1、Founded in 18951/56第第3讲讲 基因工程在环境污染治理中的应用基因工程在环境污染治理中的应用Founded in 18952/561 基因工程基因工程 基因工程是在分子水平上对生物遗传特性进行人为干预，对基因工程是在分子水平上对生物遗传特性进行人为干预，对生物基因进行改造，利用生物生产人们需要的特殊产品生物基因进行改造，利用生物生产人们需要的特殊产品 理论上的三大发现理论上的三大发现 上世纪上世纪40年代，发现生物的遗传物质是年代，发现生物的遗传物质是DNA：Avery肺炎双球菌转化肺炎双球菌转化实验实验 50年代，发现年代，发现DNA的双螺旋结构的双螺旋结构 60年代，确立
2、遗传信息的传递方式：操作子学说，密码子破译年代，确立遗传信息的传递方式：操作子学说，密码子破译 技术上的三大发明技术上的三大发明 工具酶：核酸内切酶，连接酶工具酶：核酸内切酶，连接酶 载体：质粒载体：质粒 逆转录酶：打破中心法则逆转录酶：打破中心法则 1973年，完成了年，完成了DNA的体外重组的体外重组并成功转化并成功转化 Founded in 18953/56分子生物学基础分子生物学基础 DNA即脱氧核糖核酸，携带决定生物遗传，细胞分即脱氧核糖核酸，携带决定生物遗传，细胞分裂、分化、生长以及蛋白质生物合成等生命信息裂、分化、生长以及蛋白质生物合成等生命信息 DNA分子的基本单位是脱氧核糖核
3、苷酸，由碱基、分子的基本单位是脱氧核糖核苷酸，由碱基、脱氧核糖和磷酸基三部分组成脱氧核糖和磷酸基三部分组成 碱基有四种：碱基有四种：A、G、C、T Founded in 18954/56 碱基携带遗传信息，碱基携带遗传信息，糖和磷酸基起结构作糖和磷酸基起结构作用用 DNA分子的骨架由磷分子的骨架由磷酸二酯键连接的多个酸二酯键连接的多个脱氧核糖组成脱氧核糖组成 一个脱氧核糖核苷酸一个脱氧核糖核苷酸中五碳糖的中五碳糖的3羟基，羟基，通过一个磷酸二酯键通过一个磷酸二酯键与邻近五碳糖的与邻近五碳糖的5磷磷酸基相连酸基相连 Founded in 18955/56DNA的结构的结构 双螺旋结构的要点双螺旋
4、结构的要点 两链平行反向且右两链平行反向且右旋旋 碱基以氢键互补配碱基以氢键互补配对，对，A=T，GC 螺旋每周含螺旋每周含10个碱个碱基对，每周垂直升基对，每周垂直升高高340nm，螺旋直，螺旋直径径200nm 核主链在螺旋外侧，核主链在螺旋外侧，碱基对平面在内侧碱基对平面在内侧且与主链垂直且与主链垂直 Founded in 18956/56 双螺旋模型可以解释双螺旋模型可以解释 细胞减数分裂与有性生殖：配子与受精卵的形成细胞减数分裂与有性生殖：配子与受精卵的形成 个体发育：受精卵的发育个体发育：受精卵的发育 遗传与变异：碱基序列的保守性、可变性遗传与变异：碱基序列的保守性、可变性 性状控制
5、：蛋白质的生物合成性状控制：蛋白质的生物合成 双螺旋模型的补充双螺旋模型的补充 DNA分子双链可以左旋：分子双链可以左旋：Z-DNA DNA分子每圈碱基数具可变性：分子每圈碱基数具可变性：A-DNA 发现三股发现三股DNA 超螺旋结构普遍存在超螺旋结构普遍存在 Founded in 18957/56碱基配对碱基配对 一条链中的一条链中的A与另一条链中的与另一条链中的T配对，配对，G与与C配对，两配对，两条链中的碱基序列总是互补的条链中的碱基序列总是互补的 Founded in 18958/56DNA的复制的复制 从复制起始点开始从复制起始点开始 半保留复制：两条链半保留复制：两条链均可作为新链
6、合成的均可作为新链合成的模板模板 半不连续复制：半不连续复制：DNA序列的方向性序列的方向性 高度的忠实性：自我高度的忠实性：自我校正校正 多种酶和蛋白因子协多种酶和蛋白因子协同有序作用同有序作用 Founded in 18959/56DNA的变性、复性与杂交的变性、复性与杂交 加热或某些试剂可使加热或某些试剂可使DNA碱基间的氢键破坏，双链碱基间的氢键破坏，双链发生分离，此过程称为变性发生分离，此过程称为变性 变性变性DNA在一定条件下能恢复双螺旋结构，此过程在一定条件下能恢复双螺旋结构，此过程成为复性成为复性 Founded in 189510/56 G+C含量高的含量高的DNA比较稳定，
7、环状比较稳定，环状DNA比线状稳定比线状稳定 Tm值：熔点，值：熔点，DNA发生半数变性时的温度发生半数变性时的温度 通过测定通过测定DNA的的Tm值，可以计算其值，可以计算其G+C含量含量 DNA的复性速度跟其分子大小、复杂程度、浓度、离子强度、的复性速度跟其分子大小、复杂程度、浓度、离子强度、温度等因素有关温度等因素有关 Founded in 189511/56DNA的杂交的杂交 复性的复性的DNA分子由不同来源的两个单链分子由不同来源的两个单链DNA分子形分子形成，称为杂交成，称为杂交 互补的碱基序列即可发生杂交，一定条件下也可发互补的碱基序列即可发生杂交，一定条件下也可发生少量的偏差（
8、错配、缺失）生少量的偏差（错配、缺失） 利用分子杂交可以求出特定基因的频率、异源利用分子杂交可以求出特定基因的频率、异源DNA的相似程度，研究基因组织、基因定位的相似程度，研究基因组织、基因定位 分子杂交广泛应用于生物工程、核酸结构分析及功分子杂交广泛应用于生物工程、核酸结构分析及功能探讨中，也是研究分子遗传学的重要手段能探讨中，也是研究分子遗传学的重要手段 Founded in 189512/56中心法则中心法则 除某些病毒外，大多数生物将其遗传信息储存在除某些病毒外，大多数生物将其遗传信息储存在DNA分子中，分子中，功能的实现必须通过蛋白质功能的实现必须通过蛋白质 DNA通过自我通过自我复
9、制复制将遗传信息代代相传，并通过将遗传信息代代相传，并通过RNA将其传将其传给蛋白质给蛋白质 利用利用DNA为模板合成为模板合成RNA的过程叫的过程叫转录转录 利用利用RNA为模板合成蛋白质的过程叫为模板合成蛋白质的过程叫翻译翻译 Founded in 189513/56逆转录逆转录 以以RNA为模板在逆转录酶（依赖于为模板在逆转录酶（依赖于RNA的的DNA聚合聚合酶）催化下合成酶）催化下合成DNA的过程成为逆转录的过程成为逆转录 逆转录和逆转录酶的发现，实现了以真核逆转录和逆转录酶的发现，实现了以真核mRNA为为模板，通过逆转录而获得为特定蛋白质编码的基因模板，通过逆转录而获得为特定蛋白质编
10、码的基因 利用逆转录酶所建立的利用逆转录酶所建立的cDNA文库为基因的分离和重文库为基因的分离和重组提供了重要手段组提供了重要手段 Founded in 189514/56基因工程概要基因工程概要 基因工程又称基因工程又称DNA重组技术，是在分子水平上对基重组技术，是在分子水平上对基因进行操作的复杂技术，其实施的四个必要条件是：因进行操作的复杂技术，其实施的四个必要条件是：工具酶工具酶，基因基因，载体载体，受体细胞受体细胞 基因工程的特征基因工程的特征 外源核酸分子在寄主生物中能够表达外源核酸分子在寄主生物中能够表达 确定的确定的DNA小片段在寄主细胞中能够大量扩增小片段在寄主细胞中能够大量扩
11、增 基因工程包括基因的分离、重组、转移以及基因在基因工程包括基因的分离、重组、转移以及基因在受体细胞内的保持、转录、翻译表达等全过程受体细胞内的保持、转录、翻译表达等全过程 Founded in 189515/56基因工程的实验步骤基因工程的实验步骤 带有目的基因的带有目的基因的DNA片片段的获取段的获取 在体外将带有目的基因在体外将带有目的基因的的DNA片段连接到载体片段连接到载体上，形成重组上，形成重组DNA分子分子 重组重组DNA分子导入受体分子导入受体细胞细胞 带有重组体的细胞扩增带有重组体的细胞扩增 重组体的筛选重组体的筛选 Founded in 189516/56基因工程工具酶基因
12、工程工具酶 把把DNA分子切割、分子切割、DNA片段修饰和片段修饰和DNA片段连接等片段连接等所需的酶成为工具酶所需的酶成为工具酶 根据其用途可分为三大类根据其用途可分为三大类 限制性内切酶：识别和切割限制性内切酶：识别和切割dsDNA分子内特殊核苷酸顺序分子内特殊核苷酸顺序的酶，通过水解的酶，通过水解DNA分子骨架的磷酸二酯键，将完整的分子骨架的磷酸二酯键，将完整的DNA分子切开分子切开 连接酶：将两段乃至数段连接酶：将两段乃至数段DNA片段拼接起来的酶，催化磷片段拼接起来的酶，催化磷酸二酯键的形成酸二酯键的形成 修饰酶：包括修饰酶：包括DNA聚合酶、逆转录酶、聚合酶、逆转录酶、T4多核苷酸
13、酶、碱多核苷酸酶、碱性磷酸酶等性磷酸酶等 Founded in 189517/56限制性内切酶的作用限制性内切酶的作用Founded in 189518/56T4DNA酶的连接原理酶的连接原理Founded in 189519/56基因工程载体基因工程载体 能够独立于宿主细胞染色体之外复制的能够独立于宿主细胞染色体之外复制的DNA片段即片段即是载体是载体 载体能将外源载体能将外源DNA片段带入受体细胞，并决定外源片段带入受体细胞，并决定外源基因的复制、扩增、传代乃至表达基因的复制、扩增、传代乃至表达 常见的载体有质粒和病毒常见的载体有质粒和病毒 天然质粒和病毒要加以改造，增加耐药性基因片段，天
14、然质粒和病毒要加以改造，增加耐药性基因片段，以利于提高基因的转化、筛选和表达效率以利于提高基因的转化、筛选和表达效率 Founded in 189520/56载体的必备条件载体的必备条件 能够进入宿主细胞：个体小，不具备独立生存的能能够进入宿主细胞：个体小，不具备独立生存的能力力 在宿主细胞中能够独立复制，即本身是一个复制子：在宿主细胞中能够独立复制，即本身是一个复制子：插入外源插入外源DNA片段的大小和数量不能破坏载体的复片段的大小和数量不能破坏载体的复制能力，载体要实现多拷贝制能力，载体要实现多拷贝 要有筛选标记：抗药性要有筛选标记：抗药性 对多种限制酶有单一或较少的切点对多种限制酶有单一
15、或较少的切点 随着随着DNA重组技术的改进，引入外源重组技术的改进，引入外源DNA进入宿主进入宿主的方法有改进，已经突破了原有的大小限制；选择的方法有改进，已经突破了原有的大小限制；选择标记也可以被杂交技术、免疫学技术等替代标记也可以被杂交技术、免疫学技术等替代 Founded in 189521/56载体的分类载体的分类 克隆载体：是以繁殖克隆载体：是以繁殖DNA片段为目的的载体，复制力强，拷片段为目的的载体，复制力强，拷贝数高贝数高 穿梭载体：既能在真核细胞中繁殖又能在原核细胞中繁殖，穿梭载体：既能在真核细胞中繁殖又能在原核细胞中繁殖，具有真核和原核两种复制点，常用于真核生物具有真核和原核
16、两种复制点，常用于真核生物DNA片段在原片段在原核生物中的繁殖，然后再转入真核细胞宿主核生物中的繁殖，然后再转入真核细胞宿主 表达载体：能够在宿主中进行高效表达表达载体：能够在宿主中进行高效表达 理想情况：拷贝数高，具有强启动子和稳定的理想情况：拷贝数高，具有强启动子和稳定的mRNA，具有，具有高的分离稳定性和结构稳定性，转化频率高，宿主范围广，高的分离稳定性和结构稳定性，转化频率高，宿主范围广，插入外源基因容量大而且可以重新完整的切除，复制与转录插入外源基因容量大而且可以重新完整的切除，复制与转录应和宿主相匹配，最好是可调控的，而且在宿主不生长或低应和宿主相匹配，最好是可调控的，而且在宿主不
17、生长或低生长速率的情况下，仍能高水平的表达目的基因生长速率的情况下，仍能高水平的表达目的基因 Founded in 189522/56常用的载体常用的载体 质粒：环状双链小型质粒：环状双链小型DNA分子，可用于细菌细胞，分子，可用于细菌细胞，也可用于动植物细胞也可用于动植物细胞 噬菌体：常用于细菌细胞噬菌体：常用于细菌细胞 病毒：常用于动物细胞病毒：常用于动物细胞 粘粒：由质粒和噬菌体结合构建成的一种大容量克粘粒：由质粒和噬菌体结合构建成的一种大容量克隆载体隆载体 Founded in 189523/56用于原核生物宿主的载体用于原核生物宿主的载体质粒质粒 质粒是能自主复制的双链环状质粒是能自
18、主复制的双链环状DNA分子，在细菌中分子，在细菌中独立于染色体存在，其复制和遗传独立，但依赖于独立于染色体存在，其复制和遗传独立，但依赖于宿主所编码的蛋白质和酶宿主所编码的蛋白质和酶 pUC 19pUC 19的结构图谱的结构图谱 pBR 322pBR 322的结构图谱的结构图谱 Founded in 189524/56外源基因克隆如质粒载体的过程外源基因克隆如质粒载体的过程Founded in 189525/56用于原核生物宿主的载体用于原核生物宿主的载体噬菌体噬菌体 噬菌体内含双链环形、单链环形、双链线形、单链噬菌体内含双链环形、单链环形、双链线形、单链线形等多种形式、大小不一的线形等多种形
19、式、大小不一的DNA，且感染率高，且感染率高 噬菌体含有线性双链噬菌体含有线性双链DNA分子，两端有互补粘性末分子，两端有互补粘性末端，进入宿主细胞后可连接成为环状分子；属温和端，进入宿主细胞后可连接成为环状分子；属温和噬菌体，噬菌体，DNA可整合到宿主细胞染色体可整合到宿主细胞染色体DNA上，随上，随染色体复制而复制；可承载较大的外源染色体复制而复制；可承载较大的外源DNA片段；片段；宿主细胞中有大量供噬菌体包装用的壳蛋白；有多宿主细胞中有大量供噬菌体包装用的壳蛋白；有多个限制性内切酶的识别序列个限制性内切酶的识别序列 Founded in 189526/56噬菌体噬菌体Founded in
20、 189527/56用于真核生物宿主的载体用于真核生物宿主的载体人工载体人工载体 具有大肠杆菌质粒的抗具有大肠杆菌质粒的抗药性和噬菌体的强感染药性和噬菌体的强感染力，同时能够携带真核力，同时能够携带真核生物大片段生物大片段DNA的目的的目的基因基因 如柯斯质粒载体（粘质如柯斯质粒载体（粘质粒载体），既可按质粒粒载体），既可按质粒载体的性质转化受体菌，载体的性质转化受体菌，并在其中复制，又可以并在其中复制，又可以按照按照噬菌体性质，进噬菌体性质，进行体外包装转导受体细行体外包装转导受体细胞胞 Founded in 189528/56用于真核生物宿主的载体用于真核生物宿主的载体 大多是穿梭质粒，既
21、可在原核细胞中复制扩增，也大多是穿梭质粒，既可在原核细胞中复制扩增，也可以在真核细胞中扩增、表达可以在真核细胞中扩增、表达 酵母质粒：来自酿酒酵母酵母质粒：来自酿酒酵母 人工染色体载体：能够承载更大的外源基因人工染色体载体：能够承载更大的外源基因 酵母人工染色体：在酵母细胞中克隆外源酵母人工染色体：在酵母细胞中克隆外源DNA大片段克隆大片段克隆体系，外源体系，外源DNA容量为容量为1000kb 细菌人工染色体：以细菌细菌人工染色体：以细菌F因子为基础组建的细菌克隆体因子为基础组建的细菌克隆体系，外源系，外源DNA容量为容量为300kb Founded in 189529/56用于植物宿主的载体
22、用于植物宿主的载体 由于植物细胞的特殊性，外源基因导入植物细胞的由于植物细胞的特殊性，外源基因导入植物细胞的方法十分有限方法十分有限 Ti质粒：能够进入植物细胞并能整合到植物染色体质粒：能够进入植物细胞并能整合到植物染色体DNA分分子中，但其分子太长、限制性酶切位点多，易导致宿主产子中，但其分子太长、限制性酶切位点多，易导致宿主产生不分化的不良植株生不分化的不良植株 植物植物DNA病毒：宿主范围窄，可插入片段短，易丢失，插病毒：宿主范围窄，可插入片段短，易丢失，插入外源入外源DNA后感染力下降，使用很少后感染力下降，使用很少 植物转座子：在生物体基因组中可从一个基因座位转移到植物转座子：在生物
23、体基因组中可从一个基因座位转移到另一个基因座位，有望成为新的植物载体另一个基因座位，有望成为新的植物载体 Founded in 189530/56用于动物宿主的载体用于动物宿主的载体 哺乳动物细胞用于外源哺乳动物细胞用于外源DNA表达采用的载体很有限，表达采用的载体很有限，主要是猿猴空泡病毒主要是猿猴空泡病毒40（SV40） 含双链环状含双链环状DNA，只能插入，只能插入2.5kb的外源基因的外源基因 感染宿主主要为猴细胞，容易产生有危险的野生型感染宿主主要为猴细胞，容易产生有危险的野生型 RNA病毒、痘病毒、人腺病毒、乳头瘤病毒等也可病毒、痘病毒、人腺病毒、乳头瘤病毒等也可用于动物宿主的病毒
24、载体用于动物宿主的病毒载体 Founded in 189531/56原核生物目的基因的获得原核生物目的基因的获得 基因库的构建：将基因库的构建：将总总DNA酶解获得包酶解获得包含所有基因的含所有基因的DNA片段集，将每一个片段集，将每一个片段与载体连接并片段与载体连接并分别导入受体细胞，分别导入受体细胞，可得到所有的包含可得到所有的包含该生物体全套基因该生物体全套基因的库的库 Founded in 189532/56 基因文库的筛选基因文库的筛选 通过免疫反应筛选通过免疫反应筛选 通过通过DNA分子杂交筛选分子杂交筛选 Founded in 189533/56真核生物目的基因的获得真核生物目的
25、基因的获得 cDNA文库文库的建立：的建立：细胞全部细胞全部mRNA逆逆转录成转录成cDNA并被并被克隆的总克隆的总和和 基因组基因组DNADNA文库及文库及cDNAcDNA文库组建图文库组建图 Founded in 189534/56 DNA的化学合成：把新的脱氧核糖核苷酸加到的化学合成：把新的脱氧核糖核苷酸加到DNA双链的双链的5端，与细胞中端，与细胞中DNA分子合成的方向相反；分子合成的方向相反；目前常用的是磷酰胺法目前常用的是磷酰胺法 PCR法：体外通过酶促反应快速扩增特异法：体外通过酶促反应快速扩增特异DNA片段片段 有与被分离的目的基因两条链各一端序列互补的有与被分离的目的基因两条
26、链各一端序列互补的DNA引物引物 具有热稳定性的酶具有热稳定性的酶 dNTP作为底物作为底物 有作为模板的目的有作为模板的目的DNA序列序列 Founded in 189535/56目的基因的转移目的基因的转移 重组重组DNA进入受体的过程叫转化，得到重组进入受体的过程叫转化，得到重组DNA的的细胞叫受体细胞细胞叫受体细胞 选择合适的受体细胞：转化效率高、稳定传代、易选择合适的受体细胞：转化效率高、稳定传代、易筛选、外源基因可高效表达和稳定积累；原核生物筛选、外源基因可高效表达和稳定积累；原核生物如大肠杆菌，真核细胞如酵母菌和枯草芽孢杆菌如大肠杆菌，真核细胞如酵母菌和枯草芽孢杆菌 选择合适的载
27、体：具有强启动子、便于连接、适合选择合适的载体：具有强启动子、便于连接、适合受体细胞受体细胞 选择合适的导入方法：氯化钙导入法、电穿孔法、选择合适的导入方法：氯化钙导入法、电穿孔法、噬菌体导入法、其他方法噬菌体导入法、其他方法 Founded in 189536/56重组体的筛选重组体的筛选 传统生物学方法传统生物学方法 遗传学方法：抗性筛选遗传学方法：抗性筛选插入失活检测，直接筛选；营插入失活检测，直接筛选；营养缺陷互补筛选养缺陷互补筛选蓝白筛选蓝白筛选 免疫学方法：有目的蛋白的抗体免疫学方法：有目的蛋白的抗体 利用噬菌斑筛选利用噬菌斑筛选 核酸杂交法：利用放射性同位素标记的核酸杂交法：利用
28、放射性同位素标记的DNA或或RNA作探针进行核酸杂交，进行重组体的筛选与鉴定作探针进行核酸杂交，进行重组体的筛选与鉴定 原位杂交原位杂交 点杂交点杂交 Southern杂交（印迹技术）杂交（印迹技术） Founded in 189537/56利用抗生素抗性基因筛选重组体利用抗生素抗性基因筛选重组体Founded in 189538/56原位菌落杂交筛选原位菌落杂交筛选Founded in 189539/56Southern杂交原理杂交原理Founded in 189540/56DNA序列分析序列分析 Maxam-Gilbert化学降解法化学降解法 用特异的化学试剂修饰用特异的化学试剂修饰DNA
29、分子中的不同碱基，然后用哌分子中的不同碱基，然后用哌啶切断多核苷酸链，通过凝胶电泳分离不同长度的寡核苷啶切断多核苷酸链，通过凝胶电泳分离不同长度的寡核苷酸，对照四组不同反应所产生的电泳带的位置，读出序列酸，对照四组不同反应所产生的电泳带的位置，读出序列 一轮反应只能测定约一轮反应只能测定约250bp的序列的序列 Sanger双脱氧法（酶法）双脱氧法（酶法） 加入双脱氧核苷酸后，加入双脱氧核苷酸后，DNA链的合成终止，将随机终止的链的合成终止，将随机终止的和全合成的和全合成的DNA链进行电泳分离，可确定碱基的分布链进行电泳分离，可确定碱基的分布 确定确定A、G、C、T四种碱基的全部序列四种碱基的
30、全部序列 光学检测，适用于自动测序光学检测，适用于自动测序 Founded in 189541/56Maxam-Gilbert法测序原理及法测序原理及G反应反应Founded in 189542/56双脱氧核苷酸的结构及其终止双脱氧核苷酸的结构及其终止DNA合成合成Founded in 189543/56Sanger双脱氧测序法双脱氧测序法Founded in 189544/562 基因工程在环境污染治理中的应用基因工程在环境污染治理中的应用 合成有机化合物难于生物降解或降解缓慢合成有机化合物难于生物降解或降解缓慢 基因工程通过改变细胞内的关键酶或酶系统，可以基因工程通过改变细胞内的关键酶或酶
31、系统，可以 提高微生物的降解速率提高微生物的降解速率 拓宽底物的专一性范围拓宽底物的专一性范围 维持低浓度下的代谢活性维持低浓度下的代谢活性 形成降解有毒污染物的新型催化活性形成降解有毒污染物的新型催化活性 改善微生物的生物学特性改善微生物的生物学特性 Founded in 189545/56形成降解有毒污染物的新型催化活性形成降解有毒污染物的新型催化活性Founded in 189546/56改善微生物的生物学特性改善微生物的生物学特性Founded in 189547/56微生物基因改造的主要目标及手段微生物基因改造的主要目标及手段 设计复合代谢途径设计复合代谢途径 代谢工程，利用分子生物
32、学原理系统分析细胞代谢网络，并代谢工程，利用分子生物学原理系统分析细胞代谢网络，并通过通过DNA重组技术合理设计细胞代谢途径及进行遗传修饰，重组技术合理设计细胞代谢途径及进行遗传修饰，进而完成细胞特性改造进而完成细胞特性改造 利用对不同底物具有降解活性的酶的组合构建新的复合代谢利用对不同底物具有降解活性的酶的组合构建新的复合代谢途径，已应用于卤代芳烃、烷基苯乙酸等的降解途径，已应用于卤代芳烃、烷基苯乙酸等的降解 通过引入编码新酶的活性基因，或对现有的基因物质进行改通过引入编码新酶的活性基因，或对现有的基因物质进行改造、重组，构建新的微生物，可用于氯代芳烃混合物的降解造、重组，构建新的微生物，可
33、用于氯代芳烃混合物的降解 某假单胞菌可利用某假单胞菌可利用TNT（2,4,6-三硝基甲苯）为唯一氮源，三硝基甲苯）为唯一氮源，但不能进一步降解其代谢产物甲苯、氨基甲苯和硝基甲苯；但不能进一步降解其代谢产物甲苯、氨基甲苯和硝基甲苯；将具有甲苯完整降解途径的质粒导入微生物，并对其进一步将具有甲苯完整降解途径的质粒导入微生物，并对其进一步修饰消除其硝酸盐还原反应，使得修饰消除其硝酸盐还原反应，使得TNT可以完全降解可以完全降解 Founded in 189548/56 拓宽氧化酶的专一性拓宽氧化酶的专一性 将两种双氧合酶不同将两种双氧合酶不同组分的编码基因混合，组分的编码基因混合，构建复合酶体系，使
34、构建复合酶体系，使其实现对联苯和甲苯其实现对联苯和甲苯的同时降解的同时降解 杂合多组分双氧合酶杂合多组分双氧合酶还可实现对三氯乙烯还可实现对三氯乙烯的降解的降解 综合不同来源的联苯综合不同来源的联苯双氧合酶的优势，可双氧合酶的优势，可以实现对多氯联苯的以实现对多氯联苯的广谱、高效降解广谱、高效降解 甲苯甲苯- -联苯双氧复合酶的复合组成联苯双氧复合酶的复合组成 Founded in 189549/56基因工程微生物的应用基因工程微生物的应用增强无机磷的去除增强无机磷的去除 磷是水体富营养化的重要因素，活性污泥法只能去磷是水体富营养化的重要因素，活性污泥法只能去除城市废水中除城市废水中20-40
35、%的无机磷的无机磷 大肠杆菌中控制磷积累和聚磷酸盐形成的磷酸盐专大肠杆菌中控制磷积累和聚磷酸盐形成的磷酸盐专一输运系统和一输运系统和polyP激酶由激酶由pst操纵子编码操纵子编码 通过对通过对polyP激酶编码基因激酶编码基因ppk和用于再生和用于再生ATP的乙的乙酸激酶编码基因酸激酶编码基因ack A进行基因扩增，可以有效提高进行基因扩增，可以有效提高菌体对无机磷的去除能力菌体对无机磷的去除能力 Founded in 189550/56Founded in 189551/56基因工程微生物的应用基因工程微生物的应用苯及烷基取代苯的降解苯及烷基取代苯的降解 甲苯降解酶具有广泛的底物范围，但无
36、法利用苯甲苯降解酶具有广泛的底物范围，但无法利用苯 克隆编码甲苯还原酶的基因克隆编码甲苯还原酶的基因todC1C2BA，并将重组质粒导入，并将重组质粒导入P. putida mt-2中，可以彻底降解苯中，可以彻底降解苯/甲苯甲苯/二甲苯二甲苯 甲苯的降解途径甲苯的降解途径 Founded in 189552/56基因工程微生物的应用基因工程微生物的应用苯酚类污染物的降解苯酚类污染物的降解 4-壬基苯酚的中间代谢物壬基苯酚的中间代谢物4-乙酰苯酚会发生积累，在乙酰苯酚会发生积累，在酵母酵母Candida aquaetextoris中引入苯酚羟化酶基因，中引入苯酚羟化酶基因，可实现其完全降解可实现
37、其完全降解 苯酚的降解途径苯酚的降解途径 Founded in 189553/56基因工程微生物的应用基因工程微生物的应用氯代芳香化合物的降解氯代芳香化合物的降解 氯苯的降解过程中，第一步是关键步骤，双加氧酶氯苯的降解过程中，第一步是关键步骤，双加氧酶和脱氢酶是关键酶，增加其编码基因的拷贝数，可和脱氢酶是关键酶，增加其编码基因的拷贝数，可加快此步骤加快此步骤 一氯苯的降解途径（最后两步双键有误）一氯苯的降解途径（最后两步双键有误） Founded in 189554/56Founded in 189555/56 将多氯联苯生物降解过将多氯联苯生物降解过程中假单胞菌的相关降程中假单胞菌的相关降解
38、酶基因导入大肠杆菌解酶基因导入大肠杆菌中，避免了原始菌修复中，避免了原始菌修复效率低的缺点，而且不效率低的缺点，而且不需要联苯诱导需要联苯诱导 将编码甲苯双加氧酶基将编码甲苯双加氧酶基因和编码苯甲醇脱氢酶因和编码苯甲醇脱氢酶和苯甲醛脱氢酶基因，和苯甲醛脱氢酶基因，转座子整合至转座子整合至2-氯苯甲氯苯甲酸降解菌中，可以实现酸降解菌中，可以实现2-氯甲苯的完全矿化氯甲苯的完全矿化 2-2-氯甲苯的降解途径氯甲苯的降解途径 Founded in 189556/56基因工程微生物的应用基因工程微生物的应用多环芳烃的降解多环芳烃的降解 多环芳烃具有强烈的毒性，不易被微生物降解多环芳烃具有强烈的毒性，不
39、易被微生物降解 根据代谢工程原理，可以通过分析细菌和真菌的代根据代谢工程原理，可以通过分析细菌和真菌的代谢网络，确定双加氧酶和单加氧酶所对应的基因，谢网络，确定双加氧酶和单加氧酶所对应的基因，并增加这些基因的拷贝数，强化苯并芘的降解并增加这些基因的拷贝数，强化苯并芘的降解 可以把相关酶的编码基因克隆并重组为一个质粒，可以把相关酶的编码基因克隆并重组为一个质粒，导入芳香族化合物降解菌，以提高转化降解速率导入芳香族化合物降解菌，以提高转化降解速率 改造后的生物细胞可能会出现代谢紊乱、能量不足改造后的生物细胞可能会出现代谢紊乱、能量不足等问题；质粒在多次传代后可能发生丢失，也可能等问题；质粒在多次传代后可能发生丢失，也可能污染环境菌种污染环境菌种 Founded in 189557/56基因工程微生物的应用基因工程微生物的应用偶氮染料的降解偶氮染料的降解 偶氮染料降解菌主要通过产生偶氮还原酶对偶氮染料进行脱偶氮染料降解菌主要通过产生偶氮还原酶对偶氮染料进行脱色，还原为苯胺并进一步降解色，还原为苯胺并进一步降解 将编码偶氮还原酶的特异性基因克隆到大肠杆菌中可以提高将编码偶氮还原酶的特异性基因克隆到大肠杆菌中可以提高其表达量，酶活性也有较大提高其表达量，酶活性也有较大提高 偶氮还原酶降解偶氮染料的可能机理偶氮还原酶降解偶氮染料的可能机理
