1、 实验一实验一 生物化学实验技能培训生物化学实验技能培训 实验二实验二 蛋白质部分性质实验蛋白质部分性质实验 实验三实验三 Folin-wu Folin-wu法定量测定血糖的含量法定量测定血糖的含量 实验四实验四 Folin- Folin-酚试剂法测定蛋白质浓度酚试剂法测定蛋白质浓度 实验五实验五 氨基酸的纸层析氨基酸的纸层析 实验六实验六 醋酸纤维薄膜电泳血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳血清蛋白 实验七实验七 胰蛋白酶的活力测定胰蛋白酶的活力测定 实验八实验八 酵母酵母RNARNA的提取及鉴定的提取及鉴定 实验九实验九 DNA DNA的定量测定的定量测定 实验十实验十 水果中维生素水果中维生素C C
2、的定量测定的定量测定 实验十一实验十一 聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳牛血清聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳牛血清生物化学实验技能培训生物化学实验技能培训通过生物化学实验应该做到： 学习设计一个实验的基本思路，掌握各个实验的基本原理，学会严密地组织自己的实验，合理地安排实验步骤和时间。 训练实验的动手能力，学会熟练地使用各种生物化学实验仪器。 学会准确翔实地记录实验现象和数据的技能，提高实验报告的写作能力，能够整齐清洁地进行所有的实验，培养严谨细致的科学作风。 掌握生物化学的各种基本实验方法和实验技术，为今后参加科研工作打下坚实的基础。实验室规则实验室规则 实验前必须认真预习实验内容，明确本次实验的目的和要求，
3、掌握实验原理。 实验时自觉遵守实验室纪律，保持室内安静，不大声说笑和喧哗。 实验过程中要听从教师指导，认真按照实验步骤和操作规程进行实验。若想改进和设计新的实验方法，必须取得教师的同意。实验时认真进行实验记录，实验完毕及时整理数据，按时上交实验报告。 实验台面、称量台、药品架、水池以及各种实验仪器内外都必须保持清洁整齐，药品称完后立即盖好瓶盖放回药品架，严禁瓶盖及药勺混杂，切勿使药品（尤其是NaOH）洒落在天平和实验台面上，毛刷用后必须立即挂好，各种器皿不得丢弃在水池内。 配制试剂按实验实际使用量配制，多余的重要试剂和各种有机试剂要按教师要求进行回收；昂贵试剂需要回收，不得丢弃。 配制的试剂和
4、实验过程中的样品，尤其是保存在冰箱和冷室中的样品，必须贴上标签、写上品名、浓度、姓名和日期等，放在冰箱中的易挥发溶液和酸性溶液，必须严密封口。 强酸强碱以及其他实验废液必须倒入废液桶。电泳后的凝胶和各种废物不得倒入水池，只能倒入废物桶。 使用贵重精密仪器应严格遵守操作规程。使用分光光度计时不得将溶液洒在仪器内外和地面上。仪器发生故障应立即报告教师，未经许可不得自己随意检修。 实验室内严禁吸烟、饮水和进食， 严禁用嘴吸移液管和虹吸管。易燃液体不得接近明火和电炉，凡产生烟雾、有害气体和不良气味的实验，均应在通风条件下进行。 实验完毕必须及时洗净并放好各种玻璃仪器，插好自动部分收集器上的试管，保持实
5、验台面和实验柜内的整洁。 严禁抄拿他组仪器，不得将器皿遗弃在分光光度计内和其他实验台面上，打破了玻璃仪器要及时向教师报告，并自觉登记，学期结束时按规定进行处理。 每日实验完毕，值日生要认真做好实验室的卫生值日工作。最后离开实验室的实验人员，必须检查并关好水、电、门、窗。蛋白质部分性质实验蛋白质部分性质实验 蛋白质颜色反应和沉淀反蛋白质颜色反应和沉淀反应应 蛋白质分子中某种或某些集团可与显色剂作用，蛋白质分子中某种或某些集团可与显色剂作用，产生颜色。不同的蛋白质由于所含的氨基酸不完全相产生颜色。不同的蛋白质由于所含的氨基酸不完全相同，颜色反应亦不完全相同。颜色反应不是蛋白质的同，颜色反应亦不完全
6、相同。颜色反应不是蛋白质的专一反应，一些非蛋白物质也可产生同样的颜色反应，专一反应，一些非蛋白物质也可产生同样的颜色反应，因此不能根据颜色反应的结果来决定被测物是否为蛋因此不能根据颜色反应的结果来决定被测物是否为蛋白质。另外，颜色反应也可作为一些常用蛋白质定量白质。另外，颜色反应也可作为一些常用蛋白质定量测定的依据。测定的依据。第一部分第一部分 蛋白质的颜色反应蛋白质的颜色反应1 1、吸管、吸管 2 2、滴管、滴管 3 3、试管、试管 4 4、电炉、电炉 5 5、pHpH试纸试纸 6 6、水、水浴锅浴锅1 1、卵清蛋白液：鸡蛋清用蒸馏水稀释、卵清蛋白液：鸡蛋清用蒸馏水稀释10-2010-20倍
7、，倍，3-43-4层纱布过滤，滤液放层纱布过滤，滤液放在冰箱里冷藏备用。在冰箱里冷藏备用。2 2、 0.5%0.5%苯酚：苯酚：1g1g苯酚加蒸馏水稀释至苯酚加蒸馏水稀释至200ml200ml。3 3、MillonsMillons试剂：试剂：40g40g汞溶于汞溶于60ml60ml浓硝酸（水浴加温助溶）溶解后，冷浓硝酸（水浴加温助溶）溶解后，冷却，加二倍体积的蒸馏水，混匀，取上清夜备用。此试剂可长期保存。却，加二倍体积的蒸馏水，混匀，取上清夜备用。此试剂可长期保存。4 4、1%CuSO1%CuSO4 4：1g CuSO1g CuSO4 4晶体溶于蒸馏水，稀释至晶体溶于蒸馏水，稀释至100ml1
8、00ml5 5、10%NaOH10%NaOH：10g NaOH10g NaOH溶于蒸馏水，稀释至溶于蒸馏水，稀释至100ml100ml6 6、0.1%0.1%茚三酮溶液：茚三酮溶液：0.1g0.1g茚三酮溶于茚三酮溶于95%95%的乙醇并稀释至的乙醇并稀释至100ml.100ml.7 7、尿素晶体、尿素晶体 8 8、浓硝酸、浓硝酸 9 9、冰醋酸、冰醋酸 1010、浓硫酸、浓硫酸（一）米伦（一）米伦（MillonsMillons）反应）反应：米伦试剂是硝酸、亚硝酸、硝酸汞、亚硝：米伦试剂是硝酸、亚硝酸、硝酸汞、亚硝酸汞的混合物。他能与苯酚及某些二羟基苯衍生物起酸汞的混合物。他能与苯酚及某些二羟
9、基苯衍生物起颜色反应。组成蛋白质的氨基酸中只有酪氨酸含苯酚颜色反应。组成蛋白质的氨基酸中只有酪氨酸含苯酚基团，因此该反应为蛋白质中酪氨酸存在的依据。基团，因此该反应为蛋白质中酪氨酸存在的依据。：1 1、苯酚实验：、苯酚实验：取取0.5%0.5%苯酚溶液苯酚溶液1ml1ml于试管中，加于试管中，加MillonsMillons试剂试剂0.5ml0.5ml，于电炉上小心加热，溶液即出现玫瑰红色。，于电炉上小心加热，溶液即出现玫瑰红色。2 2、蛋白质实验：、蛋白质实验：取取2ml2ml蛋白液，加蛋白液，加MillonsMillons试剂试剂0.5ml0.5ml，出现白色，出现白色的蛋白质沉淀，小心加热
10、，凝固的蛋白质出现红色。的蛋白质沉淀，小心加热，凝固的蛋白质出现红色。（二）双缩脲反应（二）双缩脲反应：尿素被加热，则两分子的尿素放出一分子氨：尿素被加热，则两分子的尿素放出一分子氨而形成双缩脲。双缩脲在碱性环境中，能与硫酸铜结合而形成双缩脲。双缩脲在碱性环境中，能与硫酸铜结合成紫色的化合物，此反应称为双缩脲反应。蛋白质分子成紫色的化合物，此反应称为双缩脲反应。蛋白质分子中含有肽键与缩脲结构相似，故也能进行此反应。双缩中含有肽键与缩脲结构相似，故也能进行此反应。双缩脲反应可作为蛋白质定量测定的依据。脲反应可作为蛋白质定量测定的依据。 ：1 1、尿素实验、尿素实验取少量尿素晶体放在干燥的试管中，
11、微火加热使其取少量尿素晶体放在干燥的试管中，微火加热使其熔化成液体，此时有氨气放出，可用湿润的试纸检验，熔化成液体，此时有氨气放出，可用湿润的试纸检验，至液体重新结晶出现白色固体时，停止加热，冷却。然至液体重新结晶出现白色固体时，停止加热，冷却。然后加后加10%NaOH10%NaOH溶液溶液1ml1ml，摇匀，再加，摇匀，再加2-42-4滴滴1% CuSO1% CuSO4 4溶液，溶液，混匀，观察有无紫色出现。混匀，观察有无紫色出现。2 2、蛋白液实验、蛋白液实验取蛋白液取蛋白液1ml1ml，加，加10%NaOH10%NaOH溶液溶液1ml1ml，摇匀，再加，摇匀，再加2-42-4滴滴1% C
12、uSO1% CuSO4 4溶液，混匀，观察有无紫色出现。溶液，混匀，观察有无紫色出现。（三）黄色反应（三）黄色反应：蛋白质分子中含有苯环结构的氨基酸（如：蛋白质分子中含有苯环结构的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸等），于浓硝酸可反应并生成黄色物酪氨酸、色氨酸等），于浓硝酸可反应并生成黄色物质，此物质在碱性环境下变为桔黄色的硝基苯衍生物质，此物质在碱性环境下变为桔黄色的硝基苯衍生物硝醌酸等。硝醌酸等。：取一支试管，加入：取一支试管，加入1ml1ml蛋白液及浓硝酸蛋白液及浓硝酸5 5滴。加滴。加热，冷却后注意颜色变化。然后再加入热，冷却后注意颜色变化。然后再加入10%NaOH10%NaOH溶液溶液1ml1
13、ml，颜色有什么变化？，颜色有什么变化？（四）茚三酮反应（四）茚三酮反应：蛋白质与茚三酮共热，产生兰紫色的还原茚三：蛋白质与茚三酮共热，产生兰紫色的还原茚三酮、茚三酮和氨的缩合物。此反应为一切蛋白质及酮、茚三酮和氨的缩合物。此反应为一切蛋白质及a-a-氨基氨基酸所共有。亚氨基酸（脯氨酸和羟脯氨酸）与茚三酮反应酸所共有。亚氨基酸（脯氨酸和羟脯氨酸）与茚三酮反应呈黄色，含有氨基的其他物质亦呈此反应。呈黄色，含有氨基的其他物质亦呈此反应。：取蛋白液：取蛋白液1ml1ml于试管中，加于试管中，加4-84-8滴茚三酮溶液，加热至滴茚三酮溶液，加热至沸，即有蓝紫色出现。沸，即有蓝紫色出现。第二部分第二部分
14、 蛋白质的沉淀反应蛋白质的沉淀反应蛋白质是亲水性胶体，在溶液中的稳定性与质点蛋白质是亲水性胶体，在溶液中的稳定性与质点大小、电荷、水化作用有关，但其稳定性是有条件的，大小、电荷、水化作用有关，但其稳定性是有条件的，相对的。如果条件发生了变化，破坏了蛋白质的稳定相对的。如果条件发生了变化，破坏了蛋白质的稳定性，蛋白质就会从溶液中沉淀出来。性，蛋白质就会从溶液中沉淀出来。 蛋白质胶体溶液的稳定因素：水化膜、带电荷蛋白质胶体溶液的稳定因素：水化膜、带电荷。当破。当破坏这两个因素时，蛋白质中从溶液中析出而产生沉淀。坏这两个因素时，蛋白质中从溶液中析出而产生沉淀。1 1、移液管、移液管 2 2、吸管、吸
15、管 3 3、试管、试管 4 4、电炉、电炉1 1、卵清蛋白液：鸡蛋清用蒸馏水稀释、卵清蛋白液：鸡蛋清用蒸馏水稀释10-2010-20倍，倍，3-43-4层纱布过滤，滤液层纱布过滤，滤液放在冰箱里冷藏备用。放在冰箱里冷藏备用。2 2、饱和硫酸铵溶液：、饱和硫酸铵溶液：100ml100ml蒸馏水中加硫酸铵至饱和。蒸馏水中加硫酸铵至饱和。3 3、硫酸铵晶体：用研钵研成碎末。、硫酸铵晶体：用研钵研成碎末。4 4、95%95%乙醇。乙醇。5 5、醋酸铅溶液：、醋酸铅溶液：1g1g醋酸铅溶于蒸馏水并稀释至醋酸铅溶于蒸馏水并稀释至100ml100ml6 6、硫酸铜溶液：、硫酸铜溶液：1g CuSO1g Cu
16、SO4 4晶体溶于蒸馏水，稀释至晶体溶于蒸馏水，稀释至100ml100ml7 7、氯化钠晶体、氯化钠晶体8 8、10%10%三氯乙酸溶液：三氯乙酸溶液：10g10g三氯乙酸溶于蒸馏水中并稀释至三氯乙酸溶于蒸馏水中并稀释至100ml100ml9 9、饱和苦味酸溶液：、饱和苦味酸溶液：100ml100ml蒸馏水中加苦味酸至饱和。蒸馏水中加苦味酸至饱和。1010、1%1%醋酸溶液。醋酸溶液。（一）蛋白质的盐析作用一）蛋白质的盐析作用：向蛋白质中加入大量的中性盐（硫酸铵、硫酸钠：向蛋白质中加入大量的中性盐（硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等），使蛋白质胶体颗粒脱水，破坏其水化或氯化钠等），使蛋白质胶体颗粒脱水，
17、破坏其水化层，同时它所带有的电荷亦被中性盐上所带的相反电层，同时它所带有的电荷亦被中性盐上所带的相反电荷的离子所中和。于是稳定因素被破坏，蛋白质聚集荷的离子所中和。于是稳定因素被破坏，蛋白质聚集沉淀。盐析作用一般不使蛋白质变性。沉淀。盐析作用一般不使蛋白质变性。：1 1、取试管、取试管1 1支，加蛋白液支，加蛋白液2ml2ml，然后加固体硫酸铵，然后加固体硫酸铵( (加的过程要缓慢，加的量要少随时摇匀），直至其饱加的过程要缓慢，加的量要少随时摇匀），直至其饱和（大约为和（大约为50%50%）。摇匀静置数分钟，则有球蛋白析出。）。摇匀静置数分钟，则有球蛋白析出。 2 2、将上述混合液过滤。向滤液
18、中逐渐加入少量固、将上述混合液过滤。向滤液中逐渐加入少量固体硫酸铵（每次加入量约为米粒大小），边加边摇，体硫酸铵（每次加入量约为米粒大小），边加边摇，直至饱和为止，此时析出为清蛋白。再加入少量蒸馏直至饱和为止，此时析出为清蛋白。再加入少量蒸馏水，观察沉淀是否溶解。水，观察沉淀是否溶解。（二）有机溶剂沉淀蛋白质（二）有机溶剂沉淀蛋白质：某些有机溶剂（如乙醇、甲醇、丙醇等），因引：某些有机溶剂（如乙醇、甲醇、丙醇等），因引起蛋白质脱去水化层以及降低介电常数而增加带电质起蛋白质脱去水化层以及降低介电常数而增加带电质点间的相互作用，致使蛋白质颗粒容易凝聚而沉淀。点间的相互作用，致使蛋白质颗粒容易凝聚而
19、沉淀。：取一试管加蛋白液：取一试管加蛋白液1ml1ml，加入晶体氯化钠少许，加入晶体氯化钠少许，待溶解后再加待溶解后再加95%95%乙醇乙醇3ml,3ml,摇匀，观察现象。摇匀，观察现象。（三）重金属盐与某些有机酸沉淀蛋白质（三）重金属盐与某些有机酸沉淀蛋白质：重金属离子（如：重金属离子（如PbPb2+2+、CuCu2+2+等）与蛋白质的羧基等）与蛋白质的羧基等结合生成不溶性的金属盐类而沉淀，同时蛋白质发等结合生成不溶性的金属盐类而沉淀，同时蛋白质发生变性。某些有机酸的酸根则与蛋白质的自由氨基结生变性。某些有机酸的酸根则与蛋白质的自由氨基结合而沉淀。合而沉淀。 ：1 1、取试管、取试管2 2支
20、，各加蛋白液支，各加蛋白液2ml2ml，一支管中滴加，一支管中滴加1%1%醋酸铅溶液，另一支管中滴加醋酸铅溶液，另一支管中滴加1%1%硫酸铜溶液，至有硫酸铜溶液，至有沉淀产生。沉淀产生。（四）生物碱试剂沉淀蛋白质（四）生物碱试剂沉淀蛋白质：植物体内具有显著生理作用的含氮碱性化合物成为：植物体内具有显著生理作用的含氮碱性化合物成为生物碱。能沉淀生物碱或与其产生颜色反应的物质称为生物碱。能沉淀生物碱或与其产生颜色反应的物质称为生物碱试剂，如鞣酸等。当溶液生物碱试剂，如鞣酸等。当溶液PHPH小于等电点时，蛋白小于等电点时，蛋白质颗粒带正电荷，容易与生物碱试剂的负离子发生反应质颗粒带正电荷，容易与生物
21、碱试剂的负离子发生反应而沉淀。而沉淀。：取：取2 2支试管，分别加入蛋白液支试管，分别加入蛋白液2ml2ml及醋酸及醋酸4-54-5滴，再滴，再加饱和苦味酸和鞣酸数滴，观察现象加饱和苦味酸和鞣酸数滴，观察现象。（一）（一） 米伦（米伦（MillonsMillons）反应）反应1 1、苯酚实验：取、苯酚实验：取0.5%0.5%苯酚溶液苯酚溶液1ml1ml于试管中，于试管中，加加MillonsMillons试剂试剂0.5ml0.5ml，电炉小心加热观，电炉小心加热观察颜色变化。察颜色变化。2 2、蛋白质实验：取、蛋白质实验：取2ml2ml蛋白液，加蛋白液，加MillonsMillons试剂试剂0.
22、5ml0.5ml，出现白色的蛋白质沉淀，小，出现白色的蛋白质沉淀，小心加热，观察现象。心加热，观察现象。（二）（二） 双缩脲反应双缩脲反应1 1、取少量尿素晶体放在干燥的试管中，微火、取少量尿素晶体放在干燥的试管中，微火加热熔化，至重新结晶时冷却。然后加加热熔化，至重新结晶时冷却。然后加10%NaOH10%NaOH溶液溶液1ml1ml，摇匀，再加，摇匀，再加2-42-4滴滴1% 1% CuSOCuSO4 4溶液，混匀，观察现象。溶液，混匀，观察现象。 2 2、取蛋白液、取蛋白液1ml1ml，加，加10%NaOH10%NaOH溶液溶液1ml1ml，摇匀，摇匀，再加再加2-42-4滴滴1% CuS
23、O1% CuSO4 4溶液，混匀，观察现溶液，混匀，观察现象。象。（三）（三） 黄色反应黄色反应 取一支试管，加入取一支试管，加入1ml1ml蛋白液及浓硝酸蛋白液及浓硝酸5 5滴。加热，冷却后注意颜色变化。然后再滴。加热，冷却后注意颜色变化。然后再加入加入10%NaOH10%NaOH溶液溶液1ml1ml，颜色有什么变化？，颜色有什么变化？（四）（四） 茚三酮反应茚三酮反应 取蛋白液取蛋白液1ml1ml于试管中，加于试管中，加1010滴茚三酮溶滴茚三酮溶液，加热至沸，即有蓝紫色出现液，加热至沸，即有蓝紫色出现。1 1、取试管、取试管1 1支，加蛋白液支，加蛋白液2ml2ml，然后加，然后加固体硫
24、酸铵固体硫酸铵( (加的过程要缓慢，加的量加的过程要缓慢，加的量要少，随时摇匀），直至其饱和（大要少，随时摇匀），直至其饱和（大约为约为50%50%）。摇匀静置数分钟，则有球）。摇匀静置数分钟，则有球蛋白析出。蛋白析出。蛋白质的颜色反应蛋白质的颜色反应蛋白质的沉淀蛋白质的沉淀注意事项：1.吸取蛋白液的移液管必须专管专用，否则容易污染其他试剂。2.米伦试剂含有腐蚀性物质，一定小心使用。3.电炉加热试管时，试管口严禁朝向人。http:/222.195.234.199/openclass登录名：自己的学号密码：自己的学号大家先把电子版的实验报告作好，然后在周五或周六以后再上传文件实验报告要求：1目的
25、2原理3实验仪器4实验试剂5实验步骤6实验结果7实验分析下次实验：血糖的定量测定-folin-wu法Folin-WuFolin-Wu法法定量测定血糖的含量定量测定血糖的含量1.1.氧化供能氧化供能 2.2.人体的主要组成成分之一人体的主要组成成分之一 糖蛋白、糖脂、蛋白多糖、核糖；转化成脂肪糖蛋白、糖脂、蛋白多糖、核糖；转化成脂肪和某些非必需氨基酸等和某些非必需氨基酸等3.3.糖代谢紊乱糖代谢紊乱供能障碍供能障碍一系列代谢变化一系列代谢变化 血糖：血糖：指血液中的单糖：葡萄糖指血液中的单糖：葡萄糖血糖水平：血糖水平：血浆中葡萄糖浓度血浆中葡萄糖浓度血糖总维持在恒定水平：血糖总维持在恒定水平：3
26、.93.96.7mmol/L6.7mmol/L 临床：临床：血糖检测是目前诊断糖代谢异常相关疾病的血糖检测是目前诊断糖代谢异常相关疾病的主要依据。主要依据。科研：科研：在代谢疾病的研究中，常测定血糖。在某些在代谢疾病的研究中，常测定血糖。在某些药物的研究中，也涉及血糖的测定。药物的研究中，也涉及血糖的测定。v调节血糖水平的激素：调节血糖水平的激素：胰岛素、胰高胰岛素、胰高血糖素、糖皮质激素和肾上腺素。血糖素、糖皮质激素和肾上腺素。v血糖水平异常：血糖水平异常：高血糖及糖尿病；高血糖及糖尿病；低血糖低血糖 指空腹血糖浓度超过7.3mmol/L,有生理性和病理性之分，临床上最常见的病理性高血糖症是
27、糖尿病。是一种慢性、复杂的代谢紊乱性疾病,系胰岛素绝对不足或相对不足，以高血糖症为基本生化特点。同时伴有糖、脂类、蛋白质、水、电解质和酸碱平衡紊乱，甚至出现一系列并发症如眼、肾的微血管病变及神经病变等。 症状随机血浆葡萄糖症状随机血浆葡萄糖 11.1mmol/L, 11.1mmol/L,或空腹或空腹血浆葡萄糖血浆葡萄糖 7.0mmol/L 7.0mmol/L。症状不典型者需另。症状不典型者需另一天再次证实。随机血糖是指一天中的任一时一天再次证实。随机血糖是指一天中的任一时间采血测得的血糖浓度。间采血测得的血糖浓度。糖尿病典型的症状是糖尿病典型的症状是“三多一少三多一少”，即多饮、，即多饮、多尿
28、、多食及消瘦多尿、多食及消瘦测定测定方法方法酶法：酶法：（1 1）己糖激酶法（）己糖激酶法（HKHK）（2 2）葡萄糖氧化酶法（）葡萄糖氧化酶法（GODGOD法）法）特异性高，灵敏度高，干扰因素少特异性高，灵敏度高，干扰因素少，适用于自动化适用于自动化分析，为葡萄糖测定的分析，为葡萄糖测定的参考方法参考方法，但是试剂较贵但是试剂较贵无机化学法：无机化学法： Folin-WuFolin-Wu法，特异性差法，特异性差有机化学法：有机化学法：邻甲苯胺法、联苯胺法、氨基联苯法邻甲苯胺法、联苯胺法、氨基联苯法干扰因素多干扰因素多 掌握掌握FolinFolinWuWu法测定血糖含量的原理和方法测定血糖含量
29、的原理和方法。法。 学会制备无蛋白血滤液。学会制备无蛋白血滤液。 掌握掌握72007200型可见分光光度计的使用方法型可见分光光度计的使用方法。葡萄糖是一种多羟基的醛类化合物。其醛基具有还原性，葡萄糖是一种多羟基的醛类化合物。其醛基具有还原性，与碱性铜试剂混合加热，葡萄糖分子中的醛基被氧化成羧与碱性铜试剂混合加热，葡萄糖分子中的醛基被氧化成羧基，基，CuCu2+2+即被葡萄糖还原成即被葡萄糖还原成CuCu+ +（CuCu2 2O O）而沉淀。）而沉淀。 CuCu2+2+( CuSO( CuSO4 4 )+)+葡萄糖葡萄糖 CuCu+ + （CuCu2 2O O）无蛋白血滤液中的葡萄糖和酸性钼酸
30、盐溶液共热反应无蛋白血滤液中的葡萄糖和酸性钼酸盐溶液共热反应, , CuCu2 2O O又把酸性钼酸试剂（又把酸性钼酸试剂（MoMo6+6+）还原成低价的蓝色钼化合）还原成低价的蓝色钼化合物物钼蓝钼蓝 。CuCu2 2O+O+酸性钼酸试剂酸性钼酸试剂 蓝色钼化合物蓝色钼化合物 ODOD420420比色比色 血滤液中葡萄糖的含量与产生的血滤液中葡萄糖的含量与产生的CuCu2 2O O成正比，而成正比，而CuCu2 2O O的量的量与产生的钼化合物的量成正比。可用比色法定量的测定。与产生的钼化合物的量成正比。可用比色法定量的测定。1 1、25mL25mL血糖管血糖管3 3支；支；2 2、血糖管橡胶
31、塞、血糖管橡胶塞3 3个；个；3 3、沸水浴小锅、沸水浴小锅1 1个；个； 4 4、100mL100mL锥形瓶锥形瓶2 2个；个；5 5、电炉、电炉1 1个；个；6 6、滤纸、滤纸1 1盒；盒；7 7、吸耳球、吸耳球2 2个；个； 8 8、72007200型分光光度计型分光光度计1 1台台; ;血糖管血糖管7200型分光光度计型分光光度计 1 1、标准葡萄糖溶液（、标准葡萄糖溶液（0.1mg/ml0.1mg/ml）(1)1%(1)1%葡萄糖母液：称取葡萄糖母液：称取1.000g1.000g葡萄糖，溶于蒸馏水，稀释并定容至葡萄糖，溶于蒸馏水，稀释并定容至100ml100ml。(2)(2)葡萄糖标
32、准液：取葡萄糖标准液：取1.0ml1.0ml葡萄糖母液于葡萄糖母液于100ml100ml容量瓶中，加蒸馏水定容。容量瓶中，加蒸馏水定容。2 2、10%10%钨酸钠溶液：钨酸钠溶液：称取钨酸钠称取钨酸钠10g10g，溶于蒸馏水并定容至，溶于蒸馏水并定容至100100毫升。毫升。3 3、0.33mol/LH0.33mol/LH2 2SOSO4 4溶液：溶液：于于53ml53ml蒸馏水中加入蒸馏水中加入1ml1ml的浓硫酸。的浓硫酸。4 4、碱性硫酸铜溶液、碱性硫酸铜溶液 A A液：无水碳酸钠液：无水碳酸钠35g35g，酒石酸钠，酒石酸钠13g13g及碳酸氢钠及碳酸氢钠11g11g溶于蒸馏水，稀释溶
33、于蒸馏水，稀释定容至定容至1000ml.1000ml. B B液：硫酸铜晶体液：硫酸铜晶体5g5g，溶于蒸馏水并定容至，溶于蒸馏水并定容至100ml100ml。 临用时，临用时，A A液：液：B B液液=9=9：1 1混合（体积比），混合液于冰箱中保存混合（体积比），混合液于冰箱中保存（44）。）。 5 5、酸性钼酸盐溶液：、酸性钼酸盐溶液：称取钼酸钠称取钼酸钠600g,600g,用少量蒸馏水溶解后倾入用少量蒸馏水溶解后倾入2000ml 2000ml 的容量瓶中，加蒸的容量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀，倾入另一较大的试剂瓶中，加溴水馏水至刻度，摇匀，倾入另一较大的试剂瓶中，加溴水0.5ml0.5
34、ml，摇匀，摇匀，静止数小时后取上清夜静止数小时后取上清夜500ml500ml，于，于1000ml1000ml容量瓶中，徐徐加入容量瓶中，徐徐加入225ml85%225ml85%磷酸，边加边摇匀，再加磷酸，边加边摇匀，再加25%25%硫酸硫酸150ml150ml。置暗处次日，用空气将剩余的溴赶去。然后加置暗处次日，用空气将剩余的溴赶去。然后加99%99%醋酸醋酸75ml75ml，摇匀，摇匀，用蒸馏水稀释定容至用蒸馏水稀释定容至1000ml,1000ml,贮于棕色瓶中。贮于棕色瓶中。 1 1、无蛋白血滤液的制备、无蛋白血滤液的制备： 用用5ml5ml移液管吸取全血（已加抗凝剂）移液管吸取全血（已
35、加抗凝剂）1ml,1ml,缓缓缓缓放入放入100ml100ml锥形瓶中，加蒸馏水锥形瓶中，加蒸馏水7ml7ml，摇匀，溶血后（血，摇匀，溶血后（血液变为红色透明）加液变为红色透明）加10%10%钨酸钠钨酸钠1ml1ml，摇匀，摇匀. .。 再加再加0.33mol/L H0.33mol/L H2 2SOSO4 41ml1ml，边加边摇，加毕充分摇匀，边加边摇，加毕充分摇匀，放置放置5 51515分钟，至沉淀变为分钟，至沉淀变为暗棕色暗棕色（如不变色可再（如不变色可再加加0.33mol/L H0.33mol/L H2 2SOSO4 41-21-2滴）。滴）。 用用干滤纸干滤纸过滤。先倾入少许，待滤
36、纸湿润后在全部过滤。先倾入少许，待滤纸湿润后在全部倒入，如滤液不清需重新过滤。每毫升无蛋白血滤倒入，如滤液不清需重新过滤。每毫升无蛋白血滤液相当于液相当于1/10ml1/10ml全血。全血。2 2、血糖的定量测定：、血糖的定量测定： 取取25ml25ml的血糖管的血糖管3 3支，编号。第一支血糖管中加入支，编号。第一支血糖管中加入2ml2ml蒸馏水蒸馏水（空白管）；第二支血糖管中加（空白管）；第二支血糖管中加2ml2ml标准葡萄糖液；用吸管标准葡萄糖液；用吸管吸取无蛋白血滤液吸取无蛋白血滤液2ml2ml，放入第三支血糖管中。，放入第三支血糖管中。 然后向三支血糖管中各加入然后向三支血糖管中各加
37、入2ml2ml新配制的碱性硫酸铜溶液，新配制的碱性硫酸铜溶液，同时置于沸水浴中同时置于沸水浴中8 8分钟，取出，在流水中迅速冷却后分钟，取出，在流水中迅速冷却后, ,勿摇勿摇动动，各加，各加4ml4ml酸性钼酸盐溶液。酸性钼酸盐溶液。 一分钟后，用蒸馏水稀释至一分钟后，用蒸馏水稀释至25ml25ml，混匀，用，混匀，用72007200分光光度计分光光度计在在420nm420nm波长处比色，以空白管调节零点。波长处比色，以空白管调节零点。按下式计算按下式计算100ml100ml全血中所含血糖的含量全血中所含血糖的含量m=Am=A1 1/A/A0 0C C0 00.1100100式中式中: : m
38、 m=100ml=100ml全血中含血糖毫克数全血中含血糖毫克数 ; ; C C0 0= =标准液葡萄糖含量标准液葡萄糖含量（0.1mg/ml0.1mg/ml）；）；A A1 1= =样品液光吸收值样品液光吸收值 ; ; A A0 0= =标准液光吸收值标准液光吸收值 0.10.1：1ml1ml无蛋白血溶液相对于无蛋白血溶液相对于0.1ml0.1ml全血全血空白管标准管（A0）样品管（ A1 ）OD4200OD4200OD4200OD平均01.1.加硫酸、钨酸钠时，要边加边摇匀加硫酸、钨酸钠时，要边加边摇匀2.2.沉淀由鲜红变为暗棕色，是因钨酸钠与硫酸生成钨酸，在沉淀由鲜红变为暗棕色，是因钨酸
39、钠与硫酸生成钨酸，在适当酸度时，使血红蛋白变性沉淀，如果沉淀不变暗棕色或适当酸度时，使血红蛋白变性沉淀，如果沉淀不变暗棕色或重新过滤后仍混浊，是因为血液中所加抗凝剂过多，可以加重新过滤后仍混浊，是因为血液中所加抗凝剂过多，可以加入入1010硫酸硫酸1-21-2滴，待暗棕色后再过滤。滴，待暗棕色后再过滤。3.3.用定量滤纸过滤后应该得到完全澄清无色之无蛋白血滤液。用定量滤纸过滤后应该得到完全澄清无色之无蛋白血滤液。如果得到仍带有红色的血滤液则说明蛋白质未被完全去除。如果得到仍带有红色的血滤液则说明蛋白质未被完全去除。 1 1、实验过程中那些操作可能影响实验结果的、实验过程中那些操作可能影响实验结
40、果的准确性？准确性？2 2、实验中，血糖管有什么作用？、实验中，血糖管有什么作用？3 3、实验过程中，为什么要用流水冷却加入碱、实验过程中，为什么要用流水冷却加入碱性硫酸铜液反应后的血糖管？性硫酸铜液反应后的血糖管？1 1、无蛋白血滤液的制备、无蛋白血滤液的制备：蒸馏水蒸馏水7ml 7ml 摇匀摇匀 10%10%钨酸钠钨酸钠1ml 1ml 摇匀摇匀 0.33mol/L H0.33mol/L H2 2SOSO4 41ml 1ml 边加边摇边加边摇, ,加毕充分摇匀加毕充分摇匀 放置放置515分分(沉淀变为暗棕色沉淀变为暗棕色)(如不变色如不变色,再加再加0.33mol/L H2SO412滴滴 )
41、干滤纸过滤干滤纸过滤 无蛋白血滤液无蛋白血滤液( (每毫升相当于每毫升相当于1/10ml1/10ml全血全血) )20ml20ml锥形瓶锥形瓶溶血溶血( (变为红色透明变为红色透明) )用用5ml5ml移液管取全血移液管取全血1ml1ml（已加抗凝剂（已加抗凝剂2、血糖的定量测定：、血糖的定量测定：1 1号管号管2ml2ml蒸馏水蒸馏水2ml2ml新新配制的配制的碱性硫碱性硫酸铜溶酸铜溶液液同时置同时置于沸水于沸水浴中浴中8min8min，取出取出在流水在流水中迅速中迅速冷却冷却4ml4ml酸酸性钼酸性钼酸盐溶液盐溶液一分钟一分钟后，用后，用蒸馏水蒸馏水稀释至稀释至25ml25ml，混匀混匀用
42、用72207220分分光光度计光光度计在在420420波长波长处比色处比色, ,以以空白管调空白管调节零点节零点2 2号管号管2ml2ml标准葡萄糖标准葡萄糖液液3 3号管号管2ml2ml无蛋白血滤无蛋白血滤液液m=OD1/OD2 C 10 100朗伯定律朗伯定律：A=kA=k1 1L L 比尔定律比尔定律：A=kA=k2 2C C朗伯朗伯- -比尔定律比尔定律：如同时考虑液：如同时考虑液层厚度和溶液浓度对吸光度层厚度和溶液浓度对吸光度的影响，则吸光度与溶质的的影响，则吸光度与溶质的浓度和溶液的厚度的乘积成浓度和溶液的厚度的乘积成正比。正比。 A=KLC A=KLC A A标标=KC=KC标标
43、L LA A样样=KC=KC样样L L 标准品法测定未知样品含量标准品法测定未知样品含量C C样样=A A样样A A标标C C标标连接仪器电源线，确定仪器供电电源有良好的接地性能。连接仪器电源线，确定仪器供电电源有良好的接地性能。接通电源，使仪器预热接通电源，使仪器预热2020分钟。分钟。用用键设置测试方式：投射比（键设置测试方式：投射比（T T），吸光度（），吸光度（A A），），已知标准样品浓度值方式（已知标准样品浓度值方式（C C）和已知标准样品斜率（）和已知标准样品斜率（F F）方式。方式。用波长选择旋钮设置您所需的分析波长用波长选择旋钮设置您所需的分析波长。 将参比样品溶液和被测样将
44、参比样品溶液和被测样品溶液分别倒入比色皿中，品溶液分别倒入比色皿中，打开样品室盖，将盛有溶打开样品室盖，将盛有溶液的比色皿分别插入比色液的比色皿分别插入比色皿槽中，盖上样品室盖。皿槽中，盖上样品室盖。一般情况下，参比样品放一般情况下，参比样品放在第二个槽位中。在第二个槽位中。 将将0 0T T校具（黑体）置入校具（黑体）置入光路中，在光路中，在T T方式下按方式下按“0 0T”T”键，此时显示器显示键，此时显示器显示“000.0”000.0” 按按 MODEMODE键选择键选择A A模式模式 将参比样品拉入光路中，将参比样品拉入光路中，按按“0A/1000A/100T”T”键调键调0A/100
45、0A/100T T，此时显示器，此时显示器显示的显示的“BLA”BLA”直至显示直至显示“0.000”A0.000”A为止。为止。 当仪器显示器显示出当仪器显示器显示出“0.000”A0.000”A后，将被测样后，将被测样品推入光路，这时，您便品推入光路，这时，您便可从显示器上得到被测样可从显示器上得到被测样品的吸光度。品的吸光度。 比色皿的清洁程度，直接影响实验结果。因此，特比色皿的清洁程度，直接影响实验结果。因此，特别要将比色皿清洗干净。别要将比色皿清洗干净。装样前处理：自来水反复冲洗装样前处理：自来水反复冲洗蒸馏水漂洗蒸馏水漂洗2 2次次待装溶液漂洗待装溶液漂洗2 2次。次。用完后用自来
46、水和蒸馏水洗净并用檫镜纸檫干放回用完后用自来水和蒸馏水洗净并用檫镜纸檫干放回比色皿盒中。比色皿盒中。 拿放比色皿时，应持其拿放比色皿时，应持其“毛面毛面”，不要接触，不要接触“光面光面”。光面光面毛面毛面若比色皿外表面有液体，应用擦镜纸朝同一方向拭干，若比色皿外表面有液体，应用擦镜纸朝同一方向拭干，以保证吸光度测量不受影响。以保证吸光度测量不受影响。 比色皿内盛液应为其容量的比色皿内盛液应为其容量的2/32/3，过少会影响实验结，过少会影响实验结果，过多易在测量过程中外溢，污染仪器。果，过多易在测量过程中外溢，污染仪器。容容量量的的2/32/3 比色皿的光面要与光源在一条线上。比色皿的光面要与
47、光源在一条线上。光透过窗口光透过窗口福林福林(Folin)-(Folin)-酚试剂法测定酚试剂法测定蛋白质的浓度蛋白质的浓度 蛋白质的定量分析蛋白质的定量分析是生物化学和其它生命是生物化学和其它生命学科最常涉及的分析内容，是临床上诊断学科最常涉及的分析内容，是临床上诊断疾病及检查康复情况的重要指标，也是许疾病及检查康复情况的重要指标，也是许多生物制品，药物、食品质量检测的重要多生物制品，药物、食品质量检测的重要指标。指标。 在生化实验中，对样品中的蛋白质进行准在生化实验中，对样品中的蛋白质进行准确可靠的定量分析，则是经常进行的一项确可靠的定量分析，则是经常进行的一项非常重要的工作非常重要的工作
48、。蛋白质是一种十分重要的生物大分子：它的蛋白质是一种十分重要的生物大分子：它的种类很多，结构不均一，分子量又相差很大，功种类很多，结构不均一，分子量又相差很大，功能各异，这样就给建立一个理想而又通用的蛋白能各异，这样就给建立一个理想而又通用的蛋白质定量分析的方法代来了许多具体的困难。目前质定量分析的方法代来了许多具体的困难。目前测定蛋白质含量的方法有很多种，下面列出根据测定蛋白质含量的方法有很多种，下面列出根据蛋白质不同性质建立的一些蛋白质测定方法：蛋白质不同性质建立的一些蛋白质测定方法：物理性质物理性质：紫外分光光度法：紫外分光光度法化学性质化学性质：凯氏定氮法、双缩脲法、：凯氏定氮法、双缩
49、脲法、Lowry Lowry 法，法， BCABCA法，胶体金法法，胶体金法染色性质染色性质：考马氏亮蓝染色法、银染法：考马氏亮蓝染色法、银染法其他性质其他性质：荧光法：荧光法方方 法法测定范围测定范围（g/mlg/ml）不同不同种类种类蛋白蛋白的差的差异异最大最大吸收吸收波长波长(nm)(nm)特特 点点凯氏定氮凯氏定氮法法 小小 标准方法，准确，操作麻烦，费时，灵敏标准方法，准确，操作麻烦，费时，灵敏度低，适用于标准的测定度低，适用于标准的测定紫外分光紫外分光光度法光度法10010010001000大大280280205205灵敏，快速，不消耗样品，核酸类物质有灵敏，快速，不消耗样品，核酸
50、类物质有影响影响双缩脲法双缩脲法100010001000010000小小540540重复性、线性关系好，灵敏度低，测定范重复性、线性关系好，灵敏度低，测定范围窄，样品需要量大围窄，样品需要量大Folin-Folin-酚酚试剂法试剂法2020500500大大750750灵敏，费时较长，干扰物质多灵敏，费时较长，干扰物质多考马氏亮考马氏亮蓝蓝G-250G-2505050500500大大595595灵敏度高，稳定，误差较大，颜色会转移灵敏度高，稳定，误差较大，颜色会转移BCABCA5050500500大大562562灵敏度高，稳定，干扰因素少，费时较长灵敏度高，稳定，干扰因素少，费时较长蛋白质不同方
