2、环境污染治理、环境污染治理基因工程做成的基因工程做成的“超级细菌超级细菌”能吞食和分解多种污能吞食和分解多种污染环境的物质。染环境的物质。（五）基因工程与环境保护（五）基因工程与环境保护纠错笔记纠错笔记五种酶的

42、比较五种酶的比较 项目项目种类种类作用底作用底物物作用部位作用部位作用结果作用结果限制酶限制酶DNA分分子子磷酸二酯键磷酸二酯键形成粘性末端形成粘性末端或平末端或平末端DNA连接连接酶酶DNA分分子片段子片段磷酸二酯键磷酸二酯键形成重组形成重组DNA分子分子 项目项目种类种类作用底作用底物物作用部位作用部位作用结果作用结果DNA聚合聚合酶酶脱氧核脱氧核苷酸苷酸磷酸二酯键磷酸二酯键形成新的形成新的DNA分子分子DNA(水解水解)酶酶DNA分分子子磷酸二酯键磷酸二酯键形成脱氧核苷形成脱氧核苷酸酸DNA解旋解旋酶酶DNA分分子子碱基对间的碱基对间的氢键氢键形成单链形成单链DNA分子分子四、蛋白质工程

43、四、蛋白质工程(一一)蛋白质工程崛起的缘由蛋白质工程崛起的缘由、基因工程、基因工程（）基因工程的实质：（）基因工程的实质：将一种生物的基因转移到另一种生物体内，使后者产生本身不能将一种生物的基因转移到另一种生物体内，使后者产生本身不能产生的蛋白质，从而表现出新的性状。产生的蛋白质，从而表现出新的性状。（）基因工程的不足：（）基因工程的不足：在原则上只能产生自然界已存在的蛋白质。在原则上只能产生自然界已存在的蛋白质。、天然蛋白质的不足、天然蛋白质的不足天然蛋白质的结构和功能符合特定物种生存的需要，却不一定完天然蛋白质的结构和功能符合特定物种生存的需要，却不一定完全符合人类生产和生活的需要。全符合

44、人类生产和生活的需要。 在已研究过的几千种酶中，只有极少数可以应用于在已研究过的几千种酶中，只有极少数可以应用于工业生产，绝大多数酶都不能应用于工业生产，这些酶虽工业生产，绝大多数酶都不能应用于工业生产，这些酶虽然在自然状态下有活性，但在工业生产中没有活性或活性然在自然状态下有活性，但在工业生产中没有活性或活性很低。这是因为工业生产中每一步的反应体系中常常会有很低。这是因为工业生产中每一步的反应体系中常常会有酸、碱或有机溶剂存在，反应温度较高，在这种条件下，酸、碱或有机溶剂存在，反应温度较高，在这种条件下，大多数酶会很快变性失活。提高蛋白质的稳定性是工业生大多数酶会很快变性失活。提高蛋白质的稳

45、定性是工业生产中一个非常重要的课题。产中一个非常重要的课题。一般来说，提高蛋白质的稳定性包括：一般来说，提高蛋白质的稳定性包括：1、延长酶的半衰期、延长酶的半衰期2、提高酶的热稳定性、提高酶的热稳定性3、延长药用蛋白的保存期、延长药用蛋白的保存期4、抵御由于重要氨基酸氧化引起的活性丧失等。、抵御由于重要氨基酸氧化引起的活性丧失等。（二）蛋白质工程的概念（二）蛋白质工程的概念通过物理化学与生物化学等技术了解蛋白质的结构与功通过物理化学与生物化学等技术了解蛋白质的结构与功能，并借助计算机辅助设计、基因定点诱变和重组能，并借助计算机辅助设计、基因定点诱变和重组技术改造基因，以定向改造天然蛋白质，甚至

46、创造自然界技术改造基因，以定向改造天然蛋白质，甚至创造自然界不存在的蛋白质的技术。其中基因工程是关键技术，因此不存在的蛋白质的技术。其中基因工程是关键技术，因此蛋白质工程又被称为第二代基因工程。蛋白质工程又被称为第二代基因工程。基础基础:以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础手段手段:基因修饰或基因合成：基因修饰或基因合成：借助计算机辅助设计、基因定点诱变和重组技术借助计算机辅助设计、基因定点诱变和重组技术目的目的:对现有蛋白质进行改造对现有蛋白质进行改造,或制造一种新的蛋白质或制造一种新的蛋白质,以满足人类生以满足人类生产和生活的

47、需要。产和生活的需要。蛋白质工程的主要步骤通常包括：蛋白质工程的主要步骤通常包括：（1 1）从生物体中分离纯化目的蛋白；）从生物体中分离纯化目的蛋白；（2 2）测定其氨基酸序列；）测定其氨基酸序列；（3 3）借助核磁共振和）借助核磁共振和X X射线晶体衍射等手段，尽可能地了解蛋射线晶体衍射等手段，尽可能地了解蛋白质的二维重组和三维晶体结构白质的二维重组和三维晶体结构; ;（4 4）设计各种处理条件，了解蛋白质的结构变化，包括折叠与去）设计各种处理条件，了解蛋白质的结构变化，包括折叠与去折叠等对其活性与功能的影响；折叠等对其活性与功能的影响；（5 5）设计编码该蛋白的基因改造方案，如点突变；）设

48、计编码该蛋白的基因改造方案，如点突变；（6 6）分离、纯化新蛋白，功能检测后投入实际使用。）分离、纯化新蛋白，功能检测后投入实际使用。一级结构(二二)蛋白质工程的基本原理蛋白质工程的基本原理蛋白质的一级结构，专指多肽链蛋白质的一级结构，专指多肽链中氨基酸（残基）的排列的序列中氨基酸（残基）的排列的序列（sequence）。）。二级结构(二二)蛋白质工程的基本原理蛋白质工程的基本原理三级结构四级结构(二二)蛋白质工程的基本原理蛋白质工程的基本原理、蛋白质工程的原理、蛋白质工程的原理（1）了解蛋白质的结构）了解蛋白质的结构方法：自动化测序快速测定大量蛋白质分子的一级结构用射线晶方法：自动化测序快速

49、测定大量蛋白质分子的一级结构用射线晶体衍射法测定三维空间结构，用核磁共振法了解其构象。体衍射法测定三维空间结构，用核磁共振法了解其构象。 （2）改造类型）改造类型 ：大改、中改和小改。：大改、中改和小改。大改：根据氨基酸性质和特点，设计并制造出自然界不存在的全新大改：根据氨基酸性质和特点，设计并制造出自然界不存在的全新蛋白质，使之具有特定的氨基酸序列、空间结构和预期功能。蛋白质，使之具有特定的氨基酸序列、空间结构和预期功能。中改：是指蛋白质分子中替代某一个肽段或一个特定的结构域。中改：是指蛋白质分子中替代某一个肽段或一个特定的结构域。小改：通过基因工程中的定点诱变技术，有目的地改造蛋白质的性小

50、改：通过基因工程中的定点诱变技术，有目的地改造蛋白质的性质和功能。（定点诱变技术是改变蛋白质的核心技术之一。）质和功能。（定点诱变技术是改变蛋白质的核心技术之一。）(二二)蛋白质工程的基本原理蛋白质工程的基本原理基因定点诱变技术的理解基因定点诱变技术的理解(苏教版苏教版)项目项目内容内容条条件件原料原料酶酶引物引物能量能量 操作方法操作方法 法法结果结果适应范围适应范围后代中半数为诱变的分子后代中半数为诱变的分子脱氧核苷酸脱氧核苷酸聚合酶和连接酶聚合酶和连接酶含突变顺序的分子片段含突变顺序的分子片段空间结构完全清楚的蛋白质空间结构完全清楚的蛋白质思考：基因定点诱变技术与基因突变的比较思考：基因