1、第五章第五章 发酵工业的灭菌及发酵工业的灭菌及空气除菌空气除菌n第一节第一节 消毒与灭菌消毒与灭菌n第二节第二节 发酵工业的无菌技术发酵工业的无菌技术n第三节第三节 培养基与发酵设备的灭菌培养基与发酵设备的灭菌n第四节第四节 空气的除菌空气的除菌目的要求：目的要求：n了解灭菌对发酵工业的意义，灭菌的原了解灭菌对发酵工业的意义，灭菌的原理及常用的方法。理及常用的方法。n掌握培养基及发酵设备的灭菌方法。掌握培养基及发酵设备的灭菌方法。n了解生产中空气除菌的基本方法、原理了解生产中空气除菌的基本方法、原理及设备。理解空气净化流程。及设备。理解空气净化流程。 几个问题几个问题n1、灭菌对发酵的意义、灭
2、菌对发酵的意义n2、灭菌的原理、灭菌的原理n3、灭菌的方法、灭菌的方法n4、灭菌的对象、灭菌的对象n5、空气的灭菌、空气的灭菌灭菌的目的及内容灭菌的目的及内容n目的：目的：为了保证纯种并安全发酵为了保证纯种并安全发酵n内容：内容：n培养基培养基n补料液（流加料）补料液（流加料） 发酵过程的无菌控制发酵过程的无菌控制n空气系统空气系统 直接关系到直接关系到n发酵罐发酵罐 生产的成败生产的成败!n管道系统管道系统n环境：需要消毒环境：需要消毒第一节第一节 消毒与灭菌消毒与灭菌n一、控制有害微生物的主要措施一、控制有害微生物的主要措施 二、几个概念二、几个概念n（一）灭菌（一）灭菌n（二）消毒（二）
3、消毒n（三）防腐（三）防腐n（四）化疗（四）化疗（一）灭菌（一）灭菌（sterilization）n灭菌：灭菌： （p128）n采用理化因素使任何物体内外部的一切微生采用理化因素使任何物体内外部的一切微生物永远丧失其生长繁殖能力的措施，称为灭物永远丧失其生长繁殖能力的措施，称为灭菌。菌。 Sterilization就是失去繁殖力。就是失去繁殖力。n例如各种高温灭菌措施等。例如各种高温灭菌措施等。n灭菌实质上可分灭菌实质上可分杀菌和溶菌杀菌和溶菌两种，前者指菌两种，前者指菌体虽死，但形体尚存，后者则指菌体杀死后，体虽死，但形体尚存，后者则指菌体杀死后，其细胞发生溶化、消失的现象其细胞发生溶化、消
4、失的现象 。（二）消毒（二）消毒n从字义上来看，从字义上来看，消毒消毒就是消除毒害，这就是消除毒害，这里的里的“毒害毒害”就是指传染源或致病菌的就是指传染源或致病菌的意思。意思。n消毒消毒: :是一种采用是一种采用较温和较温和的理化因素，仅的理化因素，仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害杀死物体表面或内部一部分对人体有害的病原菌，而对被消毒的物体基本无害的病原菌，而对被消毒的物体基本无害的措施。的措施。（三）防腐（三）防腐（antisepsis）n防腐防腐: :就是利用某种理化因素完全抑就是利用某种理化因素完全抑制霉腐微生物的生长繁殖，从而达制霉腐微生物的生长繁殖，从而达到防止食品等发生霉腐的
5、措施。到防止食品等发生霉腐的措施。n（1 1）低温）低温n（2 2）缺氧）缺氧n（3 3）干燥）干燥 n（4 4）高渗）高渗 n（5 5）高酸度）高酸度 n（6 6）防腐剂）防腐剂（四）化疗（四）化疗（chemotherapy）n化疗:即化学治疗。它是利用具有高度选择高度选择毒力毒力（即对病原菌具有高度毒力而对宿主无显著毒性）的化学物质来抑制宿主体内病原微生物的生长繁殖，借以达到治疗该传染病的一种措施。n用于化疗目的的化学物质称化学治疗剂化学治疗剂。最重要的化学治疗剂如各种抗生素、磺胺类药物和中草药中的有效成分等。第二节第二节 发酵工业的无菌技术发酵工业的无菌技术n常用的除菌方法（p128-1
6、29）n一、高温灭菌一、高温灭菌：干热灭菌和湿热灭菌。火焰灭干热灭菌和湿热灭菌。火焰灭菌：接种时用。菌：接种时用。n二、射线灭菌二、射线灭菌：用紫外线、高能电磁波或放射用紫外线、高能电磁波或放射性物质产生的高能粒子进行灭菌的方法。性物质产生的高能粒子进行灭菌的方法。n三、化学药剂灭菌三、化学药剂灭菌：一些化学药剂能与微生物一些化学药剂能与微生物反应而具杀菌作用。适用于环境、设备等方面反应而具杀菌作用。适用于环境、设备等方面的消毒，一般不用于培养基的灭菌。的消毒，一般不用于培养基的灭菌。n四、过滤除菌四、过滤除菌：利用过滤方法阻留微生物，达利用过滤方法阻留微生物，达灭菌目的。适用于澄清流体（如气
7、体和液体）灭菌目的。适用于澄清流体（如气体和液体）的除菌以及热敏性培养基的除菌。的除菌以及热敏性培养基的除菌。 一、高温杀菌一、高温杀菌n（一）高温致死原理（一）高温致死原理n（二）高温灭菌的方法（二）高温灭菌的方法n（三）高温对培养基成分的有害影响及其防止（三）高温对培养基成分的有害影响及其防止n（四）灭菌设备（四）灭菌设备（一）高温致死原理（一）高温致死原理n高温使微生物的蛋白质和核酸等重要生高温使微生物的蛋白质和核酸等重要生物高分子发生变性、破坏。物高分子发生变性、破坏。n例如它可使核酸发生脱氨、脱嘌呤或降解，以及破坏细胞膜上的类脂质成分等。（二）高温灭菌的方法（二）高温灭菌的方法1 1
8、干热灭菌法干热灭菌法n干热灭菌法：干热灭菌法： 将金属制品或清洁玻璃器皿放入电将金属制品或清洁玻璃器皿放入电热干燥箱内，在热干燥箱内，在160160170170下维持下维持1 12h2h后，即可后，即可达到彻底灭菌的目的。达到彻底灭菌的目的。n原因：原因：在这种条件下，可使细胞膜破坏、蛋白质变在这种条件下，可使细胞膜破坏、蛋白质变性、原生质干燥，以及各种细胞成分发生氧化。性、原生质干燥，以及各种细胞成分发生氧化。n适用对象：适用对象：玻璃器皿、金属材料、耐高温物品。玻璃器皿、金属材料、耐高温物品。n灼烧：灼烧：是一种最彻底的干热灭菌方法，但它只能用是一种最彻底的干热灭菌方法，但它只能用于接种环
9、、接种针等少数对象的灭菌。于接种环、接种针等少数对象的灭菌。 2 2湿热灭菌法湿热灭菌法n湿热灭菌法：湿热灭菌法：利用饱和蒸汽进行灭菌的方法。利用饱和蒸汽进行灭菌的方法。n湿热灭菌法与干热灭菌法的比较：湿热灭菌法与干热灭菌法的比较：湿热灭菌法比湿热灭菌法比干热灭菌法更有效，这一方面是由于湿热干热灭菌法更有效，这一方面是由于湿热易于传易于传递热量递热量，另一方面是由于，另一方面是由于湿热湿热更易破坏更易破坏保持蛋白保持蛋白质稳定性的氢键等结构质稳定性的氢键等结构，从而加速其变性。，从而加速其变性。n方法：方法：常压和高压常压和高压。n微生物的耐热情况：微生物的耐热情况：n多数细菌和真菌的营养细胞
10、在多数细菌和真菌的营养细胞在6060左右处理左右处理5 510min10min后即后即可杀死；可杀死；n酵母菌和真菌的孢子稍耐热些，要用酵母菌和真菌的孢子稍耐热些，要用8080以上的温度处理以上的温度处理才能杀死；才能杀死；n细菌的芽孢最耐热，一般要在细菌的芽孢最耐热，一般要在121121下处理下处理15min15min才能杀死。才能杀死。（1 1）常压法）常压法n巴氏消毒法巴氏消毒法： 用于牛奶、啤酒、果酒和酱油用于牛奶、啤酒、果酒和酱油等不能进行高温灭菌的液体的一种消毒方法，等不能进行高温灭菌的液体的一种消毒方法，其主要目的是其主要目的是杀死其中无芽孢的病原菌杀死其中无芽孢的病原菌（如牛（
11、如牛奶中的结核杆菌或沙门氏菌），而又不影响它奶中的结核杆菌或沙门氏菌），而又不影响它们的风味。们的风味。它是一种低温消毒法。它是一种低温消毒法。n低温维持法：低温维持法：在在63下保持下保持30minmin可进行牛奶可进行牛奶消毒；消毒；n高温瞬时法：高温瞬时法：用于牛奶消毒时只要在用于牛奶消毒时只要在72下保下保持持15秒钟即可。秒钟即可。n间歇灭菌法间歇灭菌法：又称丁达尔灭菌法或分段灭菌法。又称丁达尔灭菌法或分段灭菌法。n方法：方法：将待灭菌的培养基在将待灭菌的培养基在80100下蒸煮下蒸煮1560minmin，以杀死其中所有微生物的，以杀死其中所有微生物的营养细营养细胞胞，然后置室温或，
12、然后置室温或37下保温过夜，诱导残留下保温过夜，诱导残留的的芽孢发芽芽孢发芽，第二天再以同法蒸煮和保温过夜，第二天再以同法蒸煮和保温过夜，如此连续重复如此连续重复3天，即可在较低温度下达到彻天，即可在较低温度下达到彻底灭菌的效果。底灭菌的效果。n用途：用途：适用于不耐热培养基的灭菌。适用于不耐热培养基的灭菌。（2 2）加压法）加压法n常规加压灭菌法:将盛有适量水的加压蒸汽灭将盛有适量水的加压蒸汽灭菌锅加热煮沸，菌锅加热煮沸，彻底驱尽气体彻底驱尽气体后将锅密闭。后将锅密闭。n分为两种具体的方法：分为两种具体的方法：n再继续加热至再继续加热至121（压力为（压力为1kgcm2或或15磅英寸磅英寸2
13、），时间维持），时间维持1520minmin；n或采用在较低的温度或采用在较低的温度115，（即压力为，（即压力为0.7kgcm2或或10磅英寸磅英寸2）下维持）下维持35minmin。n用途：用途：一切微生物学实验室、医疗保健机构或发一切微生物学实验室、医疗保健机构或发酵工厂中对培养基及多种器材、物料的灭菌。酵工厂中对培养基及多种器材、物料的灭菌。 连续加压灭菌法“连消法”n用途：只在大规模的发酵工厂中作培养基灭菌用。n主要操作：将培养基在发酵罐外连续不断地进行加热、维持和冷却加热、维持和冷却，然后才进入发酵罐。n方法：培养基一般在135140下处理515秒钟以达到灭菌的目的秒钟以达到灭菌的
14、目的。 连续加压灭菌法优点：连续加压灭菌法优点： n因采用高温瞬时灭菌，故因采用高温瞬时灭菌，故既可既可杀灭微生物，杀灭微生物，又又可可最大限度减少营养成分的破坏，从而提高了原最大限度减少营养成分的破坏，从而提高了原料的利用率，比料的利用率，比“实罐灭菌实罐灭菌”（121121，30min30min）提高产量提高产量5 51010；n由于由于总的总的灭菌时间较分批灭菌注明显减少，所灭菌时间较分批灭菌注明显减少，所以缩短了发酵罐的占用周期，从而提高了它的利以缩短了发酵罐的占用周期，从而提高了它的利用率；用率；n由于蒸汽负荷均匀，故提高了锅炉的利用率；由于蒸汽负荷均匀，故提高了锅炉的利用率；n适宜
15、于自动化操作；适宜于自动化操作；n降低了操作人员的劳动强度。降低了操作人员的劳动强度。 影响加压蒸汽灭菌效果的因素影响加压蒸汽灭菌效果的因素 n（1 1）灭菌物体含菌量的影响）灭菌物体含菌量的影响n（2 2）灭菌锅内空气排除程度的影响）灭菌锅内空气排除程度的影响n（3 3）灭菌对象）灭菌对象pHpH的影响的影响n（4 4）灭菌对象的体积）灭菌对象的体积n（5 5）加热与散热速度）加热与散热速度n（1）灭菌物体含菌量的影响n天然原料尤其是麸皮等植物性原料配成的培养基，一般含菌量较高，而用纯粹化学试剂配制成的组合培养基，含菌量低。n（2）灭菌锅内空气排除程度的影响n检验灭菌锅内空气排除度，可采用多
16、种检验灭菌锅内空气排除度，可采用多种方法。最好的办法是方法。最好的办法是灭菌锅上同时装有灭菌锅上同时装有压力表和温度计压力表和温度计，其次是将待测气体通，其次是将待测气体通过橡胶管引入深层冷水中，如只听到过橡胶管引入深层冷水中，如只听到“扑扑扑扑”声而未见有气泡冒出，也可证声而未见有气泡冒出，也可证明锅内已是纯蒸汽了。明锅内已是纯蒸汽了。n（3）灭菌对象pH的影响n（4）灭菌对象的体积n要防止用常规的压力和时间在加压灭菌锅内进行大容量大容量培养基的灭菌。n（5）加热与散热速度n这两段也对灭菌效果和培养基成分发生影响。为了使科学研究的结果有良好的重演性，在灭菌操作中对这些技术细节都应加以注意。
17、（三）高温对培养基成分的有害（三）高温对培养基成分的有害影响及其防止影响及其防止 消除高温有害影响的措施：消除高温有害影响的措施：n（1）采用特殊加热灭菌法）采用特殊加热灭菌法 n（2 2）对易破坏的含糖培养基进行灭菌时，）对易破坏的含糖培养基进行灭菌时，应先将糖液与其他成分应先将糖液与其他成分分别灭菌分别灭菌后再合并。后再合并。n（3 3）对含）对含Ca2+或或Fe3+的培养基与磷酸盐先的培养基与磷酸盐先作分别灭菌，然后再混合，就不易形成磷酸作分别灭菌，然后再混合，就不易形成磷酸盐沉淀。盐沉淀。n（4 4）对含有在高温下易破坏成分的培养）对含有在高温下易破坏成分的培养基（如含糖组合培养基）可
18、进行基（如含糖组合培养基）可进行低压灭低压灭菌菌（在（在112即即0.57kgcm2或或8磅磅英寸英寸2下灭菌下灭菌15minmin）或间歇灭菌。）或间歇灭菌。n（5 5）在大规模发酵工业中，可采用连续）在大规模发酵工业中，可采用连续加压灭菌法进行培养基的灭菌。加压灭菌法进行培养基的灭菌。n1. 1. 高压蒸汽灭菌设备高压蒸汽灭菌设备 n2 2常压蒸汽灭菌锅常压蒸汽灭菌锅（四）灭菌设备 1. 1.高压蒸汽灭菌设备高压蒸汽灭菌设备 n手提式灭菌锅：手提式灭菌锅：容量小，多用于母种培养基灭菌。n立式或卧式灭菌锅：立式或卧式灭菌锅：较大，多用于原种或少量栽培种培养基的灭菌，一般能装几十瓶或几百瓶。n
19、灭菌柜：灭菌柜：要和蒸汽锅炉配套，用于大量的原种和栽培种培养基的灭菌，一次能装几百至几千瓶(袋)。但投资太大，适合大型菌种场使用。n2常压蒸汽灭菌锅常压蒸汽灭菌锅 n常压蒸汽灭菌锅是用铁锅、砖、水泥砌常压蒸汽灭菌锅是用铁锅、砖、水泥砌成的，造价低，适于一般生产单位和专成的，造价低，适于一般生产单位和专业户使用。大小可根据需要而定，但最业户使用。大小可根据需要而定，但最大的锅每次装料也最好不超过大的锅每次装料也最好不超过500KgKg。 3烘箱烘箱 n烘箱主要是用于玻璃器皿的干燥和灭菌，烘箱主要是用于玻璃器皿的干燥和灭菌，也可用于其它物品烘干。也可用于其它物品烘干。 二、射线灭菌二、射线灭菌n射
20、线灭菌：射线灭菌：n是用紫外线、高能电磁波或放射性物质产生的高能粒子进行灭菌的方法。 n常用的方法：常用的方法：n波长为2537A的紫外线，多用于表面及空气消毒。n 0.061.4A的X射线。n C060产生的射线。n 微波灭菌等。三、化学杀菌剂或制菌剂三、化学杀菌剂或制菌剂（一）表面消毒剂（一）表面消毒剂n表面消毒剂：是指对一切活细胞都有毒性，不能用作活细胞内的化学治疗用的化学药剂。n常用消毒剂的种类很多，它们的杀菌强度各不相同。但几乎都有一个共同规律，即当其在极低浓度时，常常会对微生物的生命活动起刺激作用，随着浓度逐渐增高，就相继出现制菌和杀菌作用，因而形成一个连续的作用谱。n适用：环境以
21、及物体表面的消毒（二）石炭酸系数（二）石炭酸系数n为比较各种表面消毒剂的相对杀菌强度，常采用在临床上最早使用的消毒剂石炭酸作为比较的标准，并提出了石炭酸系数这一指标。n石炭酸系数：指在一定时间内被试药剂能杀死石炭酸系数：指在一定时间内被试药剂能杀死全部供试菌的最高稀释度与达到同效的石炭酸全部供试菌的最高稀释度与达到同效的石炭酸的最高稀释度的最高稀释度的比率的比率。一般规定处理时间为。一般规定处理时间为10minmin，而供试菌定为，而供试菌定为Salmonellatyphi（伤（伤寒沙门氏菌）。寒沙门氏菌）。 四、过滤除菌n过滤除菌：将液体或气体用微孔薄膜过滤，使大于孔径的细菌等微生物颗粒阻留
22、阻留，从而达到除菌目的。n适用：n澄清流体（如气体和液体）的除菌n热敏性培养基的除菌n工业生产中用于制备无菌空气n产品提取过程中处理料液而获得无菌产品（尤其适合对热不稳定的物质）。n在实际生产中，以上几种方法有时根据情况可结合在实际生产中，以上几种方法有时根据情况可结合使用。如制备培养基时，其中一些成分对热敏感使用。如制备培养基时，其中一些成分对热敏感（如氨基酸、维生素等）就要用过滤方法除菌。而（如氨基酸、维生素等）就要用过滤方法除菌。而其它物质可用蒸汽灭菌，最后合并使用。其它物质可用蒸汽灭菌，最后合并使用。n目前，大多实验室采用微孔滤膜滤器除菌。关键步骤是安装滤膜安装滤膜及无菌过滤过程无菌过
23、滤过程。n滤膜过滤装置:n烧结玻璃滤板过滤器、石棉板过滤器（Seitz滤器）、素烧瓷过滤器以及硅藻土过滤器等。n过滤除菌的缺点：是无法去除其中的病毒和噬菌体。n常见的过滤器滤膜孔径：0.22、0.45m。n可以拦截的微生物：细菌、放线菌、酵母菌、霉菌。n除病毒需要的滤膜孔径：0.04m。醋酸纤维素膜过滤器拦截的醋酸纤维素膜过滤器拦截的 大肠杆菌图片大肠杆菌图片板式膜分离器（实验室用）中空纤维膜分离器（实验室用）中空纤维膜分离器（工业用）第三节第三节 培养基与发酵设备的灭菌培养基与发酵设备的灭菌 培养基与设备灭菌的方法（培养基与设备灭菌的方法（p129-137） 高压蒸汽湿热灭菌法高压蒸汽湿热灭
24、菌法一、湿热灭菌的基本原理一、湿热灭菌的基本原理二、影响培养基灭菌的因素二、影响培养基灭菌的因素三、灭菌的实际操作三、灭菌的实际操作n原理：湿热灭菌是直接用蒸汽灭菌。蒸汽冷凝时释放大量潜热，并具有强大的穿透力，在高温和水存在时，微生物细胞中的蛋白质极易发生不可逆的凝固性变性，致使微生物在短时间内死亡。n致死温度：杀死微生物的极限温度。n致死时间：杀死全部微生物所需的时间。n由于湿热灭菌有经济和快速等特点，因此被广泛用于工业生产。一、湿热灭菌的基本原理一、湿热灭菌的基本原理n用蒸汽加热的方法对培养基灭菌的要求用蒸汽加热的方法对培养基灭菌的要求: :n既要达到一定的灭菌程度。既要达到一定的灭菌程度
25、。 n又要尽量减少营养成分的破坏。又要尽量减少营养成分的破坏。（一）理论灭菌时间（一）理论灭菌时间 n某些分子的分解和分子内部的重新排列的反应属于单分子反应单分子反应。n杂菌虽然是一个复杂的高分子体系，但其受热被杀死，主要原因是高温能使蛋高温能使蛋白质变性白质变性，这种反应属于单分子反应这种反应属于单分子反应，因此，杂菌在一定温度下受热死亡也遵遵循单分子反应方程。循单分子反应方程。 微生物受热死亡的定律微生物受热死亡的定律对数残留定律：对数残留定律：n计算灭菌时间的基本公式计算灭菌时间的基本公式对数残留方程：对数残留方程： nt t =(2.303/k)log(No/Nt) =(2.303/k
26、)log(No/Nt) t t-灭菌时间（灭菌时间（s s） k-k-灭菌反应速度常数，与菌的种类和灭菌温度有关（灭菌反应速度常数，与菌的种类和灭菌温度有关（s s） No-No-灭菌开始时，培养基中杂菌个数（个灭菌开始时，培养基中杂菌个数（个mlml） -经过灭菌时间经过灭菌时间t t后，残存活菌个数（个后，残存活菌个数（个mlml） 灭菌时间与污染程度（灭菌时间与污染程度（NoNo）、灭菌程度（）、灭菌程度（NtNt）和灭菌反）和灭菌反应速度常数（应速度常数（k k）有关。）有关。灭菌时间和温度呈反比关系。（p 130）（二）灭菌温度与灭菌反应速度常数（二）灭菌温度与灭菌反应速度常数的关系
27、的关系 n灭菌温度与灭菌反应速度常数的关系灭菌温度与灭菌反应速度常数的关系阿仑乌阿仑乌斯定律斯定律： nk=Aek=Ae-E/RT-E/RT K K灭菌反应速度常数（灭菌反应速度常数（ s s-1-1）A A阿仑乌斯常数（阿仑乌斯常数（s s-1-1） E E活化能（活化能（J Jmolmol）R R气体常数气体常数 4.18684.18681.98J1.98J（ molKmolK） T T绝对温度（绝对温度（K K） 灭菌温度越低，K值越小，灭菌时间越长；反之，灭菌温度越高，K值越大，则灭菌时间越短。（p130-131）n杀死细菌和芽孢的温度和时间：杀死细菌和芽孢的温度和时间：n一般根据试验
28、确定。n或者根据推算确定。np131二、影响培养基灭菌的因素二、影响培养基灭菌的因素(p134-135) n1 1、培养基成分、培养基成分 n2 2、培养基的物理状态、培养基的物理状态n3 3、培养基、培养基pHpH值的影响值的影响n4 4、微生物细胞含水量、微生物细胞含水量n5 5、培养基中微生物的性质与数量、培养基中微生物的性质与数量n6 6、冷空气排除情况、冷空气排除情况n7 7、泡沫、泡沫n8 8、搅拌、搅拌1 1、培养基成分、培养基成分n培养基的成分中，油脂、糖类、蛋白质都是传培养基的成分中，油脂、糖类、蛋白质都是传热的不良介质，会增加微生物的耐热性，使灭热的不良介质，会增加微生物的
29、耐热性，使灭菌困难。菌困难。n浓度较高浓度较高的培养基相对需要较高温度和较长时的培养基相对需要较高温度和较长时间灭菌。间灭菌。n高浓度的盐类高浓度的盐类，色素则削弱其耐热性，故较易，色素则削弱其耐热性，故较易灭菌。灭菌。n天然培养基天然培养基不易灭菌，而化学合成培养基较易不易灭菌，而化学合成培养基较易灭菌。灭菌。2 2、培养基的物理状态、培养基的物理状态n培养基中的颗粒物质大大，灭菌困难，反之，灭菌容易。n一般说来，含有小于1mm颗粒的培养基对灭菌影响不大。n但在培养基混有较大颗粒，特别是存在凝结成团的胶体凝结成团的胶体时，会影响灭菌效果，必须过滤除去。 3 3、培养基的、培养基的pHpH值值
30、npH值对微生物的耐热性影响很大：npH为6.08.0时微生物最不易死亡最不易死亡npH6.0时，氢离子易渗入微生物的细胞内，促使其死亡，缩短灭菌时间。n培养基pH与灭菌时间的关系见p134表5-4。4、微生物细胞含水量、微生物细胞含水量n微生物细胞含水量越少，越耐热，灭菌微生物细胞含水量越少，越耐热，灭菌时间越长。时间越长。n孢子、芽孢的含水量少，要长时间，高孢子、芽孢的含水量少，要长时间，高温才能将其杀死。温才能将其杀死。5、微生物性质与数量、微生物性质与数量n微生物的种类不同，耐热情况不同。因此，采用微生物的种类不同，耐热情况不同。因此，采用的灭菌温度不同。的灭菌温度不同。 n细菌、酵母
31、菌的营养体、霉菌的菌丝体对热敏感；细菌、酵母菌的营养体、霉菌的菌丝体对热敏感；放线菌、酵母菌、霉菌的孢子，细菌的芽孢等，放线菌、酵母菌、霉菌的孢子，细菌的芽孢等，对热的抵抗力强。对热的抵抗力强。n处于不同生长时期的微生物耐热不同，采用的温处于不同生长时期的微生物耐热不同，采用的温度不同。度不同。n数量多灭菌的时间长，含芽孢灭菌的时间长。数量多灭菌的时间长，含芽孢灭菌的时间长。6、冷空气排除情况、冷空气排除情况n高压蒸汽灭菌锅中的冷空气对灭菌效果影响很大。高压蒸汽灭菌锅中的冷空气对灭菌效果影响很大。n原因：原因：n冷空气导热性能差。冷空气导热性能差。n降低高压锅内的蒸汽分压使之不能达到应有的温降
32、低高压锅内的蒸汽分压使之不能达到应有的温度。度。n因此，因此，灭菌器内的冷空气一定要排除彻底灭菌器内的冷空气一定要排除彻底，否则，否则高压锅内的实际温度要低于压力表所对应的温度，高压锅内的实际温度要低于压力表所对应的温度，达不到灭菌效果。达不到灭菌效果。n空气排除程度与温度的关系，见空气排除程度与温度的关系，见p135p135表表5-65-6。7、泡沫、泡沫n泡沫中的空气形成泡沫中的空气形成隔热层隔热层，使传热困难，使传热困难，所以要消泡。所以要消泡。8、搅拌、搅拌n搅拌的作用：搅拌的作用：n不至于造成局部过热或灭菌死角的情况，不至于造成局部过热或灭菌死角的情况，在保证不过多的破坏培养基营养成
33、分的在保证不过多的破坏培养基营养成分的前提下，达到前提下，达到彻底灭菌彻底灭菌的目的。的目的。三、灭菌的实际操作三、灭菌的实际操作 （p131-137） n（一）（一）发酵罐和液体培养基的灭菌发酵罐和液体培养基的灭菌n（二）固体培养基的灭菌（二）固体培养基的灭菌n（三）其他设备的灭菌（三）其他设备的灭菌 （一）（一）发酵罐发酵罐和和液体液体培养基的培养基的 灭菌灭菌发酵罐灭菌包括：发酵罐灭菌包括： 种子罐、发酵罐、计量罐、补料罐等的空罐灭菌及管道灭菌等。种子罐、发酵罐、计量罐、补料罐等的空罐灭菌及管道灭菌等。灭菌的方法：灭菌的方法：n发酵罐的灭菌方法：发酵罐的灭菌方法：空消、实消n液体培养基的
34、灭菌方法：液体培养基的灭菌方法：分批灭菌（实消）、连续灭菌（连消）n灭菌具体的方法：n、空罐灭菌（空消）空罐灭菌（空消）2 2、实罐灭菌（实消，分批灭菌）、实罐灭菌（实消，分批灭菌）3 3、连续灭菌（连消）、连续灭菌（连消）（一）（一）发酵罐发酵罐和和液体液体培养基的培养基的 灭菌灭菌n发酵罐灭菌包括：发酵罐灭菌包括： 种子罐、发酵罐、计量罐、补料罐等的空罐灭菌及管种子罐、发酵罐、计量罐、补料罐等的空罐灭菌及管道灭菌等。道灭菌等。n灭菌的方法：灭菌的方法：n发酵罐的灭菌方法：发酵罐的灭菌方法：空消、实消n液体培养基的灭菌方法：液体培养基的灭菌方法：分批灭菌（实消）、连续灭菌（连消）n灭菌具体的
35、方法：灭菌具体的方法：、空罐灭菌（空消）空罐灭菌（空消）2 2、实罐灭菌（实消，分批灭菌）、实罐灭菌（实消，分批灭菌）3 3、连续灭菌（连消）、连续灭菌（连消）、空罐灭菌空罐灭菌（空消） p137n空罐灭菌：n无论是种子罐、发酵罐、还是尿素（或液氨）罐、消泡罐，当培养基（或物料）尚未进罐前对罐进行预先灭菌，为空罐灭菌。n方法：方法：n一 般一 般 从 管 道 通 入 蒸 汽 ， 使 罐 内 压 力 为从 管 道 通 入 蒸 汽 ， 使 罐 内 压 力 为0.147MPa，维持，维持40min，灭菌结束，关闭，灭菌结束，关闭蒸汽，蒸汽，在保温结束后，关键是随即通入无菌空气，使容器保持正压（0.0
36、98MPa） ，防止形成真空而吸入带菌的空气。n空罐灭菌的特点：空罐灭菌的特点：n为了杀死所有微生物特别是耐热的的芽为了杀死所有微生物特别是耐热的的芽孢，空罐灭菌要求孢，空罐灭菌要求温度较高温度较高，灭菌，灭菌时间时间较长较长，只有这样才能杀死设备中各死角，只有这样才能杀死设备中各死角残存的杂菌或芽孢。残存的杂菌或芽孢。2 2、实罐灭菌（分批灭菌）、实罐灭菌（分批灭菌） p131-132p131-132n实罐灭菌： 将培养基置于发酵罐中用蒸汽加热，达到预定灭菌温度后，维持一定时间，再冷却到接种温度，然后接种发酵的灭菌方法，又称分批灭菌、间歇灭菌。即发酵罐、种子罐等和培养基一起的灭菌发酵罐、种子
37、罐等和培养基一起的灭菌。n操作要求： 为达到良好的灭菌效果，不留死角，应严格按照操作规程进行操作。它包括升温、保温、降温三升温、保温、降温三个阶段个阶段。 n适用： 中小型发酵罐和种子罐的灭菌。 实罐灭菌的特点：实罐灭菌的特点：（p132）n优点：优点：n（1）不需专门灭菌设备，在发酵罐中灭菌即可。）不需专门灭菌设备，在发酵罐中灭菌即可。n（2）投入少，操作简单。）投入少，操作简单。 n（3）灭菌效果可靠，对蒸汽要求低，一般（）灭菌效果可靠，对蒸汽要求低，一般（34）10 Pa（表压）即可。（表压）即可。灭菌标准是灭菌标准是121，1530min。n（4）适合含有固体颗粒、较多泡沫、粘度大的培
38、养基）适合含有固体颗粒、较多泡沫、粘度大的培养基的灭菌。的灭菌。n缺点：缺点：n（1）易发生过热破坏培养基营养的现象。）易发生过热破坏培养基营养的现象。n（2）能耗增加。）能耗增加。n（3）发酵周期延长。）发酵周期延长。n（4）降低发酵罐的利用率。）降低发酵罐的利用率。3、连续灭菌（连消）、连续灭菌（连消） p132-133n连消：液体培养基的连续灭菌又称连消。n就是将配制好的培养基在向发酵罐输送的同时进行加热、保温和冷却的过程，从而达到灭菌的效果。n适用：n发酵培养基、种子培养基、补料等液体培养基发酵培养基、种子培养基、补料等液体培养基灭菌。灭菌。连续灭菌的特点：连续灭菌的特点： （p132
39、-133）n优点：优点：n（1）培养液受热时间短，既能达灭菌要求又）培养液受热时间短，既能达灭菌要求又能减少培养基中营养成分的破坏。能减少培养基中营养成分的破坏。n（2）在培养基连续灭菌过程中，蒸汽用量平）在培养基连续灭菌过程中，蒸汽用量平衡，但蒸汽压力一般要求高于衡，但蒸汽压力一般要求高于5 10 Pa（表压）。（表压）。灭菌标准是灭菌标准是126-132，5-8min。n（3）设备利用率高，适于自动控制。）设备利用率高，适于自动控制。n缺点：缺点：n（1）所用设备多而复杂，投资较大。）所用设备多而复杂，投资较大。n（2）染菌机会大。）染菌机会大。n（3）不适合含有大量固体颗粒培养基的灭菌。
40、）不适合含有大量固体颗粒培养基的灭菌。 培养基连续灭菌的主要设备：培养基连续灭菌的主要设备：n加热器（连消塔）加热器（连消塔）n维持罐（或管）维持罐（或管）n冷却器（喷淋或真空冷却器）冷却器（喷淋或真空冷却器）几种加热器：几种加热器：培养基连消工艺流程图：培养基连消工艺流程图：（p133）喷射加热连续灭菌流程：喷射加热连续灭菌流程： 特点特点: :蒸汽直接喷入生的培养液，温度几乎直接蒸汽直接喷入生的培养液，温度几乎直接上升到预定杀菌温度，由保温段上升到预定杀菌温度，由保温段管子的长度管子的长度来来保证必要的杀菌时间。保证必要的杀菌时间。薄板换热器连续灭菌流程：薄板换热器连续灭菌流程： 特点：特
41、点：效率高，利用效率高，利用冷的培养液作冷却剂冷的培养液作冷却剂。既。既冷却了冷却了热的培热的培养基养基又预热了又预热了冷的培养液，节约用水和蒸汽。并且可在冷的培养液，节约用水和蒸汽。并且可在20S20S内达到杀菌温度，经保温段保持必要的杀菌时间，然后在板内达到杀菌温度，经保温段保持必要的杀菌时间，然后在板式热交换器另一段，式热交换器另一段，20S20S内冷却到发酵温度。内冷却到发酵温度。 热交换器热交换器水水2031 进料进料35 120 120 147 120 55 出料出料35 100 （二）固体培养基的灭菌固体培养基的灭菌 （p133）n1、方法：n采用旋转蒸煮锅也称转鼓式灭菌器（灭菌
42、蒸汽压灭菌蒸汽压力力0.098MPa，维持，维持2030min）进行灭菌。进行灭菌。n2、用途：n固体曲、固体发酵原料的灭菌。n3、固体培养基的特点：n呈片状或粒状，不易翻动，吸水后加热易成团，热传递性能差，冷却困难。4、旋转蒸煮锅结构n有单头（出口）和双头两种，由钢板焊制能承有单头（出口）和双头两种，由钢板焊制能承受一定压力。受一定压力。n锅中心有锅中心有带孔空心横轴，带孔空心横轴， 蒸汽沿轴中心通入锅内加热蒸汽沿轴中心通入锅内加热； 灭菌结束后用真空泵抽气，灭菌结束后用真空泵抽气， 以降压和降温。以降压和降温。n轴装在支架两端的轴装在支架两端的 轴承中，借齿轮轴承中，借齿轮 转动（转动（0
43、.51r/min）。）。（三）其他设备及物品的灭菌（三）其他设备及物品的灭菌（p137）n1、玻璃器皿及用具的灭菌：、玻璃器皿及用具的灭菌： 压力为压力为0.098MPa，维持，维持3060min。n2、空气总过滤器和分过滤器灭菌：、空气总过滤器和分过滤器灭菌： 压力为压力为0.174MPa，维持，维持2h，灭菌完毕，通入压缩空，灭菌完毕，通入压缩空气吹干。气吹干。n3、消泡剂灭菌：、消泡剂灭菌： 121，保温，保温30min。n4、尿素溶液灭菌：、尿素溶液灭菌： 105，保温，保温5min。n淀粉料液的灭菌：淀粉料液的灭菌：121 ，保温，保温30min。n5、各管路的灭菌：、各管路的灭菌：
44、0.3 0.45MPa，保温，保温1h。第四节第四节 空气的除菌空气的除菌（p137-148p137-148） 一、空气除菌的原因一、空气除菌的原因二、空气除菌的方法二、空气除菌的方法三、介质三、介质四、四、五、发酵生产中空气净化的工艺流程五、发酵生产中空气净化的工艺流程一、空气除菌的原因一、空气除菌的原因 n（一）空气中微生物的分布（一）空气中微生物的分布n空气中微生物的含量和种类，随空气中微生物的含量和种类，随地区，季节地区，季节和空和空气中气中灰尘粒子灰尘粒子多少，以及多少，以及人们的活动人们的活动情况而异。情况而异。n北方北方气候干燥，寒冷，空气中的含菌量较多，离气候干燥，寒冷，空气中
45、的含菌量较多，离地面越高，含菌量越少；一般每升高地面越高，含菌量越少；一般每升高10m10m，空气中，空气中的含菌量就降低一个数量级；的含菌量就降低一个数量级；n城市城市的空气中含菌量较多，农村的空气中含菌量的空气中含菌量较多，农村的空气中含菌量较少，一般城市空气中杂菌数为较少，一般城市空气中杂菌数为10103 310104 4个个m m3 3 。n空气中的微生物种类空气中的微生物种类: :以细菌和细菌芽胞较多，以细菌和细菌芽胞较多，也有酵母，霉菌和病毒。也有酵母，霉菌和病毒。n这些微生物大小不一，一般这些微生物大小不一，一般附着在附着在空气中的灰空气中的灰尘上或雾滴上。尘上或雾滴上。n灰尘粒
46、子灰尘粒子的平均大小约的平均大小约0.60.6m左右，所以空气左右，所以空气除菌主要是去除空气中的除菌主要是去除空气中的微粒微粒(0.6(0.61 1m）（二）空气除菌的原因空气除菌的原因 n1.空气中存在有大量的各种各样的微生物空气中存在有大量的各种各样的微生物 （工业设计中常以微生物浓度104个/m3作为空气的污染指标。）n2.空气中存在着润滑油、灰尘颗粒、水蒸汽等空气中存在着润滑油、灰尘颗粒、水蒸汽等。（由于深层发酵所用空气需一定压力，空气经压缩机压缩后，将夹带大量的油滴和水雾。如它们进入过滤介质的纤维间，将阻塞通道，甚至使过滤介质结块，完全丧失其除菌作用，所以要除去这些物质。） 二、空
47、气除菌的方法二、空气除菌的方法 n（一）工业发酵对空气质量的要求（一）工业发酵对空气质量的要求n随发酵产品和菌种不同而异：随发酵产品和菌种不同而异：n半固体制曲和酵母生产中无菌要求不十分严格无菌要求不十分严格，一般无需复杂的空气净化处理。n密闭的深层通气发酵需严格的严格的纯净培养，进入发酵罐前空气必须进行冷却、脱水、脱油和过滤除菌等处理（如氨基酸、抗生素等）。n同一工厂的不同生产区域（环节）有不同的同一工厂的不同生产区域（环节）有不同的空气无菌度的要求。空气无菌度的要求。（二）发酵对空气（二）发酵对空气无菌程度无菌程度的要求的要求 n好气性发酵过程中需要大量的无菌空气，空气要作到绝对无菌在目前
48、是不可能的，也是不经济的。n无菌空气：无菌空气：通过除菌处理使空气中含菌量降到零或者极通过除菌处理使空气中含菌量降到零或者极低从而使污染的可能性降至极小。低从而使污染的可能性降至极小。n发酵对无菌空气的要求：发酵对无菌空气的要求：无菌，无灰尘，无杂质，无水，无菌，无灰尘，无杂质，无水，无油，正压等几项指标。无油，正压等几项指标。n发酵对无菌空气的发酵对无菌空气的无菌程度无菌程度要求：要求：只要在发酵过程中不只要在发酵过程中不因无菌空气染菌，而造成损失即可。因无菌空气染菌，而造成损失即可。n一般按染菌率计算一般按染菌率计算，在工程设计中一般要求染菌率为，在工程设计中一般要求染菌率为1010-3-
49、3 即即10001000次发酵无菌空气使用周期中只允许一次染菌。次发酵无菌空气使用周期中只允许一次染菌。n一般空气无菌程度是用空气洁净度表示。一般空气无菌程度是用空气洁净度表示。n空气洁净度：空气洁净度：洁净环境中空气含尘量多洁净环境中空气含尘量多少的程度。少的程度。n空气洁净度的高低是用空气洁净度的高低是用空气洁净度级别空气洁净度级别来区分的。来区分的。n空气洁净度级别是用操作时间内空气的空气洁净度级别是用操作时间内空气的计数含尘量计数含尘量表示。表示。n环境空气的洁净程度：环境空气的洁净程度：p138（三）空气除菌的方法（三）空气除菌的方法（p141-146） n空气除菌：空气除菌：n就是
50、除去或杀死空气中的微生物。n常用的方法：常用的方法：n加热杀菌n辐射杀菌n静电除菌n过滤除菌 1、加热灭菌、加热灭菌n原理：原理：基于加热后微生物体内的蛋白（酶）热变性而得以实现。n热空气进入培养系统之前，一般均需用压缩机压缩，提高压力。n空气压缩后温度能达到200以上，保持一定时间后，便可实行干热杀菌。 空气热灭菌流程示意图空气热灭菌流程示意图1-空气压缩机空气压缩机 2-粗过滤器粗过滤器 3-保温管保温管 4-贮气罐贮气罐 5-保温罐保温罐 6-列管式冷却器列管式冷却器 7-涡轮压缩机涡轮压缩机 8-预热器预热器 9-粗过滤器粗过滤器 10-空气吸入塔空气吸入塔n利用空气压缩时所产生的热量
