1、Targeted Apoptosis of Senescent Cells Restores Tissue Targeted Apoptosis of Senescent Cells Restores Tissue Homeostasis in Response to Chemotoxicity and AgingHomeostasis in Response to Chemotoxicity and AgingBaar et al., 2017, Cell 169, 132147 March 23, 2017 2017 Elsevier Inc.1DNA损伤修复损伤修复orn 背景介绍背景介
2、绍清除清除持续累积持续累积加速疾病、衰老加速疾病、衰老（衰老细胞）（衰老细胞）2 退出细胞周期； 形成持续的促炎表型衰老相关分泌表型衰老相关分泌表型（senescence-associated secretory phenotype，SASP）； 影响组织微环境；早期对于创伤愈合有利。衰老细胞：衰老细胞：正常细胞受到不可修复的压力后形成的持续的损伤状态。年轻组织中：少量衰老细胞分泌SASP，诱导多能性干细胞形成分化并促进组织修复。SASP影响干细胞信号转导以及分化影响干细胞信号转导以及分化。IL-1：抑制干细胞分化；IL-6：诱导并维持干细胞多能性。3衰老组织中：衰老细胞大量堆积，并分泌SAS
3、P，致使其邻近细胞被封锁于持续的类干性样的去分化状态，不能进行分化或组织修复。 衰老衰老- -干性加锁模型干性加锁模型: :清除衰老细胞有利于恢复组织稳态、延缓衰老？清除衰老细胞有利于恢复组织稳态、延缓衰老？Q4FOXOs家族家族:（Forkhead box O family,叉头框转录因子O家族)。作为insulin /IGF信号通路的靶基因，调节体内的抗氧化反应以及DNA损伤修复。 如何靶向衰老细胞如何靶向衰老细胞: :5u FOXO4在衰老细胞中表达上调，并维持其活性；在衰老细胞中表达上调，并维持其活性；uFOXO4-DRI扰乱扰乱PML/DNA-SCARS，衰老细胞释放激活的，衰老细胞
4、释放激活的p53；uFOXO4-DRI选择性并强力靶向衰老细胞进入选择性并强力靶向衰老细胞进入p53依赖的凋亡；依赖的凋亡；uFOXO4-DRI对抗化疗药引起的衰老；对抗化疗药引起的衰老；uFOXO4-DRI抗衰老以及抵抗快速衰老抗衰老以及抵抗快速衰老Xpd TTD/TTD小鼠脆弱的特征；小鼠脆弱的特征；uFOXO4-DRI逆转快速衰老小鼠肾功能下降；逆转快速衰老小鼠肾功能下降；uFOXO4-DRI减轻自然衰老小鼠的衰弱以及肾功能下降。减轻自然衰老小鼠的衰弱以及肾功能下降。n 实验结果实验结果6u FOXO4在衰老细胞中表达上调，并维持其活性；在衰老细胞中表达上调，并维持其活性；衰老细胞衰老细
5、胞模型模型：IMR90原代人成纤维细胞（基因组稳定），电离辐射（电离辐射（IR）诱导细胞衰老。凋亡相关信号通凋亡相关信号通路的变化？路的变化？促凋亡因子PUMA， BIM显著上调；抗凋亡因子Blc-2减少。衰老细胞存活的关键？衰老细胞存活的关键？Q7凋亡相关的转录因子凋亡相关的转录因子：STAT1/2/4， NF-kB， TP53， FOXO4XXX8慢病毒shRNA沉默FOXO4促进衰老细胞凋亡。结论：结论：FOXO4通过抑制凋亡通路促进衰老细胞的存活。通过抑制凋亡通路促进衰老细胞的存活。9u FOXO4-DRI扰乱扰乱PML/DNA-SCARS，衰老细胞释放激活的，衰老细胞释放激活的p53
6、；衰老细胞内FOXO4募集至常染色质区。设计化合物干扰设计化合物干扰FOXO4的功能。的功能。10衰老细胞中，PML小体与含53BP1的DNA-SCARS（染色质改变增强衰老DNA片段）融合并联合调节衰老相关分泌表型SASP的表达。p53：调节凋亡及衰老，并定位于DNA-SCARS，被ATM于Ser15位磷酸化，阻断MDM2介导的降解。高分辨结构显微镜FOXO4结合在PML小体上，与含53BP1的DNA-SCARS紧密相邻。FOXO4与pSer15-p53紧密相邻。11设计多肽设计多肽：选择FOXO4-p53相互作用的结构域，且与FOXO1，3不重叠，在人与小鼠中均保守。FOXO4-DRI：F
7、OXO4肽的D-retro inverso（DRI）异构型，即利用D型氨基酸取代肽链中正常L型氨基酸，并且反转这种肽链主骨架的方向。12NMR-滴定法滴定法：将重组p53的N末端结构域滴定至1H，15N-标记的FOXO4的Forkhead结构域的溶液中，会导致1H，15N HSQC的交叉峰的化学位移，表明p53与FOXO4特异性结合，逐步滴加FOXO4-DRI肽使FOXO4的化学位移恢复至未结合状态。说明FOXO4-DRI肽可以竞争性与FOXO4结合，且较p53亲和力更高。13FOXO4-DRI肽与肽与HIV-TAT（亲水（亲水序列）融合序列）融合：通过形成暂时的孔隙促进非能量依赖的FOXO4
8、-DRI的摄取。摄取：摄取：14FOXO4可调节衰老细胞中p21cip1的表达，通过p21cip1 ，p53可诱导p16in4a不依赖的细胞周期阻滞，并通过转位至线粒体内激活促凋亡基因的表达。Cdkn1a：p21Cip1的编码基因的启动子。其中两个p53结合位点中间包含一段FOXO的靶序列。FOXO4-DRI对于对于p21Cip1以及以及p53的作用？的作用？FOXO4-DRI减少衰老相关的p21Cip1的表达。促进p53聚积并促进活化的pSer15-p53的核外排。结论：结论：FOXO4-DRI干扰干扰FOXO4与与p53结合，破坏衰老相关结合，破坏衰老相关FOXO4/PML/DNA-SCA
9、RS复合物，并导致复合物，并导致p53活化及核外排。活化及核外排。15u FOXO4-DRI选择性靶向衰老细胞进入选择性靶向衰老细胞进入p53依赖的凋亡；依赖的凋亡；FOXO4-DRI抑制衰老细胞存活。实时细胞密度监测。16另外两类靶向衰老细胞的化合物另外两类靶向衰老细胞的化合物：I.槲皮素/达沙替尼非特异性靶向衰老细胞II.泛BCL抑制剂ABT-263/737对衰老细胞有一定选择性但低剂量对正常细胞即有杀伤。FOXO4-DRI对于衰老细胞杀伤更强，且对正常细胞毒性较小。连续多次低剂量给药方案：17p53以及Caspase介导FOXO4-DRI对于衰老细胞的杀伤。FOXO4-DRI诱导衰老细胞
10、内Caspase3/7活化。衰老细胞靶向凋亡衰老细胞靶向凋亡（targeted apoptosis of senescent Cells，TASC）18FOXO4-DRI对于衰老相关疾病是否有治疗作用？对于衰老相关疾病是否有治疗作用？Q体内衰老模型体内衰老模型：I.化疗药引起的衰老阿霉素（Doxo）为代表II.快速衰老模型XpdTTD/TTD小鼠III. 自然衰老模型体内衰老细胞监测体内衰老细胞监测：p16：3MR19u FOXO4-DRI抵抗化疗药引起的衰老以及肝功能损伤；抵抗化疗药引起的衰老以及肝功能损伤；Doxo诱导IMR90细胞衰老以及SASP。20FOXO4-DRI耐受性优于BCL
11、iFOXO4-DRI有可能使细胞易于获得有可能使细胞易于获得DNA损伤，加损伤，加速细胞凋亡？速细胞凋亡？Q提前或同时给予FOXO4-DRI处理不会加重Doxo对细胞的杀伤。仅在Doxo诱导细胞衰老之后促进衰老细胞的死亡。21序贯疗法序贯疗法:Doxo：10 mg/kg，2次FOXO4-DRI：5 mg/kg，4次Doxo诱导小鼠体内细胞衰老以及肝损伤。2223利用GCV靶向清除衰老细胞结论：结论：FOXO4-DRI可以有效清除阿霉素诱导的衰老细胞并削可以有效清除阿霉素诱导的衰老细胞并削弱阿霉素诱导的肝毒性。弱阿霉素诱导的肝毒性。24u FOXO4-DRI逆转快速衰老逆转快速衰老XpdTTD/
12、TTD小鼠衰老脆弱的特征；小鼠衰老脆弱的特征；快速衰老模型快速衰老模型： XpdTTD/TTD小鼠小鼠 三个月即可出现衰老的特征。XPD：编码DNA解旋酶的基因在DNA损伤修复以及转录中发挥重要的作用。TTD：早衰营养不良毛发稀疏综合症。XPD突变。TTD鼠鼠表现为：骨质疏松/硬化/不孕不育/寿命短等衰老特征。2526行为学实验行为学实验：对外界刺激的反应能力增加，活动增加。结论：结论：FOXO4-DRI可以逆转快速衰老小鼠衰老以及脆弱的特征。可以逆转快速衰老小鼠衰老以及脆弱的特征。27u FOXO4-DRI逆转快速衰老小鼠肾功能下降；逆转快速衰老小鼠肾功能下降；衰老小鼠血液中尿素水平升高，肾
13、小管区域SA-GAL染色以及IL-6分泌增加，肾小管细胞FOXO4水平增加。28体外肾切片模型体外肾切片模型：FOXO4-DRI可诱导衰老小鼠肾内凋亡细胞增加。29安全性评价安全性评价：FOXO4-DRI不会引起血小板减少或不可增殖的器官（如心脏）的损伤。30FOXO4-DRI减少SASP并减轻肾损伤。衰老细胞中LMNB1丢失丢失。结论：结论：FOXO4-DRI通过靶向通过靶向肾内的衰老细胞使快速衰老肾内的衰老细胞使快速衰老小鼠的肾功能恢复正常。小鼠的肾功能恢复正常。31u FOXO4-DRI减轻自然衰老小鼠的衰弱以及肾功能下降。减轻自然衰老小鼠的衰弱以及肾功能下降。32结论：结论：FOXO4
14、-DRI靶向清除肾内靶向清除肾内的衰老细胞可以使自然衰老小鼠的的衰老细胞可以使自然衰老小鼠的肾功能恢复正常。肾功能恢复正常。33Highlights1.一种改良的FOXO4-p53干扰肽可以导致衰老细胞内p53的核外排2.该FOXO4多肽可诱导衰老细胞靶向凋亡（ targeted apoptosis of senescent cells, TASC）3.TASC效应可以削弱阿霉素诱导的肝毒性4.TASC可以使快速衰老以及自然衰老的小鼠重获青春（健康，毛发变密，肾功能恢复）n 讨论讨论FOXO4：衰老细胞存活的中心。34清除衰老细胞：没那么简单！清除衰老细胞：没那么简单！还有很多悬而未决的问题3536
