1、实验三实验三 血清蛋白质血清蛋白质醋酸纤维素薄膜醋酸纤维素薄膜电泳1ppt课件注意：自己带注意：自己带铅笔铅笔、尺子、尺子实验时间：第实验时间：第1111周，星期一周，星期一2ppt课件一、实验目的1.1.了解电泳的基本原理；了解电泳的基本原理；2.2.掌握电泳分离蛋白质的原理；掌握电泳分离蛋白质的原理；3.3.掌握醋酸纤维素薄膜电泳的方法。掌握醋酸纤维素薄膜电泳的方法。3ppt课件二、实验原理1.1.电泳的基本原理电泳的基本原理 电泳电泳是带电质点在电场力作用下发生定向移动的现象。是带电质点在电场力作用下发生定向移动的现象。 电泳技术电泳技术是利用电泳现象进行物质分离、纯化及鉴定的技术。是利
2、用电泳现象进行物质分离、纯化及鉴定的技术。4ppt课件电泳速度的方向：电泳速度的方向：电泳速度的大小：当电泳速度的大小：当F=FF=F 时，粒子在电场中匀速运动。时，粒子在电场中匀速运动。V =QE6r正正极极负负极极F FF= F 电场力电场力 F=QEF=QE 摩擦力摩擦力 F F = = 6 6rVrVQE= 6rV运动速度运动速度5ppt课件rEQv6E E：电场强度：电场强度; ;Q Q：粒子所带的净电荷：粒子所带的净电荷; ;r r：粒子半径；：粒子半径；：溶液的粘度：溶液的粘度在同一电场环境中，带电粒子的迁移速率只与本在同一电场环境中，带电粒子的迁移速率只与本身身所带电荷所带电荷
3、、粒子半径粒子半径有关。有关。6ppt课件（i i）粒子所带电荷越多，半径越小，泳动速度就越快）粒子所带电荷越多，半径越小，泳动速度就越快（iiii）所带电荷越少，半径越大，泳动速度就越慢）所带电荷越少，半径越大，泳动速度就越慢rEQv67ppt课件2.电泳分离蛋白质的原理COOHNH3 +ProCOONH3 +ProCOONH2 PropHpHpI碱性电离碱性电离酸性电离酸性电离 当当pH=PIpH=PI时，所带电荷为时，所带电荷为0 0，粒子是静止的；，粒子是静止的； 当当pHPIpHPI时，酸性电离，释放氢离子，带负电，运动方向时，酸性电离，释放氢离子，带负电，运动方向是从负极向正极移动
4、；是从负极向正极移动； 当当pHPIpHPI时，碱性电离，结合氢离子，带正电，运动方向时，碱性电离，结合氢离子，带正电，运动方向是从正极向负极移动；是从正极向负极移动； 当当pHpH距离距离PIPI越远时，所带电量越多。越远时，所带电量越多。8ppt课件 血清蛋白质的等电点为血清蛋白质的等电点为4.84.87.57.5，均低于，均低于8.68.6，因此电泳，因此电泳时常采用时常采用pH8.6pH8.6的缓冲液。此时，蛋白质解离带的缓冲液。此时，蛋白质解离带负电荷负电荷，在，在电场中向电场中向正极正极移动。移动。 由于各种血清蛋白的由于各种血清蛋白的等电点不同等电点不同，在同一，在同一pH下带的
5、电荷数下带的电荷数也不同，加上各蛋白质的也不同，加上各蛋白质的分子大小分子大小也有差别，因此在电场中也有差别，因此在电场中的移动速度不同。的移动速度不同。 带电荷多、相对分子量小的蛋白质泳动较快，带电荷少、带电荷多、相对分子量小的蛋白质泳动较快，带电荷少、相对分子量大的泳动较慢。相对分子量大的泳动较慢。 这样各种血清蛋白质在同一时间内泳动的距离就不同，从这样各种血清蛋白质在同一时间内泳动的距离就不同，从而可将血清蛋白分离成数条区带。而可将血清蛋白分离成数条区带。2.电泳分离血清蛋白质的原理9ppt课件4.醋纤膜分离血清蛋白质的原理 醋酸纤维素薄膜电泳醋酸纤维素薄膜电泳是采用醋酸纤维素薄膜作支是
6、采用醋酸纤维素薄膜作支持物的一种电泳技术。持物的一种电泳技术。 醋酸纤维素薄膜醋酸纤维素薄膜是是纤维素的羟基乙酰化纤维素的羟基乙酰化形成的纤形成的纤维素醋酸酯，具有均一的泡沫状结构，渗透性强，维素醋酸酯，具有均一的泡沫状结构，渗透性强，对分子移动阻力小，用它做区带电泳的支持物，用对分子移动阻力小，用它做区带电泳的支持物，用样量少，分离清晰，对染料无吸附作用，应用范围样量少，分离清晰，对染料无吸附作用，应用范围广，快速简便广，快速简便 , ,且染色后的薄膜可用乙醇和冰醋酸且染色后的薄膜可用乙醇和冰醋酸溶液浸泡透明，透明后的薄膜便于保存和定量分析。溶液浸泡透明，透明后的薄膜便于保存和定量分析。 因
7、此，目前被广泛用于血清蛋白、脂蛋白、血红因此，目前被广泛用于血清蛋白、脂蛋白、血红蛋白、糖蛋白、酶的分离和免疫电泳等方面。蛋白、糖蛋白、酶的分离和免疫电泳等方面。10ppt课件醋纤膜分离血清蛋白质的方法 以醋酸纤维素薄膜作为支持介质，于薄膜一端以醋酸纤维素薄膜作为支持介质，于薄膜一端加微量血清，膜两端连接于缓冲液。电泳分离后加微量血清，膜两端连接于缓冲液。电泳分离后再经染色处理，可将血清蛋白质分成五条主要的再经染色处理，可将血清蛋白质分成五条主要的区带，从正极依次为区带，从正极依次为清蛋白、清蛋白、1-1-球蛋白、球蛋白、2-2-球蛋白、球蛋白、-球蛋白、球蛋白、-球蛋白球蛋白。11ppt课件
8、三、主要试剂与器材：试剂：血清试剂：血清 巴比妥缓冲液巴比妥缓冲液 染色液，漂洗液染色液，漂洗液器材：电泳仪，电泳槽器材：电泳仪，电泳槽 醋酸纤维素薄膜（醋酸纤维素薄膜（2 28cm8cm） 血清加样器血清加样器12ppt课件四、操作步骤：1.1.浸膜：将裁好的醋酸纤维素薄膜浸泡于浸膜：将裁好的醋酸纤维素薄膜浸泡于缓冲液缓冲液中，中，充分浸透后用镊子取出用两片滤纸吸干（约充分浸透后用镊子取出用两片滤纸吸干（约20min20min，直到直到膜上没有斑点，中间没有气泡膜上没有斑点，中间没有气泡为止）。为止）。2.2.点样：点样：毛面向上毛面向上，用点样器，在距膜一端约，用点样器，在距膜一端约2cm
9、2cm处，处，与边缘平行直线状点加与边缘平行直线状点加35L35L待分离血清。注意取待分离血清。注意取样适量、均匀；血清线位置适当，粗细均匀，不能样适量、均匀；血清线位置适当，粗细均匀，不能有明显扩散现象。有明显扩散现象。 2cm13ppt课件不同的点样方式不同的点样方式正确点样：直、细正确点样：直、细- -+ +姓姓名名2cm2cm14ppt课件2cm2cm- -+ +姓姓名名错误的点样方式：量多、条带粗错误的点样方式：量多、条带粗- -+ +结果结果：15ppt课件2cm2cm- -+ +姓姓名名错误的点样方式：量少，条带不清晰错误的点样方式：量少，条带不清晰结果结果：- -+ +16pp
10、t课件2cm2cm- -+ +姓姓名名如何正确点样：如何正确点样：1 13mm3mm宽的细长、均宽的细长、均匀、连续条带匀、连续条带（1 1）移液器的尖嘴：旁边不沾液滴；）移液器的尖嘴：旁边不沾液滴；（2 2）移液器的尖嘴蘸点血清后，较快划一次。）移液器的尖嘴蘸点血清后，较快划一次。血清的高度：决定血清的高度：决定尖嘴液面的高度尖嘴液面的高度决定决定血清线漫开的血清线漫开的宽度宽度。17ppt课件3.3.搭桥：首先将双层滤纸铺好，分别放置于电泳槽两搭桥：首先将双层滤纸铺好，分别放置于电泳槽两端，其下端要浸入缓冲液中。端，其下端要浸入缓冲液中。注意：注意：无光泽面朝无光泽面朝下；下；血清线不碰到
11、盐桥上的滤纸；血清线不碰到盐桥上的滤纸；膜的膜的+”“-”+”“-”与电泳槽的与电泳槽的“+”“+”极、极、“-”“-”极方向一致。极方向一致。醋酸纤维素薄膜电泳装置示意图醋酸纤维素薄膜电泳装置示意图18ppt课件水平电泳槽水平电泳槽19ppt课件4.4.电泳：红正黑负。电泳：红正黑负。 电压：电压：100V。 电泳时间约电泳时间约 60min 60min 。- -+ +- -+ +每人只能放一张膜，最后有空位才可放第二张膜每人只能放一张膜，最后有空位才可放第二张膜20ppt课件5.5.染色：氨基黑染色：氨基黑10B, 10B, 染色染色3 35min.5min. 镊子夹膜的两边，不夹中间镊子
12、夹膜的两边，不夹中间 浸泡时，一条一条地浸，确保每条膜都被染色液完全包裹浸泡时，一条一条地浸，确保每条膜都被染色液完全包裹-+21ppt课件6.6.漂洗：在装有漂洗液的漂洗：在装有漂洗液的2 2个漂洗缸中，依次漂去多余染料，直到背景漂个漂洗缸中，依次漂去多余染料，直到背景漂白为止。白为止。尽量滴干染色液尽量滴干染色液一条一条地移一条一条地移漂洗液的作用：洗去未结合蛋白质的游离染料。漂洗液的作用：洗去未结合蛋白质的游离染料。-+染色皿染色皿漂洗皿漂洗皿22ppt课件五、结果与分析：1.1.定性观察：指出薄膜上可显现清楚的五条区带分别定性观察：指出薄膜上可显现清楚的五条区带分别是什么？是什么？23ppt课件吸水纸上：逐一摆开，找到自己的那条吸水纸上：逐一摆开，找到自己的那条24ppt课件六、注意事项：1.1.点样点样时时, ,毛面向上毛面向上, ,要求样线粗细均匀，无明显扩散现象。要求样线粗细均匀，无明显扩散现象。2.2.搭桥搭桥时时, ,光面向上光面向上, ,点样端置于负极点样端置于负极, ,样线不能接触滤纸。样线不能接触滤纸。3.3.正确连接导线正确连接导线( (红色红色正极正极，黑色黑色负极负极）。）。4.4.电泳过程中，严禁再取放薄膜。电泳过程中，严禁再取放薄膜。25ppt课件
