1、高效液相色谱质谱高效液相色谱质谱（HPLC-MS）联用技术）联用技术HPLC-MS简称简称LC-MS HPLC-MS是近些年出现的联用仪器，发展非常是近些年出现的联用仪器，发展非常迅速，弥补了迅速，弥补了GC-MS只能测定挥发性或半挥发性物只能测定挥发性或半挥发性物质的不足，使色谱质谱联用技术得到了完善。质的不足，使色谱质谱联用技术得到了完善。 GC-MS由于接口技术技术难度相对较小，因此，由于接口技术技术难度相对较小，因此，开发使用较早，而开发使用较早，而HPLCMS接口技术技术难度较接口技术技术难度较大，开发使用较晚。大，开发使用较晚。 HPLC-MS所提供的信息与所提供的信息与GC-MS
2、相同（相同（TIC、MC、SIM、全扫描三维图等）。、全扫描三维图等）。一、概述一、概述 HPLC-MS的特点：的特点： MS作为作为LC的检测器不仅能得到色谱数据，如：峰保留时间、的检测器不仅能得到色谱数据，如：峰保留时间、峰高、峰面积等，同时亦可得到质谱信息。具体如下：峰高、峰面积等，同时亦可得到质谱信息。具体如下： 1、质谱为通用性检测器，可测定不带生色团或荧光基团的、质谱为通用性检测器，可测定不带生色团或荧光基团的化合物；化合物； 2、质谱也是选择性检测器，用选择离子检测可一次完成定、质谱也是选择性检测器，用选择离子检测可一次完成定性、定量分析，且灵敏度很高。性、定量分析，且灵敏度很高
3、。 3、提高鉴别化合物的可信度；可准确分析色谱峰的纯度；、提高鉴别化合物的可信度；可准确分析色谱峰的纯度；确定分子量。确定分子量。 4、可分析不适合、可分析不适合GC-MS分析的亲水性强、热不稳定及生分析的亲水性强、热不稳定及生物蛋白化合物。物蛋白化合物。 5、在线分析，免去了色谱组分的收集，减少样品损失，缩、在线分析，免去了色谱组分的收集，减少样品损失，缩短工作周期。短工作周期。 6、适用范围宽，正相、反相、离子对及手性色谱均可使用。、适用范围宽，正相、反相、离子对及手性色谱均可使用。 7、采用碰撞诱导解离技术、采用碰撞诱导解离技术(CID)以及多极质谱等可提供丰以及多极质谱等可提供丰富的化
4、合物结构信息。富的化合物结构信息。 由于由于HPLC目前的应用极其广泛，目前的应用极其广泛，特别是在我们药学专业应用更为普遍，特别是在我们药学专业应用更为普遍，所以所以LC-MS在使用上比在使用上比GC-MS有更有更高的使用价值。高的使用价值。 与与GC-MS基本相同，最大的不同是接口不同。基本相同，最大的不同是接口不同。 另外，另外，LC-MS一般用来分析挥发性差，热不稳一般用来分析挥发性差，热不稳定的样品，应用范围增大。定的样品，应用范围增大。 非极性化合物不能分析。（难以离子化）非极性化合物不能分析。（难以离子化）Vacuum SystemSample InletDetectorData
5、 SystemMass AnalyserIonisation MethodAtmosphere二、二、LC-MS的工作原理的工作原理1. 接口的重要性接口的重要性 接口是接口是HPLC与质量分析器之间的过渡装置并承与质量分析器之间的过渡装置并承担着离子化的任务。担着离子化的任务。 由于由于MS需在真空下操作，以便完成离子形成、需在真空下操作，以便完成离子形成、分离、检测的过程。但是分离、检测的过程。但是HPLC出口含有大量的流动出口含有大量的流动相（溶剂）（相（溶剂）（0.22mL/min）。）。大量的流动相不得进入大量的流动相不得进入MS ？HPLC的流动相处在高压下，液体气化成气体，的流动
6、相处在高压下，液体气化成气体，其膨胀系数约为其膨胀系数约为1000倍以上。倍以上。1mL流动相液体可气化流动相液体可气化成成1000mL气体。流动相的去除是接口的主要任务之气体。流动相的去除是接口的主要任务之一。一。不如不如GC-MS接口成熟，历史较短。接口成熟，历史较短。 三、三、LC-MS的接口的接口2. 接口的种类（离子化方法）接口的种类（离子化方法） 热喷雾热喷雾 快原子轰击（快原子轰击（FAB） 电喷雾电喷雾(API-EI、ESI) 大气压化学源大气压化学源(API-CI、APCI) 大气压光电离源大气压光电离源(APPI) 粒子束粒子束 电喷雾电喷雾电喷雾接口（电喷雾接口（）工作原
7、理）工作原理: 三个步骤：三个步骤：a、带电液滴的形成；、带电液滴的形成； b、溶剂、溶剂蒸发和液滴碎裂；蒸发和液滴碎裂；c、离子蒸发形成气态离子、离子蒸发形成气态离子a、带电液滴的形成、带电液滴的形成 色谱流出物经毛细管顶端喷出，形成扇状喷雾，色谱流出物经毛细管顶端喷出，形成扇状喷雾，再再38kV的高电场作用下，形成高度电离、含有溶剂的高电场作用下，形成高度电离、含有溶剂的试样微小液滴。的试样微小液滴。b、溶剂蒸发和液滴碎裂、溶剂蒸发和液滴碎裂 液滴与干燥气作用，在干燥气的作用下，溶剂蒸液滴与干燥气作用，在干燥气的作用下，溶剂蒸发，离子向液滴表面移动，造成液滴表面的离子密度发，离子向液滴表面
8、移动，造成液滴表面的离子密度越来越大，当达到越来越大，当达到Rayleigh限时，液滴表面电荷产生的限时，液滴表面电荷产生的排斥力与液滴表面的张力大致相等，液滴非均匀破裂，排斥力与液滴表面的张力大致相等，液滴非均匀破裂，分裂成更小的液滴，更小的液滴继续重复蒸发、电荷分裂成更小的液滴，更小的液滴继续重复蒸发、电荷过剩和液滴分裂的过程。过剩和液滴分裂的过程。电喷雾接口（电喷雾接口（）工作原理）工作原理:c、离子蒸发形成气态离子、离子蒸发形成气态离子 当液滴分裂至小于当液滴分裂至小于10nm时，其表面形成的电场足够时，其表面形成的电场足够强，电荷的排斥作用导致部分离子从液滴表面蒸发出来，强，电荷的排
9、斥作用导致部分离子从液滴表面蒸发出来，最终以单电荷或多电荷离子形式从液滴中转移至气相，最终以单电荷或多电荷离子形式从液滴中转移至气相，形成气相离子。形成气相离子。+-+-+-N2气流干燥气流干燥Charged Droplets电喷雾接口（电喷雾接口（ ）液滴变化示意图）液滴变化示意图: 从毛细管喷出从毛细管喷出（在（在38kV电场作用下）电场作用下）气态试样离子气态试样离子+-气态试样离子气态试样离子试样试样+Rayleigh限限700MSD与与DAD的比较的比较椰子油椰子油（椰子油）（椰子油）（三甘油）（三甘油）五、五、 HPLC-MS的灵敏度的灵敏度氨基甲酸盐氨基甲酸盐六、六、LC-MS联
10、用仪的真空联用仪的真空 电喷雾是一种电喷雾是一种“软软”电离技术，通常只形成准电离技术，通常只形成准分子离子，提供分子量信息。但是在实际工作中，分子离子，提供分子量信息。但是在实际工作中，特别是对未知化合物的分析，不仅需要分子量，而特别是对未知化合物的分析，不仅需要分子量，而且更需要尽可能多的化合物碎片信息。且更需要尽可能多的化合物碎片信息。 碰撞诱导解离（碰撞诱导解离（CID）可解决这一不足。）可解决这一不足。 这里所讲的这里所讲的CID是指是指“源内源内CID，In-Source CID”。七、七、 碰撞诱导解离（碰撞诱导解离（CID）技术）技术参见备注惰性气惰性气体体没有商业谱库缩氨酸缩
11、氨酸 （Tandem Mass Spectrometry） 由两个以上的质量分析器串联而成。由两个以上的质量分析器串联而成。 简称串联简称串联质谱。质谱。 常见的为：三级四极杆质谱常见的为：三级四极杆质谱1. 空间上的串联质谱（空间上的串联质谱（tandem-in-space）八、多极质谱（串联质谱）八、多极质谱（串联质谱）API4000三重四级杆质谱仪示意图三重四级杆质谱仪示意图CIDl单四极杆与串连四极杆质谱对比串联质谱基本功能：串联质谱基本功能： （各种扫描方式）（各种扫描方式）（1）Q1全扫描全扫描（2）母离子（）母离子（precursor ion）扫描）扫描 初始离子扫描初始离子扫描
12、（3）子离子（）子离子（Product Ion）扫描扫描（4）中性碎片丢失扫描）中性碎片丢失扫描 （5）多重反应监测）多重反应监测 （Multiple Reaction Monitoring MRM ）各种扫描方式的原理解释：各种扫描方式的原理解释：Q1 Full Scan (Start Stop)(Q1全扫描全扫描) Q1 always used as single MS analyzer Used primarily for ident. of precursor ionSIM - Selected Ion Monitoring(选择离子监测选择离子监测)Used to optimize
13、analyzer for specific ionsSIM used for quantitative analysesQ1 SIM used to “optimize” precursor ion Maximize signal in preparation for MS/MS选择离子监测：选择离子监测： SIM用于检测已知或目标化合物，比全扫用于检测已知或目标化合物，比全扫描方式能得到更高的灵敏度。这种数据采集描方式能得到更高的灵敏度。这种数据采集的方式一般用于定量。的方式一般用于定量。 若几种目标化合物用同样的数据采集方式若几种目标化合物用同样的数据采集方式监测，那么可以同时测定几种离子
14、监测，那么可以同时测定几种离子.Precursor Ion Scan(母离子扫描母离子扫描) Q1 sweeps a given mass range, Q3 is fixed Used to determine the “origin” of particular product ion(s) created in the collision cell Frequently used for drug metabolite identification (common product ion observed in the metabolites)m3+ fixedm1+ scannedEx
15、ample of Precursor Ion Spectrum600900120015001800m/z, amu5 8 7 .57 4 5 .68 9 5 .68 0 2 .46 3 3 .4520.31105.01704.4600900120015001800m/z, amu3.0e66.0e69.0e61.2e7Intensity, cps6 0 8 .3520.3802.4600900120015001800m/z, amu3.0e46.0e49.0e4Intensity, cpsPrecursors ion of 86 Q1 Scan745.6母离子扫描的作用母离子扫描的作用 母离子
16、分析可用来鉴定和确认类型已知的母离子分析可用来鉴定和确认类型已知的化合物，尽管它们的母离子的质量可以不同，化合物，尽管它们的母离子的质量可以不同，但在分裂过程中会生成共同的子离子，这种扫但在分裂过程中会生成共同的子离子，这种扫描功能在药物代谢研究中十分重要。描功能在药物代谢研究中十分重要。 Product Ion Scan(子离子扫描子离子扫描)-After identification, the precursor ion is sent into the collision cell and fragmented by CID-Q1 is fixed, Q3 sweeps a given
17、mass range-Used for structural elucidation（结构确认）（结构确认）-First step to developing quantitative methodm3+ scannedm1+ fixedExample of Product Ion SpectrumHNCH3OHCH3Ephedrine（麻黄碱）（麻黄碱）, MW = 165M+1中性丢失扫描中性丢失扫描 中性丢失扫描分析可用来鉴定和确认中性丢失扫描分析可用来鉴定和确认类型已知的化合物，也可以帮助进行未知类型已知的化合物，也可以帮助进行未知物结构判断。物结构判断。 例如：例如：18-H2O，2
18、8-CO，30-HCOH，32-CH3OH，44-CO2等等。等等。Multiple Reaction Monitoring (MRM)多重反应监测多重反应监测Precursor ion fixedProduct ion fixedFragmentation(CID) Many precursor to product ion pairs can be monitored (A-B, A-B, etc.) MRM is the best way to maximize signal intensity of product ions MRM used primarily for quantit
19、ationMRM for Quantitation ?Retention TimeIntensityRetention Time IntensityPrecursor ion fixedProduct ion fixedFragmentation(CAD)Increased Sensitivity & Specificity串联质谱可将复杂质谱简化。串联质谱可将复杂质谱简化。灵敏度、针对性、选择性更强灵敏度、针对性、选择性更强 三级四极杆质谱外观图三级四极杆质谱外观图2. 时间上的串联质谱（时间上的串联质谱（tandem-in-time） 只有一个质量分析器，离子阱或傅立叶变换离子只有一个质量分析器，离子阱或傅立叶变换离子回旋共振（回旋共振（FT ICR）质谱可实现这种串联技术。）质谱可实现这种串联技术。离子阱工作原理离子阱工作原理离子阱技术离子阱技术
