1、实验五实验五 菠菜色素的提取和薄菠菜色素的提取和薄层色谱（层色谱（7学时）学时）一、实验目的一、实验目的二、实验原理二、实验原理三、基本操作三、基本操作四、实验装置四、实验装置五、注意事项五、注意事项六、成功关键六、成功关键七、课后习题七、课后习题一、实验目的一、实验目的1、了解薄层色谱的一般原理和意义、了解薄层色谱的一般原理和意义。2、学习薄层色谱的操作方法。、学习薄层色谱的操作方法。3、掌握天然色素的提取方法。、掌握天然色素的提取方法。4、掌握液体有机化合物的干燥。、掌握液体有机化合物的干燥。二、实验原理二、实验原理 绿色植物如菠菜叶中含有叶绿素（绿）、胡萝卜素（橙）和叶绿色植物如菠菜叶中
2、含有叶绿素（绿）、胡萝卜素（橙）和叶黄素（黄）等多种天然色素。其结构如下：黄素（黄）等多种天然色素。其结构如下： 叶绿素中叶绿素中a的含量通常是的含量通常是b的的3倍。尽管叶绿素分子含有一个倍。尽管叶绿素分子含有一个极性基团，但大的烃基结构使它易溶于醚、石油醚等一些非极极性基团，但大的烃基结构使它易溶于醚、石油醚等一些非极性的溶剂。性的溶剂。 胡萝卜素是具有长链结构的共轭多烯，它有三种异构体，胡萝卜素是具有长链结构的共轭多烯，它有三种异构体，即即或或-、-和和-异构体，其中异构体，其中-异构体含量最多，也最重要。异构体含量最多，也最重要。生长期较长的绿色植物中，异构体生长期较长的绿色植物中，异
3、构体-体的含量多达体的含量多达90%。-体体具有维生素具有维生素A的生理活性，其结构是两分子维生素的生理活性，其结构是两分子维生素A在链端失去在链端失去两分子水结合而成的。在生物体内，两分子水结合而成的。在生物体内，-体受酶催化即形成维生体受酶催化即形成维生素素A。目前。目前-体已可进行工业生产，可作为维生素体已可进行工业生产，可作为维生素A使用，也可使用，也可作为食品工业中的色素。作为食品工业中的色素。 叶黄素是胡萝卜素的羟基衍生物，它在绿叶中的含量通常叶黄素是胡萝卜素的羟基衍生物，它在绿叶中的含量通常是胡萝卜素的两倍。与胡萝卜素相比，叶黄素较易溶于醇而在是胡萝卜素的两倍。与胡萝卜素相比，叶
4、黄素较易溶于醇而在石油醚中溶解度较小。故本实验采用甲醇石油醚中溶解度较小。故本实验采用甲醇石油醚的混合溶石油醚的混合溶剂提取以上三种色素。剂提取以上三种色素。 薄层色谱又称为薄层层析薄层色谱又称为薄层层析,属于固属于固-液吸附色谱。其基本原理是液吸附色谱。其基本原理是利用混合物各组分在某一物质中的吸附或溶解性能（分配）的不利用混合物各组分在某一物质中的吸附或溶解性能（分配）的不同，或其亲和性的差异，使混合物的溶液流经该种物质进行反复同，或其亲和性的差异，使混合物的溶液流经该种物质进行反复的吸附或分配作用，从而使各组分分离。它的优点是：所需样品的吸附或分配作用，从而使各组分分离。它的优点是：所需
5、样品少；展开时间短；分离效率高；而且不需特殊仪器，操作方便。少；展开时间短；分离效率高；而且不需特殊仪器，操作方便。薄层色谱是快速分离和定性分析少量物质的一种很重要的实验技薄层色谱是快速分离和定性分析少量物质的一种很重要的实验技术，也用于跟踪反应进程。术，也用于跟踪反应进程。薄层色谱薄层色谱 薄层色谱是通过制浆、涂片、点样、展开及显色来完成的。薄层色谱是通过制浆、涂片、点样、展开及显色来完成的。1、吸附剂与展开剂、吸附剂与展开剂吸附剂（固定相）吸附剂（固定相）：用于与样品发生吸附作用的固定不动：用于与样品发生吸附作用的固定不动的物质。在混合物样品流经吸附剂（固定相）的过程中，的物质。在混合物样
6、品流经吸附剂（固定相）的过程中，由于各组分与吸附剂（固定相）吸附力的不同，就产生了由于各组分与吸附剂（固定相）吸附力的不同，就产生了速度的差异，从而将混合物中的各组分分开。一般常用的速度的差异，从而将混合物中的各组分分开。一般常用的吸附剂为氧化铝和硅胶。硅胶可分为硅胶吸附剂为氧化铝和硅胶。硅胶可分为硅胶H（不含黏合（不含黏合剂）、硅胶剂）、硅胶G（含黏合剂）和硅胶（含黏合剂）和硅胶HF（含荧光物质，可在（含荧光物质，可在紫外光下观察）等。氧化铝同样也可分为以上几种类型。紫外光下观察）等。氧化铝同样也可分为以上几种类型。展开剂（流动相）：展开剂（流动相）：也称洗脱剂，在色谱过程中起到将吸附也称洗
7、脱剂，在色谱过程中起到将吸附在固定相上的样品洗脱的作用。在固定相上的样品洗脱的作用。 选择展开剂时应考虑样品的极性、溶解度和吸附剂的活性选择展开剂时应考虑样品的极性、溶解度和吸附剂的活性等因素。等因素。展开剂的极性越大，对化合物的解吸附（洗脱）能力展开剂的极性越大，对化合物的解吸附（洗脱）能力就越大，即就越大，即Rf值就越大值就越大。如选用一种溶剂（展开剂）后发现其。如选用一种溶剂（展开剂）后发现其样品成分的样品成分的Rf值都比较大，则可换用一种极性较小的展开剂，值都比较大，则可换用一种极性较小的展开剂，也可在原展开剂中加入一种极性较小的溶剂。展开剂的洗脱能也可在原展开剂中加入一种极性较小的溶
8、剂。展开剂的洗脱能力按下列次序递增：已烷，四氯化碳，甲苯，苯，二氯甲烷，力按下列次序递增：已烷，四氯化碳，甲苯，苯，二氯甲烷，氯仿，乙醚，乙酸乙酯，丙酮，丙醇，乙醇，甲醇，水。氯仿，乙醚，乙酸乙酯，丙酮，丙醇，乙醇，甲醇，水。2 2、比移值的计算、比移值的计算 RfRf值计算如下：值计算如下： RfRfd d斑斑/d/d剂物质所移动的距离剂物质所移动的距离/ /溶剂前沿移动的距离溶剂前沿移动的距离见下图所示。见下图所示。第二块板重复做一次，选择较好的一块板进行测量第二块板重复做一次，选择较好的一块板进行测量RfRf值。值。点样线溶剂前沿d溶剂d斑点原斑点斑点影响影响RfRf值的因素很多值的因素
9、很多，如样品的结构、吸附剂和展开剂的性，如样品的结构、吸附剂和展开剂的性质、温度以及薄层板的质量等。当这些条件都固定时，化合物质、温度以及薄层板的质量等。当这些条件都固定时，化合物的比移值的比移值RfRf是一个特性常数。但由于实验条件容易改变而不易是一个特性常数。但由于实验条件容易改变而不易固定，因此在鉴定一个具体化合物时，经常采用与已知标准样固定，因此在鉴定一个具体化合物时，经常采用与已知标准样品对照的方法。品对照的方法。 1、薄层色谱的操作步骤：、薄层色谱的操作步骤： （1）制浆制浆 浆液的制备可分为干法和湿法。干法是将选好的浆液的制备可分为干法和湿法。干法是将选好的硅胶硅胶G慢慢倒入溶剂
10、中调成糊状备用。湿法是将水和硅胶慢慢倒入溶剂中调成糊状备用。湿法是将水和硅胶G按按1：4的比例在搅拌下将硅胶的比例在搅拌下将硅胶G慢慢地倒入水中调成糊状，不要反慢慢地倒入水中调成糊状，不要反过来加，防止形成团块。湿法制浆要在使用前调制，否则浆料过来加，防止形成团块。湿法制浆要在使用前调制，否则浆料容易凝固结块。容易凝固结块。三、基本操作三、基本操作(2)(2)涂片涂片 大量使用可用涂布器涂布。简单的涂布方法是将两大量使用可用涂布器涂布。简单的涂布方法是将两片载玻片用肥皂水和水洗涤干净，再用碎滤纸吸干玻片上的水片载玻片用肥皂水和水洗涤干净，再用碎滤纸吸干玻片上的水分，然后将其重叠在一起，用手夹住
11、片的上端，慢慢浸入已调分，然后将其重叠在一起，用手夹住片的上端，慢慢浸入已调好的浆液浸涂好的浆液浸涂2s2s左右（上端留一些不浸涂），然后缓慢地将载左右（上端留一些不浸涂），然后缓慢地将载玻片从浆液中取出，要求版面均匀平滑，载片边缘上的浆料用玻片从浆液中取出，要求版面均匀平滑，载片边缘上的浆料用抹布轻轻地擦去，小心将两片分开，放在磁盘中。待浆料自然抹布轻轻地擦去，小心将两片分开，放在磁盘中。待浆料自然干燥后放入烘箱，在干燥后放入烘箱，在105105110110下活化，约下活化，约30min30min就制成了薄层就制成了薄层板，取出来进行点样。板，取出来进行点样。（3）点样点样 在活化好的薄层板
12、下约在活化好的薄层板下约1cm处的边上轻轻地用处的边上轻轻地用铅笔点一个标记作为起始线。用一根内径约一毫米的毛细铅笔点一个标记作为起始线。用一根内径约一毫米的毛细管吸取制备好的试样。吸取的试样不要太多，防止样点扩管吸取制备好的试样。吸取的试样不要太多，防止样点扩散。在起始线的中央轻轻地接触薄层板，点样要迅速，接散。在起始线的中央轻轻地接触薄层板，点样要迅速，接触即刻移开。待样点溶剂挥发后再重复点样约触即刻移开。待样点溶剂挥发后再重复点样约34次。样次。样点直径不要超过点直径不要超过2mm，太大会出现拖尾现象。如果在一块，太大会出现拖尾现象。如果在一块薄层板上点两个以上的样点要分开距离。样点点好
13、后就可薄层板上点两个以上的样点要分开距离。样点点好后就可以展开。以展开。（4 4）展开展开 将展开剂倒入展开瓶或合适的广口瓶中，使液面将展开剂倒入展开瓶或合适的广口瓶中，使液面在样点的下方，不要接触到样点，否则样点会被溶入展开剂中无在样点的下方，不要接触到样点，否则样点会被溶入展开剂中无法进行展开。法进行展开。将薄层板小心斜放在展开瓶中盖好盖，观察展开剂通过毛细管将薄层板小心斜放在展开瓶中盖好盖，观察展开剂通过毛细管作用沿板上行。此时溶剂上行很快，必须留心观察。当展开剂上作用沿板上行。此时溶剂上行很快，必须留心观察。当展开剂上行至距离涂层顶端约行至距离涂层顶端约5mm5mm时，将板小心取出，用
14、铅笔做好溶剂前时，将板小心取出，用铅笔做好溶剂前沿的位置记号。样点各组分随展开剂上行同时被展开在各个部位沿的位置记号。样点各组分随展开剂上行同时被展开在各个部位而形成各个有色斑点，取斑点的中心位置做好记号。如果斑点没而形成各个有色斑点，取斑点的中心位置做好记号。如果斑点没有颜色就用显色法使斑点显示出来。一种是在色谱缸中或密闭的有颜色就用显色法使斑点显示出来。一种是在色谱缸中或密闭的容器中放入几粒碘，把展开后的薄层板放入，待斑点明显时取出容器中放入几粒碘，把展开后的薄层板放入，待斑点明显时取出做好记号。另一种是带有荧光的硅胶可用紫外灯照射观察斑点。做好记号。另一种是带有荧光的硅胶可用紫外灯照射观
15、察斑点。2 2、液体有机化合物的干燥、液体有机化合物的干燥（1 1）干燥一般在干燥的三角瓶中进行，投入干燥剂后塞紧；）干燥一般在干燥的三角瓶中进行，投入干燥剂后塞紧；振荡片刻，静置；振荡片刻，静置；（2 2）干燥剂的用量：一般每）干燥剂的用量：一般每10mL10mL约需约需0.5-10.5-1克；干燥剂附着克；干燥剂附着在器壁或相互粘结时，说明干燥剂不够；在器壁或相互粘结时，说明干燥剂不够；（3 3）干燥时间：一般）干燥时间：一般20-3020-30分钟，至澄清为止；分钟，至澄清为止；（4 4）用倾泌法除去干燥剂。）用倾泌法除去干燥剂。四、实验装置四、实验装置色素提取装置色素提取装置薄层层析装
16、置薄层层析装置五、注意事项五、注意事项1、点样时，不能破坏硅胶板。各样点间距、点样时，不能破坏硅胶板。各样点间距11.5cm，样点直径应不超过，样点直径应不超过2mm。2、喷显色剂时，应均匀喷洒，且喷雾器不能靠薄层板、喷显色剂时，应均匀喷洒，且喷雾器不能靠薄层板太近，以免造成硅胶板脱落。太近，以免造成硅胶板脱落。3、薄层板取用时应用手接触其边缘，否则指印沾污载、薄层板取用时应用手接触其边缘，否则指印沾污载玻片表面，将使吸附剂难于铺在载玻片上。玻片表面，将使吸附剂难于铺在载玻片上。六、成功关键六、成功关键1、薄层板要洁净，要均匀，否则影响、薄层板要洁净，要均匀，否则影响Rf值的准确性。值的准确性
17、。2、点样多少要适当。太少，斑点不清楚；太多，又会出现、点样多少要适当。太少，斑点不清楚；太多，又会出现斑点太大或拖尾现象，影响斑点太大或拖尾现象，影响Rf值的准确性。值的准确性。3、点样时，点样的原斑点直径不得超过、点样时，点样的原斑点直径不得超过2-3mm，否则影，否则影响响Rf值的准确性。值的准确性。4、展开时，切不可让展开剂淹没原斑点，否则样品溶于展、展开时，切不可让展开剂淹没原斑点，否则样品溶于展开剂中，不会出现斑点上移，实验失败。开剂中，不会出现斑点上移，实验失败。5、取出后应立即在展开剂前沿划上记号，等展开剂挥发、取出后应立即在展开剂前沿划上记号，等展开剂挥发后，就无法确定展开剂上升的高度，而无法计算后，就无法确定展开剂上升的高度，而无法计算Rf值。值。七、课后习题七、课后习题1. 展开剂的高度超过点样线，对薄层色谱有什么影响？展开剂的高度超过点样线，对薄层色谱有什么影响？2. 如何利用如何利用Rf值来鉴定化合物？值来鉴定化合物？3. 为什么极性大的组分要用极性较大的溶剂洗脱？为什么极性大的组分要用极性较大的溶剂洗脱？
