1、CRISPR/Cas9技术的原理及应用技术的原理及应用CRISPR-Cas系统的发现 1987年，日本大阪大学（年，日本大阪大学（Osaka University）在对一种细菌编码的碱性磷酸酶（）在对一种细菌编码的碱性磷酸酶（alkaline phosphatase）基因进行研究时，发现在这个基因编码区域的附近存在一小段不同寻常的基因进行研究时，发现在这个基因编码区域的附近存在一小段不同寻常的DNA片段，片段，这些片段是由简单这些片段是由简单的重复序列组成，且片段的两端还存在一段不太长的特有序列的重复序列组成，且片段的两端还存在一段不太长的特有序列。 CRISPR：成簇的、规律间隔的短回文重复
2、序列：成簇的、规律间隔的短回文重复序列 （clustered regularly interspaced short palindromic repeats） CRISPR 是一个特殊的是一个特殊的DNA重复序列家族重复序列家族, 广泛分布于细菌和古细菌基因组中。广泛分布于细菌和古细菌基因组中。CRISPR 位点通常由短位点通常由短的高度保守的重复序列的高度保守的重复序列(repeats) 组成组成, 重复序列的长度通常重复序列的长度通常 2148 bp, 重复序列之间被重复序列之间被 2672 bp 间隔序列间隔序列(spacer)隔开。隔开。 CRISPR-Cas主要由两部分组成：主要由两
3、部分组成：切割活性域切割活性域 Cas序列识别区域序列识别区域CRISPRCRISPRCRISPR-CasCRISPR-Cas结构结构Cas家族家族 Cas（CRISPR associated）：）： 存在于存在于CRISPR位点附近，是一种双链位点附近，是一种双链DNA核酸酶，能在核酸酶，能在guide RNA引导下对靶位点进行切引导下对靶位点进行切割。它与割。它与Folk酶功能类似，但是它并不需要形成二聚体才能发挥作用。酶功能类似，但是它并不需要形成二聚体才能发挥作用。Cas9CRISPR-Cas系统靶向要求最主要的要求：最主要的要求：PAM（protospacer-adjacent mo
4、tif）为）为NGG。人类基因组中，平均人类基因组中，平均8bp即可出现一个即可出现一个PAMCas9技术的应用技术的应用 基因打靶基因打靶 激活表达激活表达 抑制表达抑制表达基因打靶基因打靶通过特异性RNA序列（gRNA for Cas9）,引导核酸内切（endonuclease）在靶基因处切割，引起靶基因产生DSB（双链缺口），机体修复DSB的方式有两种:NHEJ，HDR。NHEJ用于Cas9 KO项目，HDR用于Cas9-CKO,KI项目基因敲除基因敲除 Knock-outKnock-out基因敲除基因敲除 Knock-out通过sgRNA引导核酸内切酶Cas9在靶基因处产生DSB（双链
5、缺口），机体以NHEJ修复DSB损伤，修复会产生indel，从而使目的基因移码造成基因功能缺失。基因敲除新技术：基因敲除新技术：Cas9 经典敲除（经典敲除（ Knockout ） 通过同源重组实现基因打靶并实现目的基因的缺失或破坏，使其失去原有功能通过同源重组实现基因打靶并实现目的基因的缺失或破坏，使其失去原有功能 新技术（新技术（ Cas9） 通过特异性通过特异性RNA序列（序列（gRNA for Cas9）,引导核酸内切（引导核酸内切（endonuclease）在靶基因处切割，引）在靶基因处切割，引起靶基因产生起靶基因产生DSB（双链缺口），机体修复（双链缺口），机体修复DSB的方式有两
6、种的方式有两种:NHEJ，HDR。 NHEJ用于用于Cas9 KO项目，项目，HDR用于用于Cas9-CKO,KI项目项目Cas9与与KI 2013年年1月月29日在日在nature biotechnology上发表的上发表的RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems一文中，作者利用一文中，作者利用CRISPR-Cas系统用设计好的系统用设计好的DNA模模板替换的相应基因来达到基因的定向修饰。板替换的相应基因来达到基因的定向修饰。 根据修复方式根据修复方式 不同，我们应用不同，我们应用TALEN及及Cas9核
7、酸内切酶活性时进行基因打靶时主要分为两个核酸内切酶活性时进行基因打靶时主要分为两个方向方向 基因敲除基因敲除 基因定向修饰（本质等同于基因定向修饰（本质等同于Knock-In） 两者的区别，都是利用同源重组发生基因的定向插入，优势：机体在修复两者的区别，都是利用同源重组发生基因的定向插入，优势：机体在修复DSB时，如果提供时，如果提供模板，则同源重组效率较只提供模板，机体没有出现模板，则同源重组效率较只提供模板，机体没有出现DSB修复时的几率高近修复时的几率高近100倍以上倍以上 传统传统KO，需要较长的同源臂（，需要较长的同源臂（3000-5000bp），且打靶载体定的），且打靶载体定的 构
8、建难度大，耗时长，构建难度大，耗时长， 既然同源重组效率高，同源臂降低也可发生高效重组既然同源重组效率高，同源臂降低也可发生高效重组, 且多位点同时发生同源重组也可实现且多位点同时发生同源重组也可实现 以以CKO为例，介绍结合为例，介绍结合Cas9发生发生KI,完成完成CKO模型模型常规常规CKO借助借助Cas9切割，利用切割，利用KI实现常规实现常规CKO调节基因转录的调节基因转录的Cas9Cas9模式模式We next examined whether CRISPRi could block a transcription factor from binding to enhancer s
9、itesThis suggests that dCas9 can sterically compete with transcription factors that have tight binding affinity for DNA elements, further implying that CRISPRi can be used to perturb and map the regulatory roles of distal and proximal enhancers.设计设计打靶载体鉴定方案ESES打靶打靶 药物筛选 中靶鉴定注射注射 囊胚注射 胚胎移植繁育繁育 繁育 建系鉴
10、定鉴定 基因型鉴定 突变检测胚胎冷冻胚胎冷冻基因打靶小鼠制作流程基因打靶小鼠制作流程sgRNAsgRNA筛选筛选囊胚打靶囊胚打靶测试测试注射注射 囊胚注射 胚胎移植繁育繁育 繁育 建系鉴定鉴定 基因型鉴定 突变检测胚胎冷冻胚胎冷冻2.5-3 mouth37-54 day Cas9技术进行技术进行CKO，KI的优缺点的优缺点 优点：1.经典同源重组局限在于需用胚胎干细胞（Embryonic stem cell）进行重组打靶，Cas9技术突破了打靶技术对物种的限制；2.采用Cas9技术进行模型动物制备，所需时间短，最快37天，最慢54天即可确定项目是否能够进行移植，得到F0代鼠时间为3个月；而常规CKO、KI项目得到嵌合鼠时间多为8个月。 缺点：1.TALEN、Cas9等进行CKO/KI技术目前仍处于研发测试阶段，目前出现阳性鼠的项目比例为5/25，故目前主推Cas9-CKO/KI可能出现项目不能完成的风险。
