1、实时荧光定量实时荧光定量PCR技术技术与普通与普通PCR的区别（一）的区别（一）v普通普通PCR技术：技术： 在在PCR结束后对结束后对终点产物终点产物进行定量分析。进行定量分析。v实时定量实时定量PCR技术：技术：实时检测实时检测PCR扩增，在扩增的扩增，在扩增的指数期指数期对对起始模板进行定量。起始模板进行定量。起始定量与终点定量起始定量与终点定量起始起始DNA量是量是“天然天然”的量，更有意义；终的量，更有意义；终点点DNA量是经过量是经过PCR“加工加工”，存在部分失真，存在部分失真起点定量重现性好；终点定量误差大起点定量重现性好；终点定量误差大由于由于PCRPCR扩增效率的差异使得相
2、同扩增效率的差异使得相同的样品扩增结果存在很大的差异的样品扩增结果存在很大的差异相同模板进行相同模板进行9696次扩增的扩增曲线图次扩增的扩增曲线图与普通与普通PCR的区别（二）的区别（二）荧光实时定量PCR定量原理vPCR每进行1个循环，DNA呈2倍的指数关系增长，不久达到平台期。起始DNA量越多扩增产物量便越早达到检出值，也就是扩增曲线越早起峰。我们将已知浓度的标准品梯度稀释进行Real Time PCR，就会按照起始DNA量由多到少得顺序等间隔得到一系列扩增曲线。再由Ct值与起始模板的对数值之间存在的线性关系，就可以制作成下图标示的标准曲线。未知浓度的样品与标准品相同，检测未知样品CT值
3、，并将其代人标准曲线，就可以求出未知浓度样品的起始模板量，这就是Real Time PCR的定量原理。在实时荧光定量在实时荧光定量 PCR 反应中，引入了一种荧光化反应中，引入了一种荧光化学物质，随着学物质，随着 PCR 反应的进行，反应的进行， PCR 反应产物不反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线荧光扩增曲线 实时荧光实时荧光扩增曲线图扩增曲线
4、图扩增曲线的描述vPCR的扩增曲线实际上并不是一条标准的指数曲线，而是S形曲线。这是因为随着PCR循环数的增加，DNA聚合酶的失活，dNTP和引物的枯竭，反应副产物焦磷酸对合成反应的阻害等原因，致使PCR并非一直呈指数扩增，而最终将进入平台期。荧光扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段荧光扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段 , 荧光信号指数扩荧光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信增阶段和平台期。在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，无法判断产物量的变化。而在平台期，扩增产物已不再呈指号所掩盖，无法判断产物量的变化。而在平台期，
5、扩增产物已不再呈指数级的增加，数级的增加，PCR 的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的根据最终的 PCR 产物量不能计算出起始产物量不能计算出起始 DNA 拷贝数。只有在荧光信拷贝数。只有在荧光信号指数扩增阶段，号指数扩增阶段， PCR 产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，因此应选择这个阶段进行定量分析。系，因此应选择这个阶段进行定量分析。 几个定义几个定义线性基线期为扩展最初的线性基线期为扩展最初的1015个循环，此时，个循环，此时，PCR反应处于起始阶段，扩增产物很少，所产生反应处
6、于起始阶段，扩增产物很少，所产生的荧光信号很低。的荧光信号很低。什么是荧光域值（什么是荧光域值（threshold）PCR反应的前反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准差的个循环的荧光信号的标准差的10倍倍，即：，即： threshold = 10 SDcycle 3-15 几个定义几个定义什么是什么是 Ct 值值 C代表代表Cycle，t代表代表thresholdCt值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。
7、有实验证明所经历的循环数。有实验证明Ct值大小与样本中的原始拷贝值大小与样本中的原始拷贝数成反比关系。数成反比关系。Ct值是实时荧光值是实时荧光PCR的主要定量参数的主要定量参数几个定义几个定义C(t) value 定量的分类v绝对定量方法绝对定量方法：绝对定量方法相对简单。绝对定量是使用已知浓度的标准品制作标准曲线，对未知浓度的样本进行绝对量（拷贝数）测定的方法。v相对定量方法相对定量方法：相对定量方法相对复杂，一般用于基因表达解释。首先应分别测定目的基因和参比基因的量，再求出对应参比基因的目的基因的相对量，最后再进行样品间相对量的比较。Ct值与起始模板的关系值与起始模板的关系 每个模板的每
8、个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系系，起始拷贝数越多，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中纵坐标代表起始拷贝数的对数，准品可作出标准曲线，其中纵坐标代表起始拷贝数的对数，横坐标代表横坐标代表Ct值。因此，只要获得未知样品的值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。每一扩增周期后产物的量可以用下式表示每一扩增周期后产物的量可以用下式表示定量定量PCR的数学原理的数学原理y=x(1+e)ny：产
9、物分子数：产物分子数 x：起始分子数：起始分子数e：扩增效率：扩增效率 n：循环次数：循环次数 在扩增产物到达阈值线时：在扩增产物到达阈值线时： Xct=X0(1+Ex)Ct=Y （1）XctXct：荧光扩增信号到达阈值信号强度时扩增产物的：荧光扩增信号到达阈值信号强度时扩增产物的量，在阈值线设定以后，它是一个常数，设为量，在阈值线设定以后，它是一个常数，设为Y Y。方程式（方程式（1）两边同时取对数得：）两边同时取对数得： Y= X0(1+Ex)Ct （2）整理方程（整理方程（2）得：）得： X0=(1+Ex) * *Ct+Y （3）最后结论最后结论： X0与与Ct呈线性关系，根据样品设置的
10、呈线性关系，根据样品设置的Ct值就可计算出样品中所含的模板量。值就可计算出样品中所含的模板量。 I I二、荧光定量二、荧光定量PCR标记检测类型标记检测类型SYBR GREEN Iv荧光嵌合法通常使用SYBR Green I。SYBR Green I是一种能够结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。它与PCR合成的双链DNA结合，在激发光照射下产生荧光，荧光染料结合到双链DNA后荧光信号增加1000倍，通过荧光强度的检测，可以实时监测PCR扩增的产物量。荧光嵌合检测法原理荧光嵌合检测法原理融解曲线：融解曲线：采用采用SYBR GREEN I荧光嵌合法检测时，可以荧光嵌合法检
11、测时，可以通过融解曲线分通过融解曲线分析，确认析，确认PCR反应的特异性反应的特异性。溶解曲线分析是在。溶解曲线分析是在PCR反应结束反应结束后，将后，将PCR反应液的温度渐渐升高，实时监测反应液的温度渐渐升高，实时监测SYBR GREEN I的荧光信号强度变化进行的。起初由于的荧光信号强度变化进行的。起初由于PCR扩增产物呈双链，扩增产物呈双链，具有较高的荧光信号强度，随着温度的渐渐升高，具有较高的荧光信号强度，随着温度的渐渐升高，DNA双链渐双链渐渐打开，嵌入渐打开，嵌入DNA中的中的SYBR GREEN I数量减少，荧光信号强数量减少，荧光信号强度就渐渐降低，当双链度就渐渐降低，当双链D
12、NA解链一半时，荧光信号强度急剧下解链一半时，荧光信号强度急剧下降，此时的降，此时的温度即融解温度（温度即融解温度（TM值），值），TM值与值与PCR扩增产物扩增产物的序列有关，对于的序列有关，对于某一某一PCR扩增产物，其值是固定的扩增产物，其值是固定的。融解曲线的分析融解曲线的分析v理想的融解曲线应该只有单一峰型曲线理想的融解曲线应该只有单一峰型曲线。v如果出现如果出现两个或以上的峰型两个或以上的峰型，说明有引物二聚体等非特异性扩增产生，说明有引物二聚体等非特异性扩增产生，需要对反应条件进行优化或重新设计引物。需要对反应条件进行优化或重新设计引物。v优点：成本较低，无须对引物或探针进行特殊
13、的优点：成本较低，无须对引物或探针进行特殊的荧光标记，操作亦比较简单荧光标记，操作亦比较简单 ，适合于筛检。，适合于筛检。v缺点：特异性不够，染料分子会结合到非特异性缺点：特异性不够，染料分子会结合到非特异性扩增产生的双链分子和引物二聚体中，使反应体扩增产生的双链分子和引物二聚体中，使反应体系中的荧光本底较高系中的荧光本底较高 I I实时荧光PCR的理论基础v荧光共振能量转移（FRET）：当一个荧光基团与一个荧光淬灭基团（可以淬灭前者的发射光谱）的距离邻近至一定范围时，就会发生荧光能量转移，淬灭基因会吸收荧光基团在激发光作用下的激发荧光，从而使其发不出荧光。但如果荧光基团一旦与淬灭基团分开，淬
14、灭作用即会消失。所以，利用核酸杂交和核酸水解所致荧光基团和淬灭基团结合或分开的原理，建立各种实时荧光PCR。TAQMAN PROBE法vTaqMan Probe法是使用5端带有荧光物质（如：FAM等），3端带有淬灭物质（如：TAMRA等）的TaqMan探针进行荧光检测的方法。当探针完整时，5端的荧光物质受到3端的淬灭物质的制约，不能检出荧光。而当TaqMan探针被分解后，5端的荧光物质便会游离出来，发出荧光。v当PCR反应液中加入荧光探针后，在PCR反应的退火过程中，荧光探针便会和模板杂交，进一步在PCR反应的延伸过程中，DNA聚合酶的53核酸外切酶活性可以分解与模板杂交的荧光探针，游离荧光物
15、质发出荧光，通过检测反应体系中的荧光强度，可以达到检测PCR产物扩增量的目的，具体原理如下图：TaqMan Probe法原理法原理TAQMAN探针v水解型水解型1.荧光素，淬灭剂荧光素，淬灭剂2.FRET（荧光共振能量传递）（荧光共振能量传递）3.识别特异性产物识别特异性产物v优点优点对目标序列特异性高对目标序列特异性高v缺点缺点1.只适用于一个目标（特异序列）只适用于一个目标（特异序列）2.价格较高（价格较高（1000-2000元）元）3.探针探针5端不能是端不能是G（切下后淬灭）（切下后淬灭）荧光化学监测方式总结荧光化学监测方式总结化学试剂化学试剂工作原理工作原理有否淬灭剂有否淬灭剂主要应
16、用范围主要应用范围SYBR Green I结合于双链结合于双链DNADNA的小的小沟中沟中否否熔解曲线分析熔解曲线分析定量和检测目标基因定量和检测目标基因TaqMan水解型杂交探针（水解型杂交探针（5-35-3外切）外切）有有SNPSNP分析分析定量和检测目标基因定量和检测目标基因TAQMAN MGB 探针法原理探针法原理v在TaqMan探针的基础上，进一步发展了MGB探针。在它的3端连接的不是通常的TAMRA淬灭基团，而是一种非荧光淬灭剂（NFQ），其3还有一种小沟结合分子，即MGB探针，该分子折叠进入dsDNA小沟，从而使探针和模板紧紧结合。vMGB探针在检测SNP和定量分析甲基化等位基因
17、方面具有优势。TAQMAN MGB 探针法vTaqMan MGB 探针能分辨一个碱基的差别TAQMAN MGB 探针法原理图示探针法原理图示v优点：优点：v1.NFQ为非荧光基团，大大降低测定中荧光的本底值，有为非荧光基团，大大降低测定中荧光的本底值，有提提高了淬灭效率高了淬灭效率。v2.MGB结合在探针与靶基因杂交形成的双螺旋的小沟中，促结合在探针与靶基因杂交形成的双螺旋的小沟中，促进探针与靶基因杂交的进探针与靶基因杂交的稳定性和特异性稳定性和特异性，又使，又使探针的探针的Tm值值大大提高大大提高，从而使杂交温度的选择余地更大。，从而使杂交温度的选择余地更大。v缺点：缺点：v1.合成合成Ta
18、qMan探针探针价格昂贵价格昂贵。（一条探针约。（一条探针约30005000元元）v2.中国地区仅有基康生物公司（中国地区仅有基康生物公司（ABI）提供合成服务，）提供合成服务，合成合成时间长时间长，周期需要，周期需要12个月个月.与与TaqMan探针相比，探针相比，MGB探针长度更短，淬灭效率更高。探针长度更短，淬灭效率更高。案例分析v1.应用SYBR Green I 荧光实时定量PCR检测成蚊携带的登革病毒。v2. 应用TaqMan探针技术进行探针技术进行SNP分析分析应用SYBR GREEN I 荧光实时定量PCR检测成蚊携带的登革病毒。v1.对成蚊与标准品进行前处理，提取RNAv2.将
19、成蚊样品与标准品的RNA逆转录成CDNAv3.使用一系列稀释的已知浓度的标准品CDNA作为模板，通过SYBR Green I 荧光定量PCR进行扩增，绘制标准曲线。v4.以成蚊样品的CDNA为模板，应用荧光PCR检测其Ct值。SYBR GREEN I荧光PCR实验材料：1.一对特异性引物（1530bp）（约4060元）2. SYBR Premix EX Taq II 试剂盒（mix）（大连宝生物价格：1700元，50ul规格200次反应）3.CDNA模板（标准品，成蚊样品）X0=(1+Ex) *Ct+YTAQMAN探针技术进行探针技术进行SNP分析分析vSNP（单核苷酸多态性）（单核苷酸多态性
20、）1.人类基因组中的单碱基突变人类基因组中的单碱基突变2.大约大约93%的基因至少含有一个的基因至少含有一个SNPvSNP分型的意义分型的意义1.可能引起疾病或疾病的易感性可能引起疾病或疾病的易感性2.作为基因缺陷型疾病的标志物作为基因缺陷型疾病的标志物3.SNP的漂变可作为进化研究手段的漂变可作为进化研究手段4.药物的抗药性研究药物的抗药性研究CYP2D6v细胞色素细胞色素P450酶家族成员酶家族成员v负责大约负责大约20普通药物代谢普通药物代谢v在人类中该基因序列变异较多在人类中该基因序列变异较多TAQMAN荧光PCR实验材料：1.一对特异性引物（1530bp）2.两条荧光探针（每条探针，2OD,约10002000元）2. Premix EX Taq 试剂盒（mix）（大连宝生物价格：2000元，50ul规格200次反应）3.CDNA模板实验设计实验设计v基因型基因型1.(G/G)（正常）正常）2.(G/A)（正常）正常）3.(A/A)（异常）异常）FRFQCVQTAFQCVQTForward primerReverse primerAllele-specific probeAllele-specific probeFRG实验结果实验结果VICFAMFAMVICVICFAM(A/A)(G/A)(G/G)结果显示结果显示v终点分析
