1、 主主 要要 内内 容容 掌握重组掌握重组DNA技术的定义技术的定义 掌握限制性核酸内切酶的概念掌握限制性核酸内切酶的概念 熟悉常用工具酶的种类及用途熟悉常用工具酶的种类及用途 熟悉重组熟悉重组DNA技术的基本步骤技术的基本步骤第一节第一节 重组重组DNA技术技术的定义及步骤的定义及步骤 基因重组技术基因重组技术:在体外对不同来源的在体外对不同来源的DNA分子进分子进行共价连接形成重组行共价连接形成重组DNA ，再将重组子导入受，再将重组子导入受体细胞，扩增、繁殖和表达。体细胞，扩增、繁殖和表达。 基本步骤基本步骤2. 将将目的基因目的基因与与运载体运载体DNA在体外进行重组在体外进行重组目的
2、基因目的基因运载体运载体DNA限制性限制性核酸内核酸内切酶切酶DNA 重组体重组体引入宿主细胞引入宿主细胞筛选出含有筛选出含有重组体的细胞重组体的细胞无性繁殖扩增、表达基因产物无性繁殖扩增、表达基因产物3. 转化或转染转化或转染4. 筛选筛选5. 克隆（克隆（cloning）基因的表）基因的表达、检测达、检测 、分离、分离1. 目的基因获得目的基因获得一、一、 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶选用选用II型限制酶，能专一识别和切割双链型限制酶，能专一识别和切割双链DNA限制酶的命名限制酶的命名 Haemophilus influenzae Rd嗜血杆菌属嗜血杆菌属 流感杆菌（种名）流感杆菌（种
3、名） 株名株名取取H 取取in d Hind I 第二节第二节 重要的工具酶重要的工具酶 若该微生物有不同的变种和品系，再加上该变种和品若该微生物有不同的变种和品系，再加上该变种和品系的第一个字母，需大写；从同一种微生物中发现多种限系的第一个字母，需大写；从同一种微生物中发现多种限制酶，依据发现的前后顺序用罗马数字表示：例如从淀粉制酶，依据发现的前后顺序用罗马数字表示：例如从淀粉液化芽孢杆菌（液化芽孢杆菌（Bacills amyloliquefaciens) H株分离的第一株分离的第一种限制型内切酶，命名为种限制型内切酶，命名为 BamH I三、三、DNA连接酶：连接酶： 1. T4噬菌体噬菌
4、体DNA连接酶：两个不同片段双链连接酶：两个不同片段双链DNA存存在互补粘性末端（在互补粘性末端（Km=0.6mol/L)或平末端或平末端(Km=50mol/L)。 2. 大肠杆菌大肠杆菌DNA连接酶连接酶四、四、T4多核苷酸激酶多核苷酸激酶:催化将催化将ATP的的-磷酸转移到磷酸转移到DNA链链5末端末端五、碱性磷酸酶：五、碱性磷酸酶：催化切除催化切除DNA、RNA、dNTP上上5磷磷酸基团酸基团重组重组5 A 3 TTCGAAGCTT3 A5目的基因粘性末端目的基因粘性末端运载体运载体DNA粘粘性末性末端端5AAGCTT3TTCGAADNA连接酶连接酶退火退火末端转移酶粘端连接粘端连接平端
5、连接平端连接dTTP末端转移酶dATP退火退火DNA连接酶连接酶第一部分第一部分 获得目的基因获得目的基因第一节第一节 目的基因的获得目的基因的获得 原核生物基因组较小原核生物基因组较小,目的基因定位较容易，目的基因定位较容易，一般可直接分离获得。即用限制性核酸内切一般可直接分离获得。即用限制性核酸内切酶将基因组切成若干片段后，用带标记的核酶将基因组切成若干片段后，用带标记的核酸探针从中筛选、确定、提纯、扩增。酸探针从中筛选、确定、提纯、扩增。 真核生物基因组庞大，一个单拷贝仅占整个真核生物基因组庞大，一个单拷贝仅占整个基因组的基因组的10-710-5，从中获取某一基因常采，从中获取某一基因常
6、采用以下几种方法：用以下几种方法：1. PCR 获取目的基因获取目的基因 2.用用DNA合成仪人工合成目的基因合成仪人工合成目的基因3. 从从DNA文库（文库（gene library）中筛选出目的基因）中筛选出目的基因DNA文库 各种重组各种重组DNA分子的集合体，叫分子的集合体，叫DNA文库文库 cDNA文库文库 基因组文库基因组文库 将将DNA用酶法裂解用酶法裂解（鸟枪法）裂解为（鸟枪法）裂解为相当于基因长度的相当于基因长度的片段片段分别与质粒重组并分别与质粒重组并引入大肠杆菌即为引入大肠杆菌即为基因组文库（基因组文库（G-文文库）库）基因组文库：基因组文库：分离纯化基分离纯化基 因组因
7、组DNA筛选目的基因筛选目的基因分离纯化分离纯化mRNA用用oligo-dT亲亲和层析法和层析法提取细胞提取细胞内总内总RNA反转录合成反转录合成cDNA并复制并复制成双链的成双链的DNA与质粒重组并与质粒重组并引入大肠杆菌引入大肠杆菌即为即为cDNA文文库库筛选目的基因筛选目的基因核酸杂交法和核酸杂交法和免疫结合法免疫结合法cDNA文库：文库： 一、构建一、构建cDNA文库筛选目的基因文库筛选目的基因 1. 真核细胞真核细胞mRNA的分离纯化的分离纯化提取细胞内总提取细胞内总RNA：裂解、离心去核、：裂解、离心去核、抽提抽提RNA分离纯化分离纯化mRNA：oligo-dT纤维亲和层纤维亲和层
8、析柱析柱模板：模板：mRNAmRNA引物：引物：oligo-dToligo-dT逆转录酶：依赖逆转录酶：依赖RNARNA的的DNADNA聚合酶聚合酶底物：底物：dNTP dNTP 合成方向：合成方向：5 35 32. 反转录合成反转录合成cDNA逆转录酶逆转录酶RNaseHDNA聚合酶mRNA 模板模板杂化双链杂化双链单链 DNAc DNA与载体连接、导入宿主细胞AAA3AAA3TTT5TTT53GGG3GGG5CCCTTT5AAA33. 构建构建cDNA文库文库 cDNA两端加接头两端加接头或衔接头或衔接头 cDNA与载体相连与载体相连 导入宿主细胞进行导入宿主细胞进行克隆（来自一个细克隆（
9、来自一个细胞的克隆体）胞的克隆体） 4. 筛选目的基因筛选目的基因 核酸杂交法：核酸杂交法：用与目的基因互补、带用与目的基因互补、带放射性标记的寡核苷酸链为放射性标记的寡核苷酸链为“探针探针”，与目的基因特异结合并示踪与目的基因特异结合并示踪 免疫结合法：免疫结合法：应用特异性抗体应用特异性抗体免疫免疫学探针进行筛选学探针进行筛选(表达性载体）表达性载体）第二节第二节 获得目的基因方法的选择原则获得目的基因方法的选择原则一、根据获得目的基因的目的一、根据获得目的基因的目的二、根据目的基因本身特点二、根据目的基因本身特点三、根据实验室设备条件三、根据实验室设备条件第二部分第二部分 重组体的构成、
10、导入和筛选重组体的构成、导入和筛选第一节第一节 基因克隆的载体基因克隆的载体载体分为克隆载体（载体分为克隆载体（cloning vector）和表达载）和表达载体（体（expression vector），是携带目的基因进入），是携带目的基因进入宿主细胞扩增和表达的工具。常用质粒宿主细胞扩增和表达的工具。常用质粒DNA、噬菌体噬菌体DNA或病毒进行适当改建而成。或病毒进行适当改建而成。基因载体的功能：基因载体的功能：1.是运载体，携带目的基因是运载体，携带目的基因进入受体细胞进入受体细胞; 2.能自主复制，进入细胞后可能自主复制，进入细胞后可以进行复制或表达基因产物以进行复制或表达基因产物;
11、3.具备筛选标志具备筛选标志; 4.适当限制酶切位点适当限制酶切位点; 5.在细胞中拷贝数高。在细胞中拷贝数高。质粒（质粒（plasmid）是细菌内携带的染色体外）是细菌内携带的染色体外的小型双链环状的小型双链环状DNA，能独立进行复制。，能独立进行复制。具备下列特点：具备下列特点：1.分子量相对较小能在细菌内稳定存在，有较高的拷贝分子量相对较小能在细菌内稳定存在，有较高的拷贝数。数。2.具有一个以上的遗传标志，便于在宿主细胞进行选择。具有一个以上的遗传标志，便于在宿主细胞进行选择。3.具有多个限制性酶的单一切口，称为多克隆位点。便具有多个限制性酶的单一切口，称为多克隆位点。便于外源基因的插入
12、。于外源基因的插入。常用质粒载体常用质粒载体 pBR322质粒：由一系列大肠杆菌质粒质粒：由一系列大肠杆菌质粒DNA通通过重组技术构建成，长度为过重组技术构建成，长度为4.36kb，特点：，特点：（1）含有复制起始点和复制调节信号；）含有复制起始点和复制调节信号；（2）有单个）有单个EcoRI酶切位点，可切开插入目的基因；酶切位点，可切开插入目的基因；（3）有抗四环素基因）有抗四环素基因Ter+和抗氨苄青霉素基因和抗氨苄青霉素基因 Amp+，便于重组体细胞的筛选。便于重组体细胞的筛选。 pUC系列载体系列载体:由由pBR质粒与质粒与M13噬菌体构建而成，长度为噬菌体构建而成，长度为2.674k
13、b，特点：，特点：（1）含有）含有抗氨苄青霉素基因抗氨苄青霉素基因 Amp+和复制起始和复制起始 点。点。（2）含有大肠杆菌）含有大肠杆菌lacZ操纵子操纵子的的DNA片段（片段（lacZ基因），基因），与宿主细胞实现基因内互补，形成完整的与宿主细胞实现基因内互补，形成完整的-半乳糖苷酶基半乳糖苷酶基因，能分解生色底物因，能分解生色底物5-溴溴-4-氢氢-3-吲哚吲哚- -D半乳糖苷半乳糖苷, 形成形成蓝色菌落蓝色菌落蓝白斑筛选。蓝白斑筛选。（一）粘性末端连接（一）粘性末端连接1. 全同源粘性末端全同源粘性末端 同一单酶切；方便，但高背景（空白载体）和双向插入同一单酶切；方便，但高背景（空白载
14、体）和双向插入载体：载体： 5-G AATTC-3 3-CTTAA G-5目的目的DNA：5G AATTC-G AATTC3 3CTTAA G-CTTAA G5第二节第二节 目的基因与载体的连接目的基因与载体的连接定向克隆：使外源定向克隆：使外源DNA片段定向插入片段定向插入到载体分子。到载体分子。 双酶切，双酶切，(1) 载体不能自连载体不能自连 (2) 目的目的DNA定向插入定向插入 粘粘-粘，粘粘，粘-平平 粘粘-粘连接效率很高粘连接效率很高 DNA连接反应都是由连接反应都是由T4DNA连接酶介导连接酶介导（二）人工接头连接（二）人工接头连接1.连接子：人工方法合成含有限制酶切位点的连接
15、子：人工方法合成含有限制酶切位点的寡聚核苷酸片段，与目的基因连接，再用相寡聚核苷酸片段，与目的基因连接，再用相应酶切，目的基因可带有粘性末端。应酶切，目的基因可带有粘性末端。2.普适子：人工方法直接合成粘性末端，不经普适子：人工方法直接合成粘性末端，不经酶切即可与载体连接。酶切即可与载体连接。3.T-A克隆：直接对克隆：直接对PCR产物克隆的技术，不依产物克隆的技术，不依赖模板在扩增产物两端加赖模板在扩增产物两端加“A”，在载体切口，在载体切口处加处加“T”即可连接。即可连接。二、连接反应的建立二、连接反应的建立 温度：粘性末端的连接一般在温度：粘性末端的连接一般在1215，平末端的连接可在室
16、温，但温度高于平末端的连接可在室温，但温度高于30 会导致会导致T4DNA连接酶不稳定。连接酶不稳定。 DNA量：载体与目的基因的分子数之比约量：载体与目的基因的分子数之比约 1：3 酶量：按其定义酶量：按其定义第三节第三节 重组体导入受体细胞重组体导入受体细胞 转化：转化：质粒及其重组子导入受体细胞质粒及其重组子导入受体细胞 转染：转染：病毒及其重组子导入受体细胞病毒及其重组子导入受体细胞 转导：转导：噬菌体及其重组子导入受体细胞噬菌体及其重组子导入受体细胞受体细胞多为大肠杆菌受体细胞多为大肠杆菌K-12经改造成为安全的经改造成为安全的宿主菌，限制酶和重组酶缺陷型，经特殊处理宿主菌，限制酶和
17、重组酶缺陷型，经特殊处理成为感受态菌（细菌处于容易吸收外源成为感受态菌（细菌处于容易吸收外源DNA的的状态）状态）感受态菌的制备：感受态菌的制备：1.氯化钙法：细菌处于低温、低渗氯化钙法：细菌处于低温、低渗CaCl2溶液溶液中，菌细胞壁通透性增加，菌体膨胀成球中，菌细胞壁通透性增加，菌体膨胀成球形，经短暂热休克后重组形，经短暂热休克后重组DNA易进入易进入2.电穿孔法：除特殊仪器外比氯化钙法更简电穿孔法：除特殊仪器外比氯化钙法更简单，使用时注意电场强度、电脉冲长度、单，使用时注意电场强度、电脉冲长度、DNA浓度等参数。浓度等参数。第四节第四节 重组体的筛选与鉴定重组体的筛选与鉴定利用抗药基因（
18、或失活）、蓝白斑进行初筛利用抗药基因（或失活）、蓝白斑进行初筛提取重组体提取重组体DNA限制内酶切，琼脂糖凝胶电泳电泳区带比较电泳区带比较 （指纹图谱） 插入片段长度鉴定插入片段长度鉴定: 酶切鉴定酶切鉴定; PCR鉴定鉴定 插入片段方向鉴定：正向或反向，使用联插入片段方向鉴定：正向或反向，使用联合酶切合酶切 DNA序列测定序列测定第五节第五节 克隆基因的扩增和表达克隆基因的扩增和表达大肠杆菌培养繁殖使克隆基因扩增大肠杆菌培养繁殖使克隆基因扩增原核生物只有一种RNA聚合酶，识别原核细胞的启动子，催化所有RNA的合成真核基因在原核细胞中表达，将外源基因克隆在原核表达载体启动子下游载体分为（1）克
19、隆载体外源基因在受体细胞中复制扩增。（2）表达载体外源基因在受体细胞中表达（转录和翻译）表达载体：表达载体：克隆载体上加合适的转录和翻译调控序克隆载体上加合适的转录和翻译调控序列及强启动子列及强启动子正确的阅读框架正确的阅读框架选择合适的宿主细胞选择合适的宿主细胞基因表达产物的检测基因表达产物的检测Western印迹印迹法法 1.蛋白质样品的制备：蛋白质样品的制备： 2.电泳电泳: 3.转移转移: 4.鉴定：鉴定：基因表达产物（蛋白质或肽）的分离纯基因表达产物（蛋白质或肽）的分离纯化技术化技术包涵体中重组蛋白质的分离与纯化 包涵体是外源基因在原核细胞中高效表达，形成由膜包裹的高密度、不溶性蛋白颗粒。 包涵体内的蛋白质是非折叠状态的聚集体，不具有生物学活性。 包涵体内的蛋白质可免受蛋白酶的降解作用 包涵体大小、密度较细胞中其他成分大，低速离心的方法易于分离。谢谢！
