1、第三章 PCR引物设计研究领域：基因克隆、测序、重组疾病诊断法医鉴定亲子鉴定古生物学研究PCR技术的应用技术的应用PCR及其衍生技术及其衍生技术兼并引物PCRRACE反向PCR（IP-CR）差异展示PCR(DD-PCR)多重PCRTD-PCRPCR-SSCPNet-PCRIC-PCRHotstart PCR SPAwRAPDwReal time PCRwLD-PCRwTall-PCRwMarathon PCRw原位PCRwRT-PCRw不对称PCRwOverlapping PCRw.PCR原理w 高温变性w 低温退火w 适温延伸理论上，只要知道任何一段模板序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引
2、物，用 PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。 PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。引物是PCR特异性反应的关键。PCR引物 是人工合成的两段寡核苷酸。一个与感兴趣区域一端的一条DNA模板链互补，另一个与感兴趣区域另一端的另一条DNA模板链互补。 1、引物设计的原则、引物设计的原则引物要跟模板紧密结合；引物与引物之间不能有稳定的二聚体或发夹结构存在；引物不能在别的非目的位点引起高效DNA聚合反应(即错配)。引物设计引物设计需要考虑的因素需要考虑的因素引物长度（primer length）产物长度（product length）序列Tm值 (melting temperature
3、)G值 (internal stability) 引物二聚体及发夹结构（duplex formation and hairpin）错误引发位点（false priming site）引物及产物GC含量（composition）有时还要对引物进行修饰，如增加限制酶切点，引进突变等。引物设计引物设计要点要点（1 1） 一般，引物的长度引物的长度为16-23bp，常用的长度为18-21bp。 PCR产物长度 500bp 引物长度 16 18 bp PCR产物长度 5kb 引物长度 25bp PCR纪录： 23bp长度引物 扩增出 40kb产物引物设计引物设计要点要点（2 2）引物引物3 3 端的碱基
4、一般不用端的碱基一般不用A A，因为A在错误引发位点的引发效率相对比较高，而其它三种碱基的错误引发效率相对小一些。3端防止连续三个C或G引物的GCGC含量一般为含量一般为45-55%45-55%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的上下游引物的GCGC含量不能相差含量不能相差太大太大。引物设计引物设计要点要点（3 3）引物的TmTm值值。过高（72）或过低（2222度），则容易造成退火时引物度），则容易造成退火时引物- -模板和模模板和模板板- -模板火之间的竞争。模板火之间的竞争。 结果输出方面，只能以图文格式打印，无法转成文本格式结果输出方面，只能以图文格式打印，无法转成文本格式htt
5、p:/218.242.234.226/wanshan/wlzy.htm解压密码：在Win.ini中把vspace=DU改为vspace=PU便可以使用全部功能Oligo 6.71使用技巧简介功能 在专门的引物设计软件中，“Oligo”是最著名的。它的使用并不十分复杂，但初学者容易被其复杂的图表吓倒。其初始界面有3个图：Tm图、G图和Frq图（其中Frq是6.22版本的新功能，为邻近6至7个碱基组成的亚单位在一个指定数据库文件中的出现频率。该频率高则可增加错误引发的可能性）。“Oligo”的功能比“Premier”还要单一，就是引物设计。但它的引物分析功能如此强大以至于能风靡全世界。使用使用Ol
6、igo 6.71的启动界面如下： G值反映了序列与模板的结合强度，最好引值反映了序列与模板的结合强度，最好引物的物的G值在值在5 端和中间值比较高，而在端和中间值比较高，而在3 端相端相对低。对低。 Tm值曲线以选取值曲线以选取72附近为佳，附近为佳，5 到到3 的下的下降形状也有利于引物引发聚合反应。降形状也有利于引物引发聚合反应。 Frq是邻近是邻近6至至7个碱基组成的亚单位在一个指个碱基组成的亚单位在一个指定数据库文件中的出现频率。定数据库文件中的出现频率。Frq曲线揭示了序曲线揭示了序列片段存在的重复机率大小。该频率高则增加错列片段存在的重复机率大小。该频率高则增加错误引发的可能性。误
7、引发的可能性。 选取引物时，宜选用选取引物时，宜选用3 端端Frq值相对较低的片段。值相对较低的片段。 在设计时，可依据图上三种指标的信息选取序列，如果觉得合适，可点击Tm图块上左下角的Upper按钮 ，选好上游引物，此时该按钮变成 ，表示上游引物已选取好。下游引物的选取步骤基本同上，只是按钮变成Lower。当上下游引物全选好以后，需要对引物进行评价。当上下游引物全选好以后，需要对引物进行评价。首先首先，检查引物二聚体尤其是，检查引物二聚体尤其是3 端二聚体形成的可能性。端二聚体形成的可能性。第二项第二项检查是发夹结构（检查是发夹结构（hairpin）。一般来说，能值以不超过）。一般来说，能值
8、以不超过4.5为好。为好。第三项第三项检查为检查为GC含量和含量和Tm，以，以45-55为宜，并且应尽量使上下游引物的为宜，并且应尽量使上下游引物的GC含量以及含量以及Tm值保持接近。值保持接近。 如果PCR的模板不是基因组DNA，而是一个特定模板序列，那么最好还进行False priming site的检测。这项检查可以看出引物在非目的位点引发PCR反应的可能性。如果引物在错配位点的引发效率比较高，就可能出假阳性的PCR结果。一般在错配引发效率以不超过100为好，但对于特定的模板序列，还应结合比较其在正确位点的引发效率。如果两者相差很大，比如在正确位点的引发效率为450以上，而在错误位点的引发效率为130，那么这对引物也是可以接受的。 当我们结束以上四项检测，按当我们结束以上四项检测，按Alt+P键弹出键弹出PCR窗口，其中总结性地显示该引窗口，其中总结性地显示该引物的位置、产物大小、物的位置、产物大小、Tm值等参数，最有用的是还给出了推荐的最佳退火温度和值等参数，最有用的是还给出了推荐的最佳退火温度和简单的评价。简单的评价。http:/ DNAClubDNAMANhttp:/www.basic.nwu.edu/biotools/oligocalc.html
