1、 根据微生物药物的生物合成原理根据微生物药物的生物合成原理发现微生物新药的方法和途径发现微生物新药的方法和途径n通过非基因定向改变、基因定向改变，以通过非基因定向改变、基因定向改变，以及组合生物催化的技术，或是改变原有微及组合生物催化的技术，或是改变原有微生物药物的生物合成途径，或是对原有的生物药物的生物合成途径，或是对原有的微生物药物（或先导化合物和中间体）进微生物药物（或先导化合物和中间体）进行生物催化，以发现微生物新药行生物催化，以发现微生物新药 . .产生菌产生菌前体物质前体物质(1) (1) 诱变处理诱变处理化学化学修饰修饰天然产物天然产物衍生物衍生物天然产物天然产物天然中间物天然中
2、间物天然产物天然产物衍生物衍生物 化学修饰化学修饰 生物转化与生物转化与 组合生物转化组合生物转化 阻断或非阻阻断或非阻断菌株断菌株定向与杂交定向与杂交生物合成生物合成微生物或微生物或酶转化酶转化天然产物天然产物类似物类似物 杂合杂合 工程菌工程菌突变生物突变生物合成合成组合生物合成组合生物合成(2) (2) 基因操作基因操作天然产物天然产物类似物类似物(1)(2)天然产物天然产物类似物类似物微生物药物生物合成微生物药物生物合成与微生物新药发现的基本途径与微生物新药发现的基本途径 n通过非基因定向改变的方法包括：定向生通过非基因定向改变的方法包括：定向生物合成、杂交生物合成、突变生物合成，物合
3、成、杂交生物合成、突变生物合成，以及生物转化与组合生物转化；以及生物转化与组合生物转化；n基因定向改变，即为组合生物合成。基因定向改变，即为组合生物合成。 一、非遗传操作的定向生物合成一、非遗传操作的定向生物合成与微生物新药的发现与微生物新药的发现n已有的研究表明，在抗生素等次级代谢产物生已有的研究表明，在抗生素等次级代谢产物生物合成中酶底物的特异性足以使结构相关的物合成中酶底物的特异性足以使结构相关的代谢产物在其发酵液中积累；代谢产物在其发酵液中积累；n但由于生物合成酶的底物专一性较低（宽泛但由于生物合成酶的底物专一性较低（宽泛性），其野生型菌株或阻断突变株的发酵过程性），其野生型菌株或阻断
4、突变株的发酵过程中添加一些已知结构类似物作为前体物质，可中添加一些已知结构类似物作为前体物质，可以产生含有与这种已知结构类似的新衍生物；以产生含有与这种已知结构类似的新衍生物；n这种获得新次级代谢产物的途径，可以被称之这种获得新次级代谢产物的途径，可以被称之为非遗传操作的定向生物合成为非遗传操作的定向生物合成 (directed (directed biosynthesis)biosynthesis)。 前体（前体（precursorprecursor）n即在微生物培养过程中，外源添加的某一即在微生物培养过程中，外源添加的某一化学物质，通过微生物的代谢，能够将其化学物质，通过微生物的代谢，能够
5、将其整体地或部分地整合到某一特定的次级代整体地或部分地整合到某一特定的次级代谢产物的分子中去的化合物，如苯乙酸或谢产物的分子中去的化合物，如苯乙酸或苯乙酰胺及苯氧乙酸等）。苯乙酰胺及苯氧乙酸等）。非遗传操作的定向生物合成非遗传操作的定向生物合成n这种在发酵过程中通过添加某种特定的前体物质，这种在发酵过程中通过添加某种特定的前体物质，使微生物的生物合成朝着将这些前体物质掺入到使微生物的生物合成朝着将这些前体物质掺入到产物分子的某一特定部位而产生过量的含有这种产物分子的某一特定部位而产生过量的含有这种前体的产物的方法，即为非遗传操作的定向生物前体的产物的方法，即为非遗传操作的定向生物合成。合成。n
6、其基本原理是由于参与这些反应的生物合成酶的其基本原理是由于参与这些反应的生物合成酶的底物专一性较差，而能使外源添加的某些前体物底物专一性较差，而能使外源添加的某些前体物质竞争性地掺入到特定产物的分子中去。质竞争性地掺入到特定产物的分子中去。 定向生物合成与微生物新药的发现定向生物合成与微生物新药的发现n次级代谢产物合成酶的特点：次级代谢产物合成酶的特点：是一个由一系列酶参与催化的多酶体系。是一个由一系列酶参与催化的多酶体系。参与催化反应的酶的底物专一性比初级代参与催化反应的酶的底物专一性比初级代谢合成酶要差。谢合成酶要差。应用实例应用实例n应用非遗传操作定向生物合成的方法能够应用非遗传操作定向
7、生物合成的方法能够制备获得许多新的抗生素，其中目前已进制备获得许多新的抗生素，其中目前已进行工业化生产的有：行工业化生产的有：n青霉素青霉素G G和和V V；n培罗霉素；培罗霉素；n四环素和金霉素等。四环素和金霉素等。 青霉素定向生物合成青霉素定向生物合成.序号序号侧侧 链链 R R学学 名名俗俗 名名1 1对羟基苄青霉素对羟基苄青霉素青霉素青霉素X X2 2苄青霉素苄青霉素青霉素青霉素G G3 3戊烯戊烯22青霉素青霉素青霉素青霉素F F4 4戊青霉素戊青霉素青霉素二氢青霉素二氢F F5 5庚青霉素庚青霉素青霉素青霉素K K6 6丙烯巯甲基青霉素丙烯巯甲基青霉素青霉素青霉素O O7 7苯氧甲
8、基青霉素苯氧甲基青霉素青霉素青霉素V V8 84 4氨基氨基4 4羧基羧基丁基青霉素丁基青霉素青霉素青霉素N NNCHSCCHCH3CH3HCCNHOCRCOOHONCHSCCHCH3CH3HCCH2NOCOOH青霉素和青霉素和6APA分子结构及各种天然青霉素的结构与名称分子结构及各种天然青霉素的结构与名称青霉素分子的化学结构青霉素分子的化学结构6APA的化学结构的化学结构各种天然青霉素具有的侧链和名称各种天然青霉素具有的侧链和名称HOCH2CH2H3CCH2CHCHCH2H3C(CH2)3CH2H3C(CH2)5CH2H2CCHCH2SCH2CH3OCH(CH2)2CH2NH2HOOC培罗霉
9、素定向生物合成培罗霉素定向生物合成.培罗霉素定向生物合成培罗霉素定向生物合成可结合进入可结合进入BLMBLM的末端胺基部分的非天然胺基化合物的末端胺基部分的非天然胺基化合物.H2NCH2CH2NH2H2NCH2CHNH2CH3H2N(CH2)3NHCH3H2N(CH2)3N(CH3)2H2N(CH2)3N(CH3)2X-H2N(CH2)3NH(CH2)3N(CH3)2H2N(CH2)3N(CH2)3NH2CH3H2N(CH2)3NHCHCH3(CH2)2NH2H2N(CH2)3NH(CH2)3OHH2N(CH2)3NH(CH2)3OCH3H2N(CH2)3NH2N(CH2)3NH2N(CH2)
10、3NOH2N(CH2)2NNHH2N(CH2)3NHCH2*H2N(CH2)3NHCHCH3H2NCH2CH2NH2H2N(CH2)3NH* PEP的末端胺基的末端胺基四环类抗生素的定向生物合成四环类抗生素的定向生物合成R5R6R76去甲基四环素HHH(1)7氯6去甲基四环素HHCl(2)四环素HCH3H(3)5羟基四环素（土霉素）OHCH3H(4)7氯四环素（金霉素）HCH3Cl(5)OHR7OOHNH2OOOHHON(CH3)2HR6HR5HH789101166a10a55a11a44a12a12312微生物发酵产生的一些四环素类抗生素微生物发酵产生的一些四环素类抗生素四环类抗生素的定向生
11、物合成四环类抗生素的定向生物合成 在生产在生产金霉素金霉素时需添加氯化物作为前体，时需添加氯化物作为前体，而当生产而当生产四环素四环素时，则必须要在发酵培养时，则必须要在发酵培养基中添加氯离子抑制剂，如溴化物或基中添加氯离子抑制剂，如溴化物或M-M-促促进剂等，从而抑制金霉素的合成而得到四进剂等，从而抑制金霉素的合成而得到四环素产物。环素产物。 另外，用金色链霉菌在发酵的金霉素过程另外，用金色链霉菌在发酵的金霉素过程中添加适量的甲基化反应抑制剂如磺胺嘧中添加适量的甲基化反应抑制剂如磺胺嘧啶钠，能够获得啶钠，能够获得去甲基金霉素。去甲基金霉素。 杜拉克丁的定向生物合成杜拉克丁的定向生物合成OH3
12、COOHOOH3CH3COOOOCH3OH3COYXCH3R2OCH3R1OH1754222325CH3杜拉克丁的定向生物合成杜拉克丁的定向生物合成组分R1R2XY备注A1aA1bA2aA2bB1aB2bB2aB2bOCH3OCH3OCH3OCH3OHOHOHOHCH=CHCH=CHCH2CH（OH）CH2CH（OH）CH=CHCH=CHCH2CH（OH）CH2CH（OH）25-环己烷基环己烷基-B225-环己烷基环己烷基-B1OHOHCH2CH（OH）CH=CH外源添加环外源添加环己烷羧酸钠己烷羧酸钠CH3C2H5CH3C2H5CH3C2H5CH3C2H5CH3CH3CH3CH3CH3CH3
13、CH3CH3非基因改变定向生物合成的研究进展非基因改变定向生物合成的研究进展 尽管近年来基因改变的定向生物合成尽管近年来基因改变的定向生物合成发展很快，但利用非遗传操作定向生物合发展很快，但利用非遗传操作定向生物合成原理寻找新的生理活性物质的研究还在成原理寻找新的生理活性物质的研究还在不少实验室继续进行，特别是对一些肽类不少实验室继续进行，特别是对一些肽类如如环孢菌素环孢菌素A A、aureobasidinsaureobasidins及糖肽类如及糖肽类如替考拉宁产生菌替考拉宁产生菌的定向生物合成研究取得的定向生物合成研究取得了很大的进展。了很大的进展。二、添加外源酶抑制剂的杂交生物合成二、添加
14、外源酶抑制剂的杂交生物合成与微生物新药的发现与微生物新药的发现n 杂交生物全成（杂交生物全成（hybrid biosynthesishybrid biosynthesis）似乎可以）似乎可以理解为是理解为是一种一种“强化强化”的非遗传定向生物合成的非遗传定向生物合成，如，如在苦霉素产生菌生酵过程中添加聚乙酰途径中在苦霉素产生菌生酵过程中添加聚乙酰途径中-酮酯酰基合成酶抑制剂酮酯酰基合成酶抑制剂线兰菌素线兰菌素(cerulenin(cerulenin) )，使其失去合成链霉素大环内酯苷元使其失去合成链霉素大环内酯苷元(picronolide(picronolide) )的能力而只能合成糖基。同时
15、在发酵过程中添加泰的能力而只能合成糖基。同时在发酵过程中添加泰乐菌素大环内酯苷元乐菌素大环内酯苷元(protylonolide(protylonolide) )，使其与苦，使其与苦霉素生产菌产生的糖基结合，得到一种被称之为霉素生产菌产生的糖基结合，得到一种被称之为M4365G1M4365G1的杂合抗生素的杂合抗生素(hybrid antibiotic)(hybrid antibiotic)。 杂交生物合成与微生物新药的发现杂交生物合成与微生物新药的发现OHOMeNHOMeMe葡萄糖1CH3COOH6CH3CH2COOHMeMeOOOHMeOHMeMeOMe2CH3COOH5CH3CH2COHC
16、H3CH2CH2COOHS.fradia KA427 NO.261ProtylonolidePicronolideOMeOMeHOMeOHMeMeDesosamineOMeNHOMeMeOMeOMeHOMeMeMeOOMeNHOMeMeMeMeOOOHMeOMeMeOMePicromycin DDesosaminyl Protylonolide（M4365G1） 在浅蓝菌素存在下，用苦味霉素产生菌（在浅蓝菌素存在下，用苦味霉素产生菌（S.sp.AM4900） 与与protylonolide 杂交生物合成杂交生物合成M4365G杂交生物合成产物工业化的可能性杂交生物合成产物工业化的可能性 尽管通
17、过杂交生物合成能够得到尽管通过杂交生物合成能够得到一些新的抗生素，但由于所添加的一些新的抗生素，但由于所添加的浅浅蓝菌素蓝菌素本身就是一种昂贵的抗生素，本身就是一种昂贵的抗生素，再则所添加的再则所添加的苷元的结构苷元的结构受到限制，受到限制，所以这种方法似乎没有很大的实际意所以这种方法似乎没有很大的实际意义。义。 三、非定向诱变的突变生物合成三、非定向诱变的突变生物合成与微生物新药的发现与微生物新药的发现n突变生物合成（突变生物合成（mutational biosynthesismutational biosynthesis）：）：n突变生物合成是指野生型产生菌经化学或物理等突变生物合成是指野
18、生型产生菌经化学或物理等因素诱变处理后，丧失合成原来次级代谢产物的因素诱变处理后，丧失合成原来次级代谢产物的能力而成为阻断突变株，然后在发酵培养阻断突能力而成为阻断突变株，然后在发酵培养阻断突变株时添加某种外源物质，参与生物合成以获得变株时添加某种外源物质，参与生物合成以获得新的次级代谢产物的过程。新的次级代谢产物的过程。n另外，突变生物合成也包括由于突变而引起产生另外，突变生物合成也包括由于突变而引起产生新的次级代谢产物。新的次级代谢产物。突变生物合成原理突变生物合成原理阻断突变株的类型阻断突变株的类型营养缺陷型突变株：营养缺陷型突变株： 由于编码菌体生长之必须的酶的基因发生了突由于编码菌体
19、生长之必须的酶的基因发生了突变，而使菌体不能生长，导致不能合成次级代变，而使菌体不能生长，导致不能合成次级代谢产物。因此，这类突变株也可以称为初级代谢产物。因此，这类突变株也可以称为初级代谢阻断突变株。谢阻断突变株。独需型突变株：独需型突变株： 这种突变株的生长和初级代谢正常，但由于编这种突变株的生长和初级代谢正常，但由于编码次级代谢产物合成的某一基因发生突变，而码次级代谢产物合成的某一基因发生突变，而使丧失了合成次级代谢产物的能力。这是突变使丧失了合成次级代谢产物的能力。这是突变生物合成所需要的突变株。生物合成所需要的突变株。双重阻断突变株：双重阻断突变株： 即突变既发生在编码初级代谢酶的基
20、因上，也即突变既发生在编码初级代谢酶的基因上，也发生在编码次级代谢酶的基因上。发生在编码次级代谢酶的基因上。突变生物合成与微生物新药发现突变生物合成与微生物新药发现.野生型产生菌野生型产生菌独需型突变株独需型突变株AB正常途径正常途径某抗生素某抗生素阻断变株阻断变株A阻断变株阻断变株BAB+BA+ABABA，B为某一抗生素分子结构的两个部分为某一抗生素分子结构的两个部分AB为发酵液培养时阻断变株的代谢产物为发酵液培养时阻断变株的代谢产物BA为发酵培养时添加的为发酵培养时添加的AB的结构类似物的结构类似物ABAB即为新的杂合抗生素即为新的杂合抗生素利用独需型突变株合成产生新抗生素的基本原理利用独
21、需型突变株合成产生新抗生素的基本原理突变生物合成的突变生物合成的基本流程基本流程.出发菌株的选择出发菌株的选择诱变处理诱变处理阻断突变株筛选阻断突变株筛选琼脂块法选择琼脂块法选择有生理活力的突变株有生理活力的突变株无生理活力的突变株无生理活力的突变株摇瓶复筛摇瓶复筛有生理活力的突变株有生理活力的突变株无生理活力的突变株无生理活力的突变株区段合成产物，连接区段合成产物，连接酶等生化特性的研究酶等生化特性的研究有区段合成产物、无有区段合成产物、无连接酶等活性的突变连接酶等活性的突变株株有区段产物有区段产物A有连接有连接酶等活性的突变株酶等活性的突变株有区段产物有区段产物B有连接有连接酶等活性的突变
22、株酶等活性的突变株发酵培养发酵培养添加结构类似物添加结构类似物A或或B样品收集样品收集TLC、HPLC检测及制备检测及制备结构检测结构检测突变生物合成产生的新抗生素突变生物合成产生的新抗生素.菌种菌种抗生素抗生素特殊营养特殊营养增补物增补物新抗生素新抗生素伊尼奥小单孢菌伊尼奥小单孢菌西梭霉素西梭霉素DOS链霉胺等链霉胺等突变霉素突变霉素1等等绛红小单孢菌绛红小单孢菌庆大霉素庆大霉素DOS链霉胺等链霉胺等2羟基羟基GM等等红霉素链霉菌红霉素链霉菌红霉素红霉素Erythronolide8，8 deoxyoleanolie未鉴别未鉴别弗氏链霉菌弗氏链霉菌新霉素新霉素DOS链霉胍等链霉胍等杂交霉素杂交
23、霉素A，B加利利链霉菌加利利链霉菌阿克拉霉素阿克拉霉素阿克拉酮阿克拉酮紫红霉酮等紫红霉酮等11羟基阿克拉霉羟基阿克拉霉素素A灰色链霉菌灰色链霉菌链霉素链霉素紫红霉酮等紫红霉酮等2脱氧链霉胍脱氧链霉胍streptomutin A卡那霉素链霉菌卡那霉素链霉菌卡那霉素卡那霉素DOS1N甲基甲基DOS等等1N甲基甲基GM等等雪白链霉菌雪白链霉菌新生霉素新生霉素氨基香豆氨基香豆氨基香豆素同系物氨基香豆素同系物未鉴明未鉴明核糖苷链霉菌核糖苷链霉菌核糖霉素核糖霉素DOS1N甲基甲基DOS等等1N甲基甲基RSMC等等普拉特链霉菌普拉特链霉菌普拉特霉素普拉特霉素PlatenolideNarbonolide5Om
24、ycaminosyl narbonolide龟裂链霉菌龟裂链霉菌巴龙霉素巴龙霉素DOS链霉胍链霉胍杂交霉素杂交霉素C巴龙链霉菌巴龙链霉菌尼可霉素尼可霉素尿嘧啶尿嘧啶嘧啶嘧啶尼可霉素尼可霉素Z等等唐德链霉菌唐德链霉菌红霉素生物红霉素生物合成途径合成途径.丙酮丙酮CoA丙酰丙酰SACP甲基丙二酰甲基丙二酰甲基丙二酰甲基丙二酰SACP丙酰丙酰丙酰丙酰SACP聚酮体途径聚酮体途径6脱氧红霉内脂脱氧红霉内脂B红霉内脂红霉内脂BTDPL碳霉糖碳霉糖 葡萄糖葡萄糖TDPD葡萄糖葡萄糖3O碳霉糖基红霉内脂碳霉糖基红霉内脂TDP脱氧氨基己糖脱氧氨基己糖 红霉素红霉素D红霉素红霉素C红霉素红霉素A红霉素红霉素E红
25、霉素红霉素B缩合酶缩合酶突变株产生的突变株产生的新蒽环类抗生素新蒽环类抗生素.OOORR1OHOHR2NH2OHH3C1234567891011121234564OCHOCH2CHOHCH3CHCH3CH2OHRR1R2道若霉素（原株产生）道若霉素（原株产生）OCHOCH3 3COCHCOCH3 3OHOH亚德里亚霉素（变株产生）亚德里亚霉素（变株产生）OCHOCH3 3COCHCOCH2 2OHOHOHOH1313双氢道若霉素（变株产生）双氢道若霉素（变株产生）OCHOCH3 3CHOHCHCHOHCH3 3OHOH1313双氢洋红霉素双氢洋红霉素OHOHCOCHCOCH3 3OHOH111
26、1去氧道若霉素（变株产生）去氧道若霉素（变株产生）OCHOCH3 3COCHCOCH2 2OHOHH H1111去氧亚德里亚霉素（变株产生）去氧亚德里亚霉素（变株产生）OCHOCH3 3CHCH2 2CHCH3 3H HBaumycinABaumycinA* *（原株产生）（原株产生）OCHOCH3 3CHCH2 2COCHCOCH3 3OHOHFeudomycinFeudomycin A A（变株产生）（变株产生）OCHOCH3 3CHCH2 2CHCH3 3OHOHFeudomycinFeudomycin B BOCHOCH3 3CHCH2 2COCHCOCH3 3OHOH突变株产生的一些
27、新的次级代谢产物突变株产生的一些新的次级代谢产物.原菌种原菌种原抗生素原抗生素突变株产生的新抗生素突变株产生的新抗生素普拉特链霉菌普拉特链霉菌普拉特霉素普拉特霉素demycarosyldemycarosyl普拉特霉素普拉特霉素9 9dehydromycarosyledehydromycarosyle普拉特霉素普拉特霉素波赛链霉菌波赛链霉菌紫产色链霉菌紫产色链霉菌柔红霉素柔红霉素烬灰红菌素烬灰红菌素阿霉素阿霉素烬灰红菌素烬灰红菌素X X波赛链霉菌波赛链霉菌baumycinbaumycinoxaunomycinoxaunomycin棘孢小单孢菌棘孢小单孢菌庆大霉素庆大霉素小诺霉素小诺霉素生金链霉菌
28、生金链霉菌四环素四环素去甲基四环素去甲基四环素生金链霉菌生金链霉菌金霉素金霉素去甲基金霉素去甲基金霉素龟裂链霉菌龟裂链霉菌土霉素土霉素去甲基土霉素去甲基土霉素吸水链霉菌吸水链霉菌carriomycincarriomycincarromycinAcarromycinA我国应用突变生物合成原理找到的小诺霉素我国应用突变生物合成原理找到的小诺霉素.OOOOHOHOH3CHNOHHOH2NNH2H2NCHR2R12H2SO4庆大霉素和小诺霉素的化学结构庆大霉素和小诺霉素的化学结构抗生素抗生素R1R2分子式分子式硫酸庆大霉素硫酸庆大霉素C1CH3NHCH3C21H43N5O72H2SO4硫酸庆大霉素硫酸
29、庆大霉素C1aHNH2C19H39N5O72H2SO4硫酸庆大霉素硫酸庆大霉素C2CH3NH2C20H41N5O72H2SO4小诺霉素小诺霉素HNHCH3C20H41N5O72H2SO4四、原生质体融合与微生物新药的发现四、原生质体融合与微生物新药的发现 微生物原生质体融合，即是指将双新株的微生物微生物原生质体融合，即是指将双新株的微生物细胞分别通过酶解脱壁，使之形成原生质体，然细胞分别通过酶解脱壁，使之形成原生质体，然后在高渗溶液的条件下混合，并加入物理的（如后在高渗溶液的条件下混合，并加入物理的（如电融合）或化学的电融合）或化学的( (如聚乙二醇如聚乙二醇) )或生物的（如仙或生物的（如仙
30、台病毒）助融条件，使双亲株的原生质发生相互台病毒）助融条件，使双亲株的原生质发生相互凝集，通过细胞质融合，核融合，尔后发生基因凝集，通过细胞质融合，核融合，尔后发生基因组间的交换，重组，进而可以在适宜的条件下再组间的交换，重组，进而可以在适宜的条件下再生出微生物细胞壁，获得重组子的过程。生出微生物细胞壁，获得重组子的过程。四、原生质体融合与微生物新药的发现四、原生质体融合与微生物新药的发现n利用微生物厚生质融合寻找新抗生素的基利用微生物厚生质融合寻找新抗生素的基本原理是来源于两种已知产生不同抗生素本原理是来源于两种已知产生不同抗生素的产生菌的融合子，有可能将它们的部分的产生菌的融合子，有可能将
31、它们的部分生物合成基因整合在一起而产生新的杂合生物合成基因整合在一起而产生新的杂合抗生素；另一个原理是由于抗生素产生菌抗生素；另一个原理是由于抗生素产生菌中存在着沈默基因，当这些沉默基因受到中存在着沈默基因，当这些沉默基因受到外源物质刺激后，有可能被激活而产生，外源物质刺激后，有可能被激活而产生，结构与亲株完全不同的新的抗生素。结构与亲株完全不同的新的抗生素。 四、原生质体融合与微生物新药的发现四、原生质体融合与微生物新药的发现 应用这种方法获得的第一个新抗生素是吲应用这种方法获得的第一个新抗生素是吲哚佐霉素（哚佐霉素（indloizomycinindloizomycin）：）： 其亲株为链霉
32、素产生菌灰色霉菌和天神霉其亲株为链霉素产生菌灰色霉菌和天神霉素（素（istamycinistamycin）产生菌天神链霉菌）产生菌天神链霉菌S.tenjimariensisS.tenjimariensis。（目前的报道较少）（目前的报道较少） 组合生物合成组合生物合成 组合生物合成的潜能组合生物合成的潜能 potentialpotentialn重组、组合、互补、替换重组、组合、互补、替换n R=R=可利用的基因可利用的基因 n= n=基因的等位形基因的等位形式式n化合物数化合物数R Rn nn R=4, n=4 R=4, n=4n Compounds=4 Compounds=44 4=256=
33、256组合生物合成的原理组合生物合成的原理 生物合成酶基因的结构和组成生物合成酶基因的结构和组成 生物合成酶基因的特异性及底物宽容性生物合成酶基因的特异性及底物宽容性 生物合成酶基因之间的相互作用生物合成酶基因之间的相互作用 生物合成途径的研究基础生物合成途径的研究基础一、具有聚酮体生物合成途径的一、具有聚酮体生物合成途径的微生物药物产生菌的组合生物合成微生物药物产生菌的组合生物合成 基于商业性的原因，迄今为止，对一些具有基于商业性的原因，迄今为止，对一些具有聚聚酮体生物合成（酮体生物合成（polyketide synthasespolyketide synthases，PKSsPKSs）途径
34、的途径的“天然产物天然产物”，如红霉素、阿维菌素、，如红霉素、阿维菌素、泰乐菌素、柔红霉素、阿克拉霉素、西罗莫司泰乐菌素、柔红霉素、阿克拉霉素、西罗莫司和利福霉素等；和利福霉素等； 具具PKSPKS途径的抗生素途径的抗生素药物类别药物类别 化化 合合 物物 大环内酯类抗生素大环内酯类抗生素 红霉素、螺旋霉素、麦迪霉素红霉素、螺旋霉素、麦迪霉素四环类抗生素四环类抗生素 四环素、金霉素、土霉素四环素、金霉素、土霉素抗肿瘤抗生素抗肿瘤抗生素 柔红霉素，阿克拉霉素、柔红霉素，阿克拉霉素、enediynesenediynes 抗寄生虫药抗寄生虫药 avermectinavermectin，nemadec
35、tinnemadectin 免疫抑制剂免疫抑制剂 FK506, rapamycin FK506, rapamycin 抗真菌药抗真菌药 两性霉素，制霉菌素两性霉素，制霉菌素心血管药物心血管药物 lovastatin,lovastatin,，compactincompactin兽药兽药莫能星（莫能星（monensinmonensin），泰乐菌素），泰乐菌素 (tylosin(tylosin) )，盐霉素，盐霉素1 1、红霉素产生菌的组合生物合成、红霉素产生菌的组合生物合成 通过操作通过操作PKSPKS的模块中的模块中单个基因单个基因的组合生物的组合生物合成；合成； 在在非天然产物产生菌非天然产物
36、产生菌中过量表达组合生物中过量表达组合生物合成产物；合成产物； 通过操作通过操作PKSPKS模块之间连接模块之间连接的组合生物合的组合生物合成成 ； 通过操作通过操作脱氧糖途径基因脱氧糖途径基因的组合生物合成。的组合生物合成。红霉素产生菌的组合生物合成的可能性红霉素产生菌的组合生物合成的可能性n参与红霉素生物合成的参与红霉素生物合成的PKSsPKSs，或，或6 6脱氧红霉内酯脱氧红霉内酯合成酶（合成酶（6-deoxyerythronolide B synthase6-deoxyerythronolide B synthase，DEBSDEBS）有）有6 6个模块组成，每个模块负责合成聚酮体个模
37、块组成，每个模块负责合成聚酮体中的一部分。中的一部分。n由于各模块之间的协调性，以及每个模块编码决由于各模块之间的协调性，以及每个模块编码决定延伸单位的选择、功能和立体化学性质的催化定延伸单位的选择、功能和立体化学性质的催化结构域，因此，就有可能通过对结构域，因此，就有可能通过对PKSsPKSs结构域或模结构域或模块的操作获得具有新颖结构的化合物。块的操作获得具有新颖结构的化合物。n由于具有聚酮体结构的化合物其结构非常复杂和由于具有聚酮体结构的化合物其结构非常复杂和具有众多的立体异构体，因而，难以用常规的化具有众多的立体异构体，因而，难以用常规的化学方法来获得。学方法来获得。 红红霉霉素素的的
38、生生物物合合成成途途径径 PKSPKS中的每一个模块的组成中的每一个模块的组成n酮基合成酶（酮基合成酶（ketosynthaseketosynthase，KSKS）n酰基转移酶（酰基转移酶（acyl transferaseacyl transferase，ATAT）n酰基载体蛋白（酰基载体蛋白（acylacyl carrier protein carrier protein，ACPACPn-酮基修饰酶：包括酮基还原酶酮基修饰酶：包括酮基还原酶（ketoreductaseketoreductase，KRKR）、脱氢酶）、脱氢酶（dehydrogenasedehydrogenase，DHDH）和烯
39、酰还原酶）和烯酰还原酶（enoylreductaseenoylreductase，ERER）nDEBSDEBS含有编码三个独立的多肽亚单位的含有编码三个独立的多肽亚单位的6 6个模块个模块n大多数典型的聚酮体合成途径的产物包括对大多数典型的聚酮体合成途径的产物包括对PKSPKS产产物的修饰，如将脱氧糖或氨基糖进行糖苷化以及物的修饰，如将脱氧糖或氨基糖进行糖苷化以及通过细胞色素通过细胞色素P450P450进行氧化。图中所示的进行氧化。图中所示的LDLD为装为装载域（载域（loading domainsloading domains），），TETE为硫酯酶为硫酯酶（esterasesesteras
40、es）。）。 1 1）通过操作）通过操作PKSPKS的模块中单个基因的组合生物合成的模块中单个基因的组合生物合成 一是用利福霉素一是用利福霉素PKSPKS模模块块2 2中的中的DH/ER/KRDH/ER/KR结构结构域取代红霉素域取代红霉素PKSPKS模块模块2 2中的中的KRKR；二是将模块二是将模块5 5中的中的KRKR缺缺失；失；三是用利福霉素模块三是用利福霉素模块2 2中的丙二酰特异性中的丙二酰特异性ATAT取代模块取代模块6 6中的甲基中的甲基丙二酰特异性的丙二酰特异性的ATAT），将得到一个发），将得到一个发生三重突变的生三重突变的PKSPKS产物。产物。 2）在非天然产物产生菌中
41、过量）在非天然产物产生菌中过量表达组合生物合成产物表达组合生物合成产物 n将将E.coliE.coli 开发成能够表达开发成能够表达PKSPKS产物需要解产物需要解决的问题主要有三个方面：决的问题主要有三个方面：n一是能够功能性表达巨大的蛋白一是能够功能性表达巨大的蛋白（330kDa330kDa）；）；n二是二是PKSPKS亚单位的亚单位的ACPACP结构域的翻译后磷酸结构域的翻译后磷酸泛酰巯基乙胺酰化；泛酰巯基乙胺酰化；n三是聚酮体途径中的前体物质，特别是三是聚酮体途径中的前体物质，特别是（2S2S）甲基丙二酰）甲基丙二酰CoACoA在在E.coliE.coli中不存中不存在。在。 Pfei
42、ferPfeifer等的工作包括：等的工作包括：n运用来源于枯草芽孢杆菌非核糖体多肽合成酶运用来源于枯草芽孢杆菌非核糖体多肽合成酶（NRPSNRPS）基因簇的磷酸泛酰巯基乙胺酰转移酶）基因簇的磷酸泛酰巯基乙胺酰转移酶（phosphopantetheinyl transferasephosphopantetheinyl transferase）基因）基因sfpsfp，以对以对PKSPKS亚单位的亚单位的ACPACP结构域的翻译后磷酸泛酰巯结构域的翻译后磷酸泛酰巯基乙胺酰化；基乙胺酰化；n过量表达过量表达E.coliE.coli中的丙酰中的丙酰CoACoA合成酶基因合成酶基因prpEprpE，扰乱
43、丙酰扰乱丙酰CoACoA代谢途径，以及过量表达来自代谢途径，以及过量表达来自S.coelicolarS.coelicolar的丙酰的丙酰CoACoA羧化酶基因羧化酶基因pccpcc，使丙，使丙酰酰CoACoA转化为（转化为（2S2S）甲基丙二酰）甲基丙二酰CoACoA 3 3）通过操作）通过操作PKSPKS模块之间连接的组合生物合成模块之间连接的组合生物合成 n通过对通过对DEBSDEBS模块在模块在E.coliE.coli和体外的表达研究，发和体外的表达研究，发现在现在PKSPKS装配过程中那些短的模块内和多肽内的装配过程中那些短的模块内和多肽内的“连接件连接件”是至关重要的成分。研究发现在
44、相继是至关重要的成分。研究发现在相继非共价连接的模块中，其氨基和羧基末端存在有非共价连接的模块中，其氨基和羧基末端存在有多肽内连接件，这种连接件与单个多肽内的模块多肽内连接件，这种连接件与单个多肽内的模块之间的连接件不同。之间的连接件不同。n因此，使用一种合适的连接件就有可能允许杂合因此，使用一种合适的连接件就有可能允许杂合的模块之间进行功能性连接。的模块之间进行功能性连接。 a a：已经鉴定了不同的：已经鉴定了不同的模块内和多肽内的连接模块内和多肽内的连接件，并由此指导合成模件，并由此指导合成模块之间的聚酮体中间体，块之间的聚酮体中间体，这里需要合适的氨基和这里需要合适的氨基和羧基末端连接配
45、对，以羧基末端连接配对，以产生功能性连接模块；产生功能性连接模块；b b：在构建功能性互补：在构建功能性互补体时，可以使用编码来体时，可以使用编码来源于不同微生物多个模源于不同微生物多个模块的全亚基；块的全亚基；如图所示：来源于苦霉如图所示：来源于苦霉素（素（picromycinpicromycin）的）的PKSPKS（PikAIPikAI和和PikAIIPikAII），），与来源于竹桃霉素与来源于竹桃霉素（oleandomycinoleandomycin）的）的PKSPKS（OleA3OleA3）相结合。）相结合。 4 4）通过操作脱氧糖途径基因的组合生物合成）通过操作脱氧糖途径基因的组合生
46、物合成n对已经发现的由自然界中植物、真菌和细菌产生对已经发现的由自然界中植物、真菌和细菌产生的很多具有生理活性的糖苷类化合物的分析发现，的很多具有生理活性的糖苷类化合物的分析发现，连接在苷元上的糖基的结构大多为连接在苷元上的糖基的结构大多为6-6-脱氧己糖脱氧己糖（6-deoxyhexoses, 6DOHs6-deoxyhexoses, 6DOHs）。）。n据统计，这些具有生理活性的糖苷类化合物的结据统计，这些具有生理活性的糖苷类化合物的结构上含有构上含有7070多种不同的多种不同的6-6-脱氧己糖。脱氧己糖。6-脱氧己糖的种类脱氧己糖的种类具有生理活性的化合物具有生理活性的化合物产生菌产生菌
47、*D-Desosamine红霉素红霉素竹桃霉素竹桃霉素苦霉素苦霉素巨大霉素巨大霉素Sacc.erythraeaS.antibioticusS.VenezuelaeM.megalomiceaD-Olivose光辉霉素光辉霉素乌达霉素乌达霉素Landomycin S.argillaceusS.fradiaeS.cyanogenusD-Oliose光辉霉素光辉霉素S.argillaceusD-Mycarose光辉霉素光辉霉素S.argillaceusD-Mycaminose泰乐星泰乐星S.fradiaeD-Mycinose泰乐星泰乐星S.fradiaeD-Mycosamine制霉菌素制霉菌素S.no
48、urseiL-Dihydrostreptose链霉素链霉素S.griseusL-Oleandrose竹桃霉素竹桃霉素阿弗米丁阿弗米丁S.antibioticusS.avermitillisL-Mycarose红霉素红霉素巨大霉素巨大霉素泰乐星泰乐星Sacc.erythraeaM.megalomiceaS.fradiaeL-Noviose新生霉素新生霉素S.spheroidesL-Rhodinose乌达霉素乌达霉素LandomycinGranaticin S.fradiaeS.cyanogenusS.violaceoruberL-Daunosamine柔红霉素柔红霉素S.peucetiusL-N
49、ogaloseNogalamycin S.nogalaterL-Megosamine*巨大霉素巨大霉素M.megalomiceaL-Rhodosamine阿克拉霉素阿克拉霉素S.galilaeusL-EpivancosamineChloroeremomycin A.orientalis2-Deoxy-L-fucose阿克拉霉素阿克拉霉素S.galilaeusOOOOOOOOOOD-DeoxyhexosesCH3N(CH3)2OHOHOHohOHOHOHOHOHOHCH3CH3OHCH3OHOMeOMeCH3N(CH3)2OHOHCH3N(CH3)2OHCH3CH3OHOHOHCH3OMeOHC
50、H3OHOHCH3OHNH2OHNH2OHCH3OHD-Forosamine D-Oliose D-Mycinose D-MycaminoseD-Desosamine D-Mycarose D-Chalcose D-OlivoseD-Perosamine D-MycosamineOOOOOOOOCH3OHOHOHOHOHOHOHOHOHOHOHOMeCH3OHCH3OHNH2OHN(CH3)2CH3CH3OHOHCH3CH3OMeOHCH3CH3CH3OHOHOHCH3OHOHOHCH3OHOHOHNH2CH3CH3OHL-Deoxyhexoses L-Oleandrose L-Rhodino
