1、1疫苗注册检验及质控方法要点李长贵中国食品药品检定研究院2013-9-25, 吉林 长春*注册检验的内容及流程注册检验的内容及流程2生产工艺审查：生产工艺审查：“制造及检定规程制造及检定规程”是否符合基本要求是否符合基本要求 生产及检定记录：是否符合制造及生产及检定记录：是否符合制造及检定规程的描述检定规程的描述 制品原液、半成品、成品的检验项制品原液、半成品、成品的检验项目、方法、结果是否符合国家药品标目、方法、结果是否符合国家药品标准及企业标准的规定准及企业标准的规定 制品包装、标签、使用说明书是否制品包装、标签、使用说明书是否符合相关规定符合相关规定国产疫苗注册进口疫苗注册生产工艺审查：
2、是否符合基本要求生产工艺审查：是否符合基本要求 制品原液、半成品、成品的检验项制品原液、半成品、成品的检验项目及方法是否符合我国药典标准目及方法是否符合我国药典标准 新的检测方法是否合理，是否有方新的检测方法是否合理，是否有方法学验证数据法学验证数据按照企业注册标准检验，出具报告书按照企业注册标准检验，出具报告书出具复核意见：出具复核意见： 1. 质量标准（安全性、有效性）质量标准（安全性、有效性） 2. 检测方法的科学性，是否需要改进检测方法的科学性，是否需要改进 3. 其它问题其它问题出具专家意见，补充资料和检验试出具专家意见，补充资料和检验试剂、参考品等材料，样品进口剂、参考品等材料，样
3、品进口修订进口注册标准，及修订依据修订进口注册标准，及修订依据按照修订的进口注册标准检验按照修订的进口注册标准检验出具报告及复核意见出具报告及复核意见 *注册检验类型注册检验类型v新产品注册v工艺变更 核对新工艺（对应检测方法和指标） 质量标准变化v其它变更：规格，包装材料 一般不涉及标准和方法的变化v再注册（进口制品） 工艺、方法、标准无变化时，只进行核档v标准提高3*原液抽样检测原则原液抽样检测原则作为成品检测的补充： 1.在成品中不检测 裂解剂等工艺中间步骤（灭活、纯化疫苗等） 制品的纯度、定性等（重组蛋白等） 2.在成品中无法检测： 联合疫苗（多价疫苗？） 佐剂疫苗（残余DNA、内毒素
4、、宿主蛋白等） 根据以上原则，可以进行部分项目的检测4*5检定项目的设置及其意义检定项目的设置及其意义v检定的意义在于保证制品的： 安全性制品自身：如减毒活疫苗的神经毒力 工艺引进：流感疫苗的裂解剂，抗生素 工艺残留：制品残留，外部污染 后期添加：防腐剂，稳定剂 有效性制品的确认（鉴别试验，重组蛋白分子结构） 含量的测定（效力试验） 稳定性或一致性： 上述检测结果的分析(正确的指标，如活性比) 各级/项检测标准的区间*6生物制品生产中检定项目的设置生物制品生产中检定项目的设置v包括： 1.起始原材料：毒种，细胞，佐剂，其它添加物质 2.生产过程：收获，纯化/提取，裂解等重要工艺过程 3.关键节
5、点：原液、半成品、成品v紧紧围绕着制品本身的属性(类型、使用途径及目的)、控制节点，达到保证制品的质量的目的*7以流感疫苗生产为例以流感疫苗生产为例鸡胚(911日龄)流感病毒工作种子批病毒接种鸡胚尿囊腔，培养4872小时病毒收获（尿囊液）单型病毒收获液合并病毒灭活病毒超滤浓缩鉴别，病毒滴度，血凝滴度，无菌，支原体内毒素，血凝滴度病毒灭活验证*8以流感疫苗生产为例以流感疫苗生产为例病毒液层析纯化病毒裂解，超滤再纯化除菌过滤单价病毒原液三价半成品成品硫柳汞血凝素含量，无菌鉴别，裂解剂残留，无菌鉴别，血凝素，无菌，pH装量，硫柳汞，卵清蛋白，内毒素，残留甲醛，总蛋白异常毒性，外观*9检测方法的类型检
6、测方法的类型 v 效力试验v 鉴别试验v 安全性测定 1.异常毒性，无菌 2.理化测定：灭活，纯化、裂解剂等 3.宿主残留（蛋白、DNA，BSA） 4.工艺污染:内毒素v 装量，pH，外观、渗透压等一般项目*10疫苗的类型与效力试验考虑要点疫苗的类型与效力试验考虑要点v 减毒活疫苗：OPV,MMR, JE,VZV 等 计算病毒数量（CFU, PFU, CCID50）,其效力可以预期临床使用效果（前提？）v 蛋白或多糖（提取、重组类）疫苗：HBV, HPV,流脑多糖 抗原性，免疫原性: 定性明确，结构稳定 体内试验（或由体内向体外方法过渡）v 灭活病毒疫苗（包括裂解、纯化） 体内方法：狂犬疫苗（
7、保护性抗原不明确） 体外方法：流感疫苗（保护性抗原明确）*11体内攻击模型法体内攻击模型法体内功能性抗体检测体内功能性抗体检测体外免疫学方法检测体外免疫学方法检测体外分析（理化）方法体外分析（理化）方法与临床效果的相关性与临床效果的相关性一致性更加明显一致性更加明显各类效力试验方法的意义比较*12以HPV 疫苗效力试验为例v Merck疫苗：体外方法 夹心ELISA方法测定抗原含量，其中第二个抗体针对中和表位v GSK疫苗：简化的体内方法 疫苗及参考品稀释后，采用单一剂量免疫小鼠，以间接ELISA法测定抗体滴度，计算疫苗和参考品的比值v 国产疫苗：体内方法 疫苗系列稀释后免疫小鼠，每组10只鼠
8、，采血测定假病毒中和抗体，计算半数感染剂量（ED50法）完全的体外方法完全的体外方法简单的体内法，简单的体内法，抗体为非功能性抗体为非功能性完整的体内法，完整的体内法，抗体为功能性抗体为功能性*13体内方法和体外方法的比较体内方法和体外方法的比较优点缺点体内法可以发现潜在的抗原完整性的变化，尤其是当进行攻击试验或测定功能性抗体的情况下1.变异大（试验有效的比例较低）2.试验周期长（数周或数月）3.费用高4.不符合3R原则（replacement, reduction, refinement）体外法1.变异小2.试验周期短（数小时或数天）3.费用较低4.符合3R原则1.制品原因，可能无法建立，或
9、与体内法一致性差2.可能无法区分抗原完整性的微小差异。*14体内效力试验的局限性体内效力试验的局限性v 不同动物种属（品系）免疫应答不同：采用攻击模型难以预期保护效果v 商业化疫苗的质量保证： GMP 经过验证的生产工艺 中间过程控制和放行检测v 批签发中的效力试验用于： 确认生产过程的一致性 确保商业化的批次与临床试验批次无差异，后者经过临床 试验证明其安全性及有效性*15效力试验的策略v在制品的研发阶段采用体内和体外两种方法 ： 建立疫苗抗原性和稳定性的数据 建立体内和体外方法的相关性 确认体外方法监测疫苗稳定性的适用性v上市后的效力试验常规放行检测采用体外方法常规稳定性监测： 若可行（前
10、期验证）采用体外方法 经常进行体内方法以保持技术熟练验证工艺的重大变更采用体内和体外两种方法 *16流感疫苗血凝素检测方法单向免疫扩散(SRID) 依赖于WHO提供的：抗原参考品抗血清参考品根据每年流行毒株的变化制备相应的参考品问题：在流感疫苗的检定中，为何采用这样一个古老的方法？*17体内效力试验选择合适的免疫程序v 免疫针次优选单剂次免疫，多剂次免疫应有足够的理由v 疫苗的剂量免疫应答应当落在剂量效应范围内v 剂量效应曲线应当通过多次试验确认v 证明检测的敏感性应能够发现制品的降解及效力下降（重要） 如某个制品，免疫动物后测定阳转率，不同剂量同一标准*18多价疫苗中的剂量效应曲线对所有抗原
11、的剂量效应范围为0.1 g 0.5g*19效力试验标准效期内下降值效期内下降值生产时目标生产时目标*疫苗注册中发现的问题举例疫苗注册中发现的问题举例v国产联苗注册 麻疹风疹腮-水痘四联苗：在水痘滴定中，采用人二倍体细胞，但麻疹、风疹及腮腺炎病毒均可以在人二倍体细胞上生长，应当有方法学验证，证明无干扰v国产HPV疫苗效力试验： 采用ED50方法，建立了标准，例如ED50小于0.1g， 但没有参考疫苗，方法无法准确评估v进口HPV疫苗变更注册 提出变更申请，将体内方法变为体外方法，提供了验证 资料，但该佐剂疫苗无明显的解吸附过程，样品及参考疫苗解吸附不充分，建议维持原体内法20*疫苗注册中发现的问
12、题v 三批制品的定义： 从原材料开始，还是仅为配制阶段v 制品的均一性：小量生产，均一性 BSA检测，鉴别试验v 原液送样过程中污染v 菌毒种来源是否合法（前期合同检验）v 规程描述不清楚，省略关键环节21*22参考品v参考品是检测方法，尤其是疫苗中的效力试验的重要组成部分v参考品作用： 1.建立每次试验是否有效的标准（内控） 如减毒活疫苗的参考品，每次检测在标识值2SD范围内，试验有效，样品测定结果准确。 2.用于校正疫苗中活性单位 如流感疫苗的血凝素含量参考品，以单向免疫扩散试验，建立标准曲线，测定疫苗样品中抗原含量*23参考品的建立v需要考虑的因素1.用途：方法评价&质控/一般试验/效力
13、试验2.使用范围：一个单位全国国际3.标定方法：根据用途、使用范围而定4.溯源：v制备要求1.与样品关系2.分装与保存3.标定：是否协作研究参考品的制备需要全面考虑上述因素，制订合理的策略该简单的就简单，该复杂的就复杂*24举例1：卵清蛋白标准品的建立*25主要用途和思路主要用途和思路二、制备策略二、制备策略1.1.以国外试剂盒进行标定，从而与以往结果一致以国外试剂盒进行标定，从而与以往结果一致2.2.对卵清蛋白进行筛选对卵清蛋白进行筛选3.3.制备不同浓度系列，方便使用制备不同浓度系列，方便使用4.4.对保护剂进行筛选和考核对保护剂进行筛选和考核5.5.以国外试剂盒进行协作标定以国外试剂盒进
14、行协作标定不需要申报国家参考品，液体分装，不需要分装精密性，不需要长期稳定性考核一、用途：一、用途：用于评价国产卵清蛋白试剂盒，以取代国外试剂盒用于评价国产卵清蛋白试剂盒，以取代国外试剂盒*26原材料初筛结果序号序号品牌品牌/级别级别/纯度纯度/来源来源配制配制浓度浓度进口试剂进口试剂复核复核Lowry法法复核复核1 1Sigma G1mg/ml1mg/ml1.1831.1830.88310.88312 2Sigma G98%1mg/ml1mg/ml1.3671.3670.93890.93893 3Sigma G1mg/ml1mg/ml1.2241.2240.885320.885324 4Si
15、gma G 99%1mg/ml1mg/ml1.5081.5081.018621.01862*27 稀释液稀释参考品稳定性示意图00.511.522.52512.56.253.131.56卵清蛋白含量（ng/ml）O.D4373天377天*28卵清蛋白国家定量参考品协作标定结果系列参考品理论值(ng/ml)实验室内参考品标示值实验室1(n=8)实验室2(n=8)实验室3(n=8)均值CV(%)均值CV(%)均值CV(%)均值CV(%)1517.60118.02419.10617.96 31011.67612.20712.89212.25656.41116.6757.2956.7982.53.04
16、73.0633.2333.115*29标定结论标定结论 经标定，系列参考品标示经标定，系列参考品标示量分别为：量分别为：S1：17.96 ng/ml（95%CI:16.9618.96）S2：12.25 ng/ml（95%CI:10.7413.76） S3：6.79 ng/ml（95%CI:5.657.93） S4：3.11ng/ml（95%CI:2.803.42） *30对天坛试剂验证结果参考品准确度精密度编号标示量测量值回收率%CV%S117.96117.09954S212.251.5112.09993S36.791.146.09902S43.110.312.84915相关系数r20.997
17、1单位：单位：(ng/ml)*31对天坛试剂热稳定性验证结果参考品准确度精密度编号标示量测量值回收率%CV%S117.96116.99953S212.251.5112.08993S36.791.146.24925S43.110.312.94953相关系数r20.9967单位：单位：(ng/ml)*32对科兴试剂验证结果准确度精密度参考品标示值测量值回收率%CV%17.96118.36102612.251.5113.1610766.791.146.8310183.110.313.039712相关系数r20.9948单位：单位：(ng/ml)*33对科兴试剂热稳定性验证结果准确度精密度参考品标示值
18、测量值回收率%CV%17.96117.2396412.251.5112.2810056.791.146.469543.110.312.93946相关系数r20.9957单位：单位：(ng/ml)*企业企业201020102011201120122012北京天坛236.0 143.0 21.0 北京科兴42.026.0 24.0 雅立峰17.06.015.0 长春所75.011.0 8.0长春长生150.0 77.0 16.0 上海所11.0 4.02.0浙江天元143.0 24.0 40.0 华兰生物28.0 13.0 10.0 兰州所67.0 80.0/巴斯德37.063.0 61.0 史克
19、10.08.08.0 诺华109.0203.0/苏威259.080.031.0应用效果20102012年流感疫苗卵清含量明显下降！检测结果为ng/ml, 药典标准500ng/ml*35举例2：麻疹减毒活疫苗参考品的建立*36减毒活疫苗参考品的意义v参考品是病毒滴定系统中的重要组成部分，参考品是病毒滴定系统中的重要组成部分，能够控制不同滴度试验间的变异，是病毒能够控制不同滴度试验间的变异，是病毒滴度测定中不可或缺的部分。滴度测定中不可或缺的部分。 v使用国家参考品能够为相关产品提供统一使用国家参考品能够为相关产品提供统一的参照标准，使生产企业、质控部门更好的参照标准，使生产企业、质控部门更好的控
20、制产品质量的控制产品质量。*37参考品的制备、标定方案参考品的制备、标定方案u选取国内生产用毒株选取国内生产用毒株( (沪沪191/BRD) )制备参考品；制备参考品； u为了增加参考品的为了增加参考品的均一性均一性和和稳定性稳定性，在参考品的，在参考品的制备过程中制备过程中提高对保护剂成份、分装精度、残余提高对保护剂成份、分装精度、残余水分含量的要求水分含量的要求；u协作标定包括所有相关疫苗生产企业，以保证协协作标定包括所有相关疫苗生产企业，以保证协作标定结果的作标定结果的代表性代表性；u将协作标定分两个阶段，预标定和正式标定，以将协作标定分两个阶段，预标定和正式标定，以保证协作标定保证协作
21、标定准确性准确性 ；u与与国际参考品同时进行标定，保证国家参考品的国际参考品同时进行标定，保证国家参考品的溯源性溯源性；u 稳定性考核包括热稳定性和实时稳定性。稳定性考核包括热稳定性和实时稳定性。选择毒株选择毒株生产制备生产制备正式标定正式标定稳定性考核稳定性考核预标定预标定不含国际参考品，修订检测方法含国际参考品，按照统一方法*38协作标定流程图发放调查表（含标定SOP）获得反馈结果修改SOP发送候选参考品和国际参考品候选参考品预标定预标定结果汇总及分析正式标定（候选参考品国际参考品）正式标定结果汇总及分析*39标定方案示意图4 4支待标定支待标定参考品参考品（0.5ml/0.5ml/支）支
22、）稀稀释释1#1#稀稀释释2#2#稀稀释释3#3#稀稀释释4#4#1 1支国际支国际参考品参考品（1ml1ml）NO1NO2NO3NO4*40协作标定结果协作标定结果参加单位参加单位麻疹麻疹（lgCCID50/ml ）风疹（风疹（lgCCID50/ml ）候选参考品候选参考品国际参考品国际参考品候选参考品候选参考品国际参考品国际参考品北京天坛北京天坛4.860.124.130.144.290.263.910.14兰州所兰州所5.060.124.240.32/上海所上海所4.870.103.940.224.590.143.910.10武汉所武汉所4.880.463.910.12/中检所中检所5.
23、140.224.290.084.810.124.050.26均值均值4.964.10标示滴度标示滴度4.34.563.96标示滴度标示滴度3.9SD0.130.170.260.16u麻疹国际参考品：麻疹国际参考品：NIBSC编号：编号：92/648, 标示滴度标示滴度4.3 lgCCID50/mlu风疹国际参考品：风疹国际参考品：NIBSC编号编号: : 91/688, , 标示滴度标示滴度3.9 lgCCID50/ml每个实验室进行每个实验室进行8次独立检测次独立检测*41参考品实时稳定性结果参考品实时稳定性结果u麻疹疫苗国家参考品：麻疹疫苗国家参考品：(2009)国生参字国生参字0031 u风疹疫苗国家参考品风疹疫苗国家参考品: : (2009)国生参字国生参字0032上限上限下限下限下限下限上限上限*42谢谢！*
