1、1第八章第八章. 免疫组化双重染色技术免疫组化双重染色技术 (Double staining technology in immunohistochemistry)用免疫组化方法在同一张组织切片上用免疫组化方法在同一张组织切片上同时显示同时显示两种或两两种或两种以上的抗原种以上的抗原, 以发现其定位以发现其定位, 形态和功能上的相互关系形态和功能上的相互关系. I. 连续切片双重染色法连续切片双重染色法 A. 最简单最可靠最简单最可靠. 用同样的免疫组化方法用同样的免疫组化方法, 在两张相邻切在两张相邻切片上片上各自各自显示一种抗原显示一种抗原, 然后比较然后比较. 不会互相干扰或出现不会互相
2、干扰或出现假双标假双标. B. 切片厚度切片厚度13 m, 否则不能确保双阳性结果否则不能确保双阳性结果. 神经组织神经组织切片切片1020 m, 可采用可采用“镜像镜像”法法 即相邻切片翻转后贴在即相邻切片翻转后贴在载玻片上载玻片上, 软件软件PS处理处理. II. 免疫荧光双重染色法免疫荧光双重染色法: 用用不同的荧光色素不同的荧光色素标记标记不同的不同的抗体抗体, 显示不同的颜色显示不同的颜色. 2A. 直接法直接法: 1. 一步法一步法: 将将FITC (490552030nm, 绿色荧光绿色荧光)和和TRITC (550620nm, 红色荧光红色荧光)或其他荧光染料分别标记的两种一或
3、其他荧光染料分别标记的两种一抗混合抗混合, 使每个抗体均为最适稀释度使每个抗体均为最适稀释度, 然后孵育切片然后孵育切片. 2. 二步法二步法: 先后依次使用两种荧光抗体分别孵育切片先后依次使用两种荧光抗体分别孵育切片. 3. 观察观察: 同一个视野里同一个视野里.a. 对每一种荧光标记物对每一种荧光标记物(绿色或红色绿色或红色)使用不同的使用不同的滤色板滤色板进行进行观察和照相观察和照相, 每张照片显示一种荧光每张照片显示一种荧光, 比较两张照片比较两张照片. b. 两种荧光重叠照相两种荧光重叠照相, 则在一张照片上可发现分别含不同抗则在一张照片上可发现分别含不同抗原的细胞原的细胞(呈绿色或
4、红色呈绿色或红色). 如果两种抗原存在于同一个细胞如果两种抗原存在于同一个细胞或结构或结构, 则呈现两种红绿荧光的混合色则呈现两种红绿荧光的混合色, 如黄色如黄色. 3Alexa Fluor 488-1st antibodies shows EEA1, Alexa Fluor 568-1st antibodies shows beta-tubulins. Cultured 18-embryonic day rat hippocampal neurons.4B. 间接法间接法: 1. 两种一抗不标记两种一抗不标记, 但来自但来自不同种属的不同种属的动物如兔和豚鼠动物如兔和豚鼠(Guinea pi
5、g). 2. 两种来源于两种来源于同种动物或不同种动物或不同种动物同种动物的二抗的二抗(如羊抗兔如羊抗兔IgG和羊抗豚鼠和羊抗豚鼠IgG, 或羊抗或羊抗兔兔IgG和猪抗豚鼠和猪抗豚鼠IgG)分别以分别以FITC和和TRITC标记标记. 3. 染色步骤染色步骤:a. 先用第一种一抗和相应的标记二抗依次孵育切片先用第一种一抗和相应的标记二抗依次孵育切片, 显示第显示第一种抗原一种抗原; 然后再用第二种一抗和相应的标记二抗依次孵育然后再用第二种一抗和相应的标记二抗依次孵育切片切片, 显示第二种抗原显示第二种抗原. 或者将两种一抗混合后孵育切片或者将两种一抗混合后孵育切片, 再再将两种标记的二抗混合后
6、孵育切片将两种标记的二抗混合后孵育切片. b. 其余同前其余同前. 5COS7 cells, Y.W Lin. Nuclei were stained by Hoechst blue, USP26 stained by Alexa Fluor 488 and Myc stained by Alexa Fluor 594. Mixed color is yellow.6FITC-2nd anti-microtubules, TRITC-2nd anti-actins, DAPI shows nucleus in cultured Bovine pulmonary artery endotheli
7、al cells.Texas Red-2nd anti-histone, Alexa Fluor 488-2nd anti-PMP70 in peroxisome, Alexa Fluor 350-phalloidin. Indian Muntjac deer skin fibroblast cell.7Alexa Fluor 568-2nd anti-giantin in G, Alexa Fluor 488-2nd anti-NPCP, Alexa Fluor 350-phalloidin. Tahr Ovary Epithelial Cells (HJ1.Ov Line).Texas r
8、ed- 2nd anti-insulin, FITC-2nd anti glucagons in mouse pancreas.8III. 免疫酶双重染色免疫酶双重染色A. 单酶法单酶法: 常见于两种一抗来自常见于两种一抗来自同种属同种属动物动物. 1. 原理原理: a. 用一种酶如用一种酶如 HRP标记显示两种不同的抗原标记显示两种不同的抗原, 但用但用不同的电不同的电子供体子供体如如DAB和和CN呈现不同颜色的反应终产物呈现不同颜色的反应终产物. b. 两重染色之间需将第两重染色之间需将第一次染色反应中的一次染色反应中的各级各级抗体和酶抗体和酶(步骤步骤a)及其反及其反应产物应产物从组织上
9、洗脱从组织上洗脱(步骤步骤b). c. 连续做两次染色连续做两次染色, 所所费时间较长费时间较长. 9假性双标的来源假性双标的来源第一次用第一次用ABC法染色法染色, 氧化法洗脱抗体氧化法洗脱抗体. 对照对照试验证实此为假性双标试验证实此为假性双标. 1992.102. 抗体洗脱法抗体洗脱法:a. 酸洗法酸洗法: 在在pH2.2甘氨酸甘氨酸(Glycine)-HCl缓冲液中加入适量二缓冲液中加入适量二甲基甲酰胺甲基甲酰胺(Dimethylfomamide, DMF), 作用作用14小时使抗原小时使抗原-抗抗体复合物解离体复合物解离. b. 氧化法氧化法: 2.5% KMnO4: 5% H2SO
10、4: DDH2O=1:4:10260, 1分分, 氧氧化除去抗体化除去抗体, 0.5%偏重亚硫酸钠偏重亚硫酸钠 (Sodium Metabisulfite, Na2S2O5)漂白液脱色漂白液脱色. 第一次染色用第一次染色用CN显色显色, 并注意对第二种并注意对第二种抗原的影响抗原的影响(可设立对照可设立对照).c. 甲醛蒸气法甲醛蒸气法: 1升容器升容器+3g多聚甲醛多聚甲醛+切片切片, 置置80烤箱烤箱14小小时时, 蒸汽破坏抗体的蒸汽破坏抗体的Ig结合部位结合部位.113. 步骤步骤: a: 第一次染色后第一次染色后, 除去抗体和除去抗体和酶酶而使有色反应终产物留在而使有色反应终产物留在抗
11、原部位抗原部位, 再用同样方法进行再用同样方法进行第二次染色第二次染色. *. 切片处理切片处理, 抑制内源性酶及抑制内源性酶及NGS封闭同前封闭同前. *. 用用PAP法完成第一次染色法完成第一次染色, CN-H2O2显色显色. TBS洗洗. *. 氧化法洗脱氧化法洗脱. TBS洗洗. *. 用用PAP法完成第二次染色法完成第二次染色, 0.05%DAB-0.01%H2O2显色显色. TBS洗洗. 甘油胶封片甘油胶封片. 大鼠垂体前叶促性腺激素细胞大鼠垂体前叶促性腺激素细胞(蓝色蓝色)和生长激素细胞和生长激素细胞(棕色棕色), 免疫酶免疫酶(PAP法法)双重染色双重染色. 1993.12b:
12、 第一次染色后第一次染色后, 照相记录照相记录结果并记住照相视野的部位结果并记住照相视野的部位. 用有用有机溶剂机溶剂将反应终产物溶解除去将反应终产物溶解除去, 洗脱抗体复合物洗脱抗体复合物, 然后进行第然后进行第二次染色二次染色. 对同一部位再一次照相对同一部位再一次照相, 比较先后照相所得照片比较先后照相所得照片. *. 切片处理同上切片处理同上. *. 用用PAP法完成第一次染色法完成第一次染色, CN-H2O2显色显色. TBS洗洗. *. TBS封片封片, 照相照相(注意防止切片干燥注意防止切片干燥). *. 去盖片去盖片, TBS洗洗, 再用酒精再用酒精-二甲苯二甲苯-酒精处理酒精
13、处理, 除去除去CN蓝色反蓝色反应产物应产物, DDH2O洗洗. *. 氧化法洗脱氧化法洗脱, TBS洗洗. *. PAP法第法第2次染色次染色, 0.05%DAB-0.01%H2O2显色显色. TBS洗洗. *. 甘油胶封片甘油胶封片, 找出第一次照相的部位找出第一次照相的部位, 再次照相再次照相. 13大鼠垂体前叶大鼠垂体前叶GnRH相关肽阳性细胞相关肽阳性细胞(左左, 蓝色蓝色)与促性腺激素细胞与促性腺激素细胞(右右, 棕色棕色)为同一种细胞为同一种细胞, 免疫酶免疫酶(PAP法法)双重染色双重染色. 1993.144. 染色最佳条件的确定染色最佳条件的确定: 先对两种待检抗原分别染色先
14、对两种待检抗原分别染色, 以决定合适的抗体稀释度和反应条件等以决定合适的抗体稀释度和反应条件等. 5. 双重染色先后次序的确定双重染色先后次序的确定: 先显示含量较少的抗原先显示含量较少的抗原; 先显示容易受染色过程和洗脱过程影响的组织抗原先显示容易受染色过程和洗脱过程影响的组织抗原; 先先用不太敏感的抗体用不太敏感的抗体; 先用先用DAB显色显色. 6. 对照试验对照试验: a. 单染对照单染对照.b. 在进行第二次染色前在进行第二次染色前, 要证明第一次染色的各级抗体要证明第一次染色的各级抗体和酶活性被完全除去和酶活性被完全除去, 而且洗脱后对第二个待检抗原无而且洗脱后对第二个待检抗原无影
15、响影响. 15B. 双酶法双酶法: 适用于两种一抗来源于适用于两种一抗来源于不同种属不同种属动物动物, 如兔和小如兔和小鼠鼠, 或同种动物或同种动物(如小鼠如小鼠)的两种的两种单克隆单克隆抗体抗体, 但其但其Ig亚类不亚类不同同, 如如IgGl和和IgG2a. 1. 原理原理: a. 用两种无关的酶分别标记显示两种抗原用两种无关的酶分别标记显示两种抗原, 常用的酶为常用的酶为HRP和和AKP, 或或HRP和葡萄糖氧化酶和葡萄糖氧化酶(Glucose oxidase). b. 两重染色之间无需洗脱两重染色之间无需洗脱.c. 两种二抗分别是抗兔两种二抗分别是抗兔IgG和抗小鼠和抗小鼠IgG, 或抗
16、小鼠或抗小鼠IgGl和抗和抗小鼠小鼠IgG2a. 可以来自可以来自同种属动物或不同种属动物同种属动物或不同种属动物, 可以是可以是酶标抗体酶标抗体(一个用一个用HRP, 另一个用另一个用AKP标记标记), 也可以是未标记也可以是未标记抗体抗体(一个用兔一个用兔PAP, 另一个用小鼠另一个用小鼠APAAP).16d. 可避免抗体残留而引起的假性双标记可避免抗体残留而引起的假性双标记, 不需洗脱不需洗脱. 由于无由于无交叉反应交叉反应, 可将两重染色的同一层抗体混合同时使用并可将两重染色的同一层抗体混合同时使用并先后先后显示显示两种酶的活性两种酶的活性, 在同一张切片上获得不同颜色的反应终在同一张
17、切片上获得不同颜色的反应终产物产物, 如棕色和蓝色如棕色和蓝色. 如两种抗原共存于同一个细胞如两种抗原共存于同一个细胞, 则出现则出现灰紫色的混合色灰紫色的混合色. 172. 染色步骤染色步骤: 以先后使用以先后使用PAP法和法和APAAP法为例法为例. a. 切片处理切片处理, 抑制内源性酶及正常血清封闭如前抑制内源性酶及正常血清封闭如前. b. 两种一抗混合液两种一抗混合液(各自稀释度由单染决定各自稀释度由单染决定), 室温室温30分或分或4过夜过夜. TBS洗洗. c. 两种二抗混合液两种二抗混合液(各自稀释度由单染决定各自稀释度由单染决定), 室温室温30分分. TBS洗洗. d. P
18、AP和和APAAP混合液混合液(各自稀释度由单染决定各自稀释度由单染决定), 室温室温30分分. TBS洗洗. e. 显示显示HRP, 如用如用0.05%DAB-0.01%H2O2, 镜下控制染色镜下控制染色. TBS洗洗. f. 显示显示AKP, 如用萘酚如用萘酚AS-MX磷酸盐加固蓝磷酸盐加固蓝BB或固红或固红, 镜镜下控制染色下控制染色. TBS洗洗. g. 甘油胶封片甘油胶封片. 18Anti-Esterase shows neuromyo junction in blue, Anti-P0 shows myelin in brown, silver staining shows ax
19、on in black. 19SP法法. AKP-Fast red and HRP-DAB shows P504S and p63, respectively. Prostate cancer.203. 染色的最佳条件染色的最佳条件: 先对两种待检抗原分别染色先对两种待检抗原分别染色, 以决定以决定合适的抗体稀释度和反应条件等合适的抗体稀释度和反应条件等. 4. 双重染色的先后次序双重染色的先后次序: 先显示先显示HRP, 再显示再显示AKP或葡萄糖或葡萄糖氧化酶氧化酶(Glucose oxidase). 5. 对照试验对照试验: a. 单染对照单染对照.b. 必需排除两套抗体系统之间的必需排
20、除两套抗体系统之间的交叉反应交叉反应. 如第二种羊抗如第二种羊抗兔兔IgG二抗可能与第一种小鼠二抗可能与第一种小鼠IgG一抗结合而出现假性双一抗结合而出现假性双标记标记, 因此应事先做抗体进行交叉染色实验因此应事先做抗体进行交叉染色实验. 216. 注意事项注意事项: a. 厚厚切片切片(7 m)可能出现混合色可能出现混合色(双标记双标记)的假象的假象. b. APAAP法中缓冲液用法中缓冲液用TBS. c. 内源性内源性AKP一般不会引起问题一般不会引起问题. d. 用两种二抗来源动物的用两种二抗来源动物的NGS封闭封闭. IV. 免疫酶免疫酶-免疫荧光双重染色法免疫荧光双重染色法: 首先用
21、免疫酶法显示第首先用免疫酶法显示第一种抗原一种抗原, 然后用间接免疫荧光法定位第二种抗原然后用间接免疫荧光法定位第二种抗原. 若两若两种一抗来自同一动物种一抗来自同一动物, 注意可能发生的注意可能发生的交叉反应交叉反应.22V. 免疫酶免疫酶-免疫金免疫金(银银)双重染色法双重染色法 A. 免疫酶免疫酶-免疫金双重染色法免疫金双重染色法: 1. 用用PAP法显示第一种抗原法显示第一种抗原, 为了加强与胶体金的红为了加强与胶体金的红色的对比可用色的对比可用CN显色显色, 如该抗原存在于神经组织则用如该抗原存在于神经组织则用DAB显色显色. 2. 用酸洗法洗脱第一次染色的抗体复合物用酸洗法洗脱第一
22、次染色的抗体复合物, 继之用继之用IGS法显示第二种抗原法显示第二种抗原, 在光镜下监视染色在光镜下监视染色, 直到出现满直到出现满意的红色为止意的红色为止. 3. 用用PAP法后再用法后再用IGS法法, 可防止标记在二抗的胶体金可防止标记在二抗的胶体金颗粒与抗体一起洗脱掉颗粒与抗体一起洗脱掉. 金标抗体穿透组织能力差金标抗体穿透组织能力差, 常需用较大的一抗和金标抗体浓度并提高其穿透力常需用较大的一抗和金标抗体浓度并提高其穿透力. 23B. 免疫酶免疫酶-免疫金银双重染色法免疫金银双重染色法: 1. 用用IGSS法显示第一种抗原法显示第一种抗原, 用用5nm小颗粒胶体金标记二抗小颗粒胶体金标
23、记二抗. 应用物理显影液进行银加强后应用物理显影液进行银加强后, 在金颗粒周围形成金属银在金颗粒周围形成金属银壳壳, 不但增强了金颗粒的可见度不但增强了金颗粒的可见度, 而且封闭了第一次染色的而且封闭了第一次染色的各级抗体各级抗体, 从而从而避免了避免了第二次染色试剂发生第二次染色试剂发生交叉反应交叉反应. 因银因银壳可能覆盖第二种抗原壳可能覆盖第二种抗原, 该法只适用于两种抗原存在于该法只适用于两种抗原存在于不不同组织结构同组织结构. 2. 缓冲液彻底清洗后缓冲液彻底清洗后, 再用免疫酶法再用免疫酶法(如如PAP或或ABC法等法等)显示显示第二种抗原第二种抗原. IGSS法所得黑色可与免疫酶法所得棕色或蓝法所得黑色可与免疫酶法所得棕色或蓝色等形成显明对比色等形成显明对比.
