1、基因工程基本操作的四个步骤基因工程基本操作的四个步骤1 1、目的基因的获取、目的基因的获取2 2、基因表达载体的构建、基因表达载体的构建3 3、将目的基因导入受体细胞、将目的基因导入受体细胞4 4、目的基因的检测与鉴定、目的基因的检测与鉴定获取的方法？获取的方法？构建目的？组成？构建目的？组成？导入植物细胞、动物细胞、导入植物细胞、动物细胞、微生物细胞的方法分别是？微生物细胞的方法分别是？如何判断目的基因是否成功导入受体细胞？如何判断目的基因是否成功导入受体细胞？如何判断导入后是否成功表达？如何判断导入后是否成功表达？一、一、获取获取目的基因目的基因 主要是指编码主要是指编码蛋白质蛋白质的结构
2、基因，也可的结构基因，也可以是一些具有调控作用的因子。以是一些具有调控作用的因子。 目前被广泛提取使用的目的基因有：目前被广泛提取使用的目的基因有：苏云金杆菌苏云金杆菌抗虫基因、植物抗病基因抗虫基因、植物抗病基因人胰人胰岛素基因岛素基因等。等。1、目的基因的定义、目的基因的定义从从基因文库基因文库中寻找中寻找多聚酶链式反多聚酶链式反应（应（PCRPCR）扩增）扩增化学合成法化学合成法目的基因的核苷酸序列目的基因的核苷酸序列未知未知目的基因的核苷酸序列目的基因的核苷酸序列已知已知（一）获取目的基因的常用方法有哪些（一）获取目的基因的常用方法有哪些? ?初始目的基因的来源初始目的基因的来源1. 从
3、生物中直接获取从生物中直接获取2. 人工合成人工合成注意：要保持基因的完整性注意：要保持基因的完整性1 1、从基因文库中获取目的基因、从基因文库中获取目的基因 将含有某种生物不同基因的许多将含有某种生物不同基因的许多DNADNA片断，片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。这种生物的不同基因，称为基因文库。基因文库基因文库 基因组文库基因组文库部分基因文库部分基因文库（如（如:cDNA:cDNA文库）文库）基因文库基因文库通过对受体菌的培养而储存基因通过对受体菌的培养而储存基因基因文库的构建模式图基因文库的构建模式
4、图由由mRNA反转录形成反转录形成cDNA mRNA DNA单链单链 DNA单链单链 RNA DNA杂交分子杂交分子 RNA DNA杂交分子杂交分子 单链单链DNA 单链单链DNA 双链双链DNA逆转录逆转录使使RNA降解降解复制复制核酸酶核酸酶H?形成氢键形成氢键小小大大无无有有无无有有某种生物的部分基因某种生物的部分基因 某种生物的全部基因某种生物的全部基因可以可以部分基因可以部分基因可以补：真核细胞的基因结构补：真核细胞的基因结构编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区与与RNARNA聚合酶聚合酶结合位点结合位点内含子内含子 外显子外显子 能够编码蛋白质的能够编码蛋白质的DNADNA
5、序列序列. .不能够编码蛋白质的不能够编码蛋白质的DNADNA序列序列. .启动子启动子终止子终止子编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 内含子：内含子： 外显子：外显子： 概念：概念：PCRPCR全称为全称为_，是一项，是一项 在生物在生物_复制复制_的核酸合成技术。的核酸合成技术。 条件：条件：_、_、_ _ 、 _ . . 原理：原理：_多聚酶链式反应多聚酶链式反应体外体外特定特定DNADNA片段片段DNADNA复制复制模板模板DNA DNA 四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸引物引物热稳定热稳定DNADNA聚合酶聚合酶2.2.利用利用PCRPCR扩增目的基因扩增目的基因方式：方式：以以
6、_方式扩增，即方式扩增，即_（n n为扩增循环的次为扩增循环的次数）数）结果：结果：使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增指数指数2 2n nn 过程：过程：变性、复性、延伸三步曲变性、复性、延伸三步曲变性：变性：加热至加热至90909595双链双链DNADNA解链成解链成为单链为单链DNADNA复性复性：冷却至冷却至55556060部分引物与模板部分引物与模板的单链的单链DNADNA的特定互的特定互补部位相配对和结合补部位相配对和结合延伸：延伸：加热至加热至70707575以目的基因为模以目的基因为模板，合成互补的新板，合成互补的新DNADNA链链变
7、性变性复性复性延伸延伸过程过程a a、变性、变性（90-9590-95）：双链）：双链DNADNA模板模板 在热作用下，在热作用下，_断裂，形成断裂，形成_b b、复性、复性（复性复性55-6055-60）：系统温度降低，引）：系统温度降低，引 物与物与DNADNA模板结合，形成局部模板结合，形成局部_。 c c、延伸、延伸（70-7570-75）：在）：在TaqTaq酶的作用下，酶的作用下，合成与模板互补的合成与模板互补的_。 氢键氢键单链单链DNADNA双链双链DNADNA链链PCRPCR技术扩增与技术扩增与DNADNA复制的比较复制的比较PCRPCR技术技术DNADNA复制复制相相同同点
8、点原则原则原料原料条件条件不不同同点点解旋解旋方式方式场所场所酶酶结果结果碱基互补配对碱基互补配对四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸模板、能量、酶模板、能量、酶DNADNA在在高温高温下下变性解旋变性解旋解旋酶解旋酶催化催化体外复制体外复制细胞核内细胞核内热稳定热稳定的的DNADNA聚合酶聚合酶 细胞内的细胞内的DNADNA聚合酶聚合酶大量的大量的DNADNA片段片段形成整个形成整个DNADNA分子分子3.3.人工合成人工合成根据已知的氨基酸序列合成根据已知的氨基酸序列合成DNA DNA 蛋白质的氨基酸序列蛋白质的氨基酸序列mRNAmRNA的核苷酸序列的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列结构基因的核苷酸
9、序列推测推测推测推测目的基因目的基因化学合成化学合成已知核苷酸序列已知核苷酸序列的较小基因可以的较小基因可以化学合成，不需化学合成，不需要模板。要模板。从基因文库中获取从基因文库中获取利用利用PCRPCR技术扩增技术扩增利用化学方法人工合成利用化学方法人工合成归纳：获取目的基因的方法归纳：获取目的基因的方法 用一定的用一定的_切割切割 质粒，使其出现一个切质粒，使其出现一个切 口，露出口，露出_。 用用_切断目切断目 的基因，使其产生的基因，使其产生_ _ _。 将切下的目的基因片段插入质粒的将切下的目的基因片段插入质粒的_处，处， 再加入适量再加入适量_，形成了一个重组，形成了一个重组 DN
10、ADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）限制酶限制酶黏性末端黏性末端同一种限制酶同一种限制酶相同的黏性末端相同的黏性末端切口切口DNADNA连接酶连接酶1.1.过程过程: :二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建 核心核心2.2.构建构建目的目的（1 1）使目的基因在受体细胞中稳定存在）使目的基因在受体细胞中稳定存在并可以遗传给下一代；并可以遗传给下一代；（2 2）使目的基因能够表达和发挥作用。）使目的基因能够表达和发挥作用。3. 3. 组成组成它们有什么作用？它们有什么作用？a a、目的基因、目的基因b b、启动子、启动子c c、终止子、终止子d d、标记基因、标记基因RNARNA聚合
11、酶识别和结合聚合酶识别和结合位点，启动转录位点，启动转录位于基因的末端位于基因的末端, ,终止转录终止转录检测目的基因是否导入受体细胞检测目的基因是否导入受体细胞思考：思考： 表达载体为什么一定要有启动子？表达载体为什么一定要有启动子？ （1 1）生物之间进行基因交流，只有使用）生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能有利于基受体生物自身基因的启动子才能有利于基因的表达；因的表达； （2 2）通过）通过cDNAcDNA文库获得的目的基因没有文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体细胞无法启动子，只将编码序列导入受体细胞无法转录。转录。三、将目的基因导入受体细胞三、将
12、目的基因导入受体细胞借鉴借鉴细菌或病毒侵染细胞细菌或病毒侵染细胞的途径。的途径。（一）转化：（一）转化： 目的基因进入目的基因进入_内，并且在内，并且在 受体细胞内维持受体细胞内维持_和和_的过程的过程受体细胞受体细胞稳定稳定表达表达（二）（二）方法方法将目的基因导入将目的基因导入植物细胞植物细胞将目的基因导入将目的基因导入动物细胞动物细胞将目的基因导入将目的基因导入微生物细胞微生物细胞农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法显微注射法显微注射法感受态细胞感受态细胞1.1.将目的基因导入植物细胞将目的基因导入植物细胞 农杆菌转化法农杆菌转化法 基因枪法基因枪法 花粉管通
13、道法花粉管通道法（1 1）农杆菌转化法）农杆菌转化法特点：特点： 易感染双子叶植物和裸易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力物没有感染能力原理：原理： TiTi质粒上的质粒上的T-DNAT-DNA可以转移到受体细胞，可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的并整合到受体细胞染色体的DNADNA上。上。转化过程转化过程: :TiTi质粒质粒目的基因目的基因构建构建表表达达载载体体导入导入植植物物细细胞胞插入插入植物细胞植物细胞染色体染色体DNADNA表达表达新新性性状状转入转入农农杆杆菌菌 基因枪法又称微基因枪法又称微弹轰击法，是弹轰击法，是利用压利
14、用压缩气体产生的动力缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表将包裹在金属颗粒表面的表达载体面的表达载体DNADNA打打入受体细胞中入受体细胞中，使目，使目的基因与其整合并表的基因与其整合并表达的方法。达的方法。（2 2）基因枪法）基因枪法（3 3）花粉通道法）花粉通道法 植物花粉在柱头植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，前，剪去柱头，然后，滴加滴加DNADNA（含目的基（含目的基因），使目的基因借因），使目的基因借助花粉管
15、通道进入受助花粉管通道进入受体细胞。体细胞。2.2.将目的基因导入动物细胞将目的基因导入动物细胞（1 1）方法：显微注射法）方法：显微注射法（将基因表达载体（将基因表达载体提纯，用显微仪注射到提纯，用显微仪注射到受精卵受精卵中）中）（2 2）操作程序）操作程序: :提纯含目的基因表达载体提纯含目的基因表达载体取受精卵取受精卵显微注射显微注射移植到子宫移植到子宫受精卵发育受精卵发育新性状动物新性状动物常用法常用法：CaCa2+2+处理处理常用菌常用菌：大肠杆菌：大肠杆菌微生物作受体细胞原因：微生物作受体细胞原因：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少过程：过程：Ca
16、Ca2+2+处理大处理大肠杆菌肠杆菌感受态感受态细胞细胞表达载体表达载体与感受态与感受态细胞混合细胞混合感受态感受态细胞吸细胞吸收收DNADNA3.3.将目的基因导入微生物细胞将目的基因导入微生物细胞四、目的基因的检测与鉴定四、目的基因的检测与鉴定 检测检测: : 是否插入目的基因是否插入目的基因 是否转录是否转录 是否翻译是否翻译 鉴定鉴定: : 分子水平鉴定分子水平鉴定 个体生物学水平鉴定个体生物学水平鉴定1 1、检测转基因生物染色体的、检测转基因生物染色体的DNADNA上是否插入上是否插入了目的基因了目的基因 首先取出转基因生物的基因组首先取出转基因生物的基因组DNADNA；（1 1）方
17、法）方法: :DNADNA分子杂交分子杂交（2 2）过程）过程: : 将含目的基因的将含目的基因的DNADNA片段用放射性同位素等片段用放射性同位素等作标记作标记, ,以此做以此做探针探针； 使探针和转基因生物的基因组杂交使探针和转基因生物的基因组杂交, ,若显示若显示出杂交带出杂交带, ,表明染色体已插入染色体表明染色体已插入染色体DNADNA中。中。（一）检测（一）检测： 采用一定的技术手段，将两种生物的采用一定的技术手段，将两种生物的DNADNA分分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合的碱基序列，那么，互
18、补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。列的部位，仍然是两条游离的单链。 （二）鉴定（个体生物学水平）（二）鉴定（个体生物学水平）抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等方法方法: :分分 子子 杂杂 交交方法方法: : 抗原抗原- -抗体杂交抗体杂交过程过程: :用上述探针和转基因生物的用上述探针和转基因生物的mRNAmRNA杂交杂交, ,若出现杂交带若出现杂交带, ,表明目的基因转录出了表明目的基因转录出了mRNAmRNA。怎样检验抗虫基因在棉细胞内是否表达呢？怎样检验抗虫基因在
19、棉细胞内是否表达呢？没有抗虫基因没有抗虫基因的棉植株的棉植株有抗虫基因的有抗虫基因的棉植株棉植株棉铃虫棉铃虫虫没有死虫没有死虫被杀死虫被杀死没有表达没有表达目的基目的基因表达因表达类类型型步骤步骤 检测内容检测内容方法方法结果显示结果显示分分子子检检测测第一第一步步目的基因是否进目的基因是否进入受体细胞入受体细胞DNADNA分子杂交分子杂交（DNADNA和和DNADNA之间）之间）是否成功显示是否成功显示出杂交带出杂交带第二第二步步目的基因是否转目的基因是否转录出录出mRNAmRNA分子杂交技术分子杂交技术（DNADNA和和mRNAmRNA之间）之间）是否成功显示是否成功显示出杂交带出杂交带第
20、三第三步步目的基因是否翻目的基因是否翻译出蛋白质译出蛋白质抗原抗原抗体杂交抗体杂交是否成功显示是否成功显示出杂交带出杂交带个个体体水水平平鉴鉴定定 包括抗虫、抗病的包括抗虫、抗病的接种实验接种实验，以确定是否有抗性以及抗性的程度；，以确定是否有抗性以及抗性的程度； 基因工程产品与天然产品的活性比较，以确定功能是否相同等。基因工程产品与天然产品的活性比较，以确定功能是否相同等。归纳归纳: 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序1. 获取目的基因获取目的基因u 从基因文库从基因文库u 利用利用PCRu 化学方法人工合成化学方法人工合成2. 构建基因表达载体构建基因表达载体u 目的基因、启动子
21、、终止子、标记基因目的基因、启动子、终止子、标记基因3. 将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞u 转化法（微生物）、农杆菌转化法（植物）、显微注转化法（微生物）、农杆菌转化法（植物）、显微注射法（动物）射法（动物）4. 目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定u 检测：是否插入、转录、翻译检测：是否插入、转录、翻译1 1下列有关基因工程技术的正确叙述是（下列有关基因工程技术的正确叙述是（ ） A A重组重组DNADNA技术所用的工具酶是限制酶、连接酶技术所用的工具酶是限制酶、连接酶和载体和载体B B所有的限制酶都只能识别同一种特定的核苷酸所有的限制酶都只能识别同一种特定的核苷酸序列序列
22、C C选用细菌作为重组质粒的受体细胞是因为细菌选用细菌作为重组质粒的受体细胞是因为细菌繁殖快繁殖快D D只要目的基因进入了受体细胞就能成功实现表只要目的基因进入了受体细胞就能成功实现表达达C C 当堂检测当堂检测2.2.科学家运用基因工程技术将人胰岛素基因与大肠杆科学家运用基因工程技术将人胰岛素基因与大肠杆菌的质粒菌的质粒DNADNA分子重组，并且在大肠杆菌体内获得成功分子重组，并且在大肠杆菌体内获得成功表达。图示表达。图示a a处为胰岛素基因与大肠杆菌质粒处为胰岛素基因与大肠杆菌质粒DNADNA结合结合的位置，它们彼此能结合的依据是的位置，它们彼此能结合的依据是 （ ）A A基因自由组合定律
23、基因自由组合定律 B B半保留复制原则半保留复制原则C C基因分离定律基因分离定律 D D碱基互补配对原则碱基互补配对原则D D a3 3下图表示一项重要的生物技术，对图中物质下图表示一项重要的生物技术，对图中物质a a、b b、c c、d d的描述，正确的是的描述，正确的是A Aa a的基本骨架是磷酸和核糖交替连接而成的结构的基本骨架是磷酸和核糖交替连接而成的结构B B要获得相同的黏性末端，可以用不同种要获得相同的黏性末端，可以用不同种b b切割切割a a和和d dC Cc c连接双链间的连接双链间的A A和和T T，使黏性末端处碱基互补配对，使黏性末端处碱基互补配对D D若要获得未知序列若
24、要获得未知序列d d，可到基因文库中寻找，可到基因文库中寻找D4 4科学家在某种植物中找到了抗枯萎的基因，并以质科学家在某种植物中找到了抗枯萎的基因，并以质粒为载体，采用转基因方法培育出了抗枯萎病的金茶花粒为载体，采用转基因方法培育出了抗枯萎病的金茶花新品种，下列有关说法正确的是新品种，下列有关说法正确的是 ( ( ) )A A质粒是最常用的载体之一，它仅存在于原核细胞中质粒是最常用的载体之一，它仅存在于原核细胞中B B将抗枯萎基因连接到质粒上，用到的工具酶仅是将抗枯萎基因连接到质粒上，用到的工具酶仅是DNADNA连接酶连接酶C C用叶肉细胞作为受体细胞培育出的植株不能表现出用叶肉细胞作为受体细胞培育出的植株不能表现出抗枯萎性状抗枯萎性状D D通过该方法获得的抗枯萎病金茶花，产生的配子不通过该方法获得的抗枯萎病金茶花，产生的配子不一定含抗枯萎病基因一定含抗枯萎病基因D5.5.下列获取目的基因的方法中，需要模板的是下列获取目的基因的方法中，需要模板的是 （双选）（双选） A.A.从基因文库中获取目的基因从基因文库中获取目的基因B.B.利用利用PCRPCR扩增目的基因扩增目的基因C. C. 构建构建cDNAcDNA文库文库D.D.通过通过DNADNA合成仪利用化学方法人工合成目的基因合成仪利用化学方法人工合成目的基因BC
