1、基因编辑技术的发展1ppt课件 通过精确识别靶细胞DNA片段中靶点的核苷酸序列，利用核酸内切酶对DNA靶点序列进行切割，从而完成对靶细胞DNA目的基因片段的精确编辑。 基因编辑定义基因编辑定义2ppt课件 第一代第一代: : ZFNZFN( (锌指核酸酶锌指核酸酶) )，19961996年；年； 第二代第二代: : TALENTALEN( (转录激活样效应因子核酸酶转录激活样效应因子核酸酶) )， 20112011年；年； 第三代第三代: : CRISPR/Cas9CRISPR/Cas9( (成簇的规律性间隔的短回文成簇的规律性间隔的短回文重复序列重复序列) )，20132013年；年； 第四
2、代：第四代：NgAgo-gDNANgAgo-gDNA ，韩春雨，韩春雨，20162016；四代基因编辑技术四代基因编辑技术3ppt课件第一代第一代: : 锌指核酸酶锌指核酸酶Zinc-finger nucleases（ZFN）4ppt课件ZFNZFN组成组成ZFN = DNA识别域 + 核酸内切酶DNA识别域： 由一系列Cys-His锌指蛋白（zinc-fingers）串联组成（34个），每个锌指蛋白识别并结合一个特异的三联体碱基。核酸内切酶Fok I： 非特异性核酸内切酶FokI，形成二聚体时切割双链DNA。锌指蛋白锌指蛋白5ppt课件 DNA 识别域能识别特异位点并与之结合，而由Fok构成
3、的切割域能执行剪切功能，两者结合可使靶位点的双链DNA 断裂(DSB)。于是，细胞可以通过同源重组(HR)修复机制和非同源末端连接(NHEJ)修复机制来修复 DNA。HR 修复有可能会对靶标位点进行恢复修饰或者插入修饰，而 NHEJ 修复极易发生插入突变或缺失突变。两者都可造成移码突变，因此达到基因敲除的目的。ZFNZFN的工作原理的工作原理6ppt课件 ZFN 诱导的基因组编辑技术可应用于很多物种及基因位点，具有较好的发展潜力。但是目前有 3 个方面的缺陷制约了该技术的推广:(1)以现有的策略设计高亲和性的 ZFN， 需要投入大量的工作和时间;(2)在细胞中持续表达 ZFN 对细胞有毒性;(
4、3)虽然三联体设计具有一定特异性，但仍然存在不同程度的脱靶效应。ZFNZFN的特点和不足的特点和不足7ppt课件第二代第二代: : 转录激活样效应因子核酸酶转录激活样效应因子核酸酶transcription activator-like (TAL) effector nucleases(TALENs)8ppt课件TALENTALEN的组成的组成TALEN = DNA识别域 + 核酸内切酶DNA识别域：由一系列TALE蛋白串联组成（20个左右），每个TALE蛋白识别并结合一个对应的碱基。核酸内切酶：非特异性核酸内切酶FokI，形成二聚体时切割双链DNAFok I9ppt课件TALENTALEN技
5、术原理技术原理 TALENs是一种可靶向修饰特异DNA序列的酶，它借助于TAL效应子一种由植物细菌分泌的天然蛋白来识别特异性DNA碱基对。TAL效应子可被设计识别和结合所有的目的DNA序列。对TAL效应子附加一个核酸酶就生成了TALENs。TAL效应核酸酶可与DNA结合并在特异位点对DNA链进行切割，从而导入新的遗传物质。10ppt课件 TALEN 已经成功应用于酵母、 哺乳动物和植物的位点特异性基因打靶， 与锌指核酸酶系统相比有较大的应用优势， 设计更简单，特异性更高，但仍然有些问题需要解决，如脱靶效应、TALEN 与基因组进行特异结合与染色体位置及邻近序列有关等。TALENTALEN的特点
6、和不足的特点和不足11ppt课件第第三代：三代：成簇的规律性间隔的成簇的规律性间隔的短回文重复序列短回文重复序列12ppt课件CRISPR/casCRISPR/cas系统的发现系统的发现1987年发现苗头：大阪大学研究者对一种细菌碱性磷酸酶基因研究中发现，其基因编码区域附近存在一小段简单重复的DNA序列片段，但不太清楚其生物学意义。随后十年不断确认：约40%细菌和90%古细菌基因末端，有多组DNA序列+反向序列+约30bp空格序列（spacer DNA），组成成簇的、规律间隔的短回文重复序列，被称为CRISPR。2005年提出假说： CRISPR中空格DNA能与噬菌体DNA序列互补匹配。细菌C
7、RISPR序列可能与细菌的免疫保护机制相关，细菌转录形成RNA后与入侵的外源噬菌体DNA结合，起到类似RNA干扰的作用。13ppt课件 2007年实验验证：Danisco公司的Barrangou和 Horvath等发现，通过插入或删除嗜热链球菌（乳酸菌）中几个CRISPR序列的空格DNA片段，就可以改变细菌对噬菌体的免疫力（Science, 2007） 。 德国学者机制研究：Helmholtz、Doudna和、Charpentier分别对不同的 CRISPR及相关系统进行了研究，阐明了DNA空格序列在细菌免疫防御中的机制。目前已经发现了3种CRISPR/Cas系统，其中依赖Cas9蛋白的CRI
8、SPR系统更简单。CRISPR/casCRISPR/cas系统的发现系统的发现14ppt课件CRISPR/Cas9CRISPR/Cas9系统组成系统组成 CRISPR-CasCRISPR-Cas系统是细菌和古细菌中免疫系统（对付攻击者系统是细菌和古细菌中免疫系统（对付攻击者的基因武器的基因武器 ）：）： CRISPRCRISPR序列序列（包括空格序列）：成簇的、规律间隔的短回（包括空格序列）：成簇的、规律间隔的短回文重复（文重复（C Clustered lustered R Regularly egularly I Interspaced nterspaced S Short hort P P
9、alindromic alindromic R Repeat epeat S Sequencesequences）。）。 CasCas：CRISPRCRISPR相关基因（相关基因（CRISPR-associated genesCRISPR-associated genes）15ppt课件RISPR/Cas 系统由 Cas9 核酸内切酶与sgRNA构成. 转录的 sgRNA 折叠成特定的三维结构后与 Cas9 蛋白形成复合体, 指导 Cas9 核酸内切酶识别特定靶标位点, 在 PAM 序列上游处切割 DNA 造成双链 DNA 断裂, 并启动 DNA 损伤修复机制. 从不同菌种中分离的 CRISP
10、R/Cas 系统, 其 CrRNA(或者是人工构建的sgRNA)靶向序列的长度不同, PAM 序列也可能不同。CRISPR-Cas9CRISPR-Cas9的工作原理的工作原理16ppt课件三代主流技术对比：三代主流技术对比： 相关视频17ppt课件第四代：第四代： NgAgo-gDNA NgAgo-gDNA技术技术18ppt课件文章的发表（文章的发表（CNSCNS） 2016 2016年年5 5月月2 2日，河北科技大学的韩春雨与合作者的文章在日，河北科技大学的韩春雨与合作者的文章在被被ScienceScience审稿小半年后被拒，历时审稿小半年后被拒，历时9 9个月终被个月终被Nature
11、Nature BiotechnologyBiotechnology（IF=42IF=42）接收并发表。）接收并发表。沈啸（左），韩春雨（中）、高峰（右）沈啸（左），韩春雨（中）、高峰（右） 19ppt课件NgAgo-gDNANgAgo-gDNA技术原理技术原理 NgAgo-gDNA技术是以DNA作为引导工具的基因编辑技术。NgAgo-gDNA技术的工作原理与CRISPR-Cas9技术有些类似，都是在引导工具的引导下，令核酸酶对特定位点的基因序列进行切割，从而进行基因编辑。不同的是NgAgo-gDNA技术中所用到的引导工具是一段引导DNA（gDNA）而不是CRISPR-Cas9技术中的RNA。由
12、于也不需要通过蛋白（如锌指蛋白）来寻找需要替换的序列，因此，NgAgo-gDNA技术与CRISPR-Cas9技术一样，较之前的基因编辑技术，在操作上要简单方便得多，利于其在应用中的推广。20ppt课件NgAgo-gDNANgAgo-gDNA的优势的优势1、向导设计制作简便：可以像合成PCR引物一样合成短单链DNA向导；向导可直接转染细胞和组织而无需构建向导表达载体。由于向导核酸是DNA而非RNA，因此避免了RNA易于形成复杂的二级结构而带来的失效或者脱靶效应。 2、可编辑基因组内任何位置：Cas9基因组的靶点选择受到PAM区和富含GC区的限制。而NgAgo对靶点选择没有限制，对基因组任何位置都
13、能有效引入双链断裂。21ppt课件3、新的基因编辑工具精确性更高，脱靶率更低。李伟介绍，NgAgo要结合24个碱基，比Cas9结合的19个碱基要长5个碱基，理论上其精确性会提高1024倍。4 、 韩 春 雨 团 队 就 是 利 用 格 氏 嗜 盐 碱 杆 （Natronobacterium gregoryi）的Argonaute蛋白实现了DNA引导的基因组编辑，并发现NgAgo作为一种DNA介导的核酸内切酶，适合在人体细胞（37）中进行基因组编辑。大大扩充了基因编辑的取材范围。”NgAgo-gDNANgAgo-gDNA的优势的优势22ppt课件同行评价同行评价 自然杂志执行主编尼克坎贝尔评论说
14、：“虽然这项新技术还处于初期，但有一些理由让我们相信它与现在普遍使用的技术相比有多种优势，特别是在更精准的基因编辑方面。” “韩春雨的工作是国际一流的技术推进，”北京大学理学部主任、生物学家饶毅教授如此评论。他担任主编的科学类新媒体知识分子刊文，介绍了这项成果的学术细节和价值。 23ppt课件相关争议相关争议 2016年7月29日，澳大利亚国立大学研究者盖坦布尔焦称，尽管他和同事在过去的一个月做了多次尝试，但最终发现：NgAgo无法进行基因编辑。 2016年8月8日，自然杂志网站发表一篇报道，指出，来自澳大利亚、西班牙等国的科研人员表示实验不可重复，另有一些科学家表示曾重复出韩春雨的部分实验，
15、但还需进一步确认 2016年10月11日，河北科技大学副教授韩春雨接受科技日报记者采访，回应无法重复他的NgAgo实验。他依然认为，别人重复不了，细胞污染的可能性最大。 2016年10月27日，自然生物技术新闻发言人日前表示，有一些提交的批评意义如此重大，以至于让作者或编辑推断出论文的基本结论是无效的情况下，论文会被撤稿。 相关视频24ppt课件发展发展“钱景钱景”相当广阔相当广阔比尔比尔盖茨甚至曾经预盖茨甚至曾经预言：超过我的下一个世言：超过我的下一个世界首富必定出自基因领界首富必定出自基因领域。域。基因编辑技术创造生基因编辑技术创造生命奇迹，命奇迹，美国基因编美国基因编辑龙头接连上市辑龙头接连上市。25ppt课件26ppt课件
