1、基因重组技术21 概述概述1.1 定义定义 基因重组技术基因重组技术是一种在分子水平上按照人们设是一种在分子水平上按照人们设计的蓝图对基因进行人工操作的技术，具体地说，计的蓝图对基因进行人工操作的技术，具体地说，就是从一种细胞中把目的基因提取出来，在体外把就是从一种细胞中把目的基因提取出来，在体外把它和一种载体分子连接，然后用人工的方法将这种它和一种载体分子连接，然后用人工的方法将这种杂种杂种DNA分子引入到另一种细胞中去，让其大量复分子引入到另一种细胞中去，让其大量复制繁殖或产生大量基因表达产物。制繁殖或产生大量基因表达产物。3别称别称： 基因工程（基因工程（Gene engineering
2、） DNA重组重组 (DNA recombination) 遗传工程遗传工程 (Genetic engineering) 基因操作基因操作 (Gene manipulation) 基因克隆基因克隆 (Gene cloning) 分子克隆分子克隆 (Molecular cloning) 4目的基因的分离；目的基因的分离；重组载体的选择和制备；重组载体的选择和制备；目的基因与载体的重组；目的基因与载体的重组；重组体导入受体细胞；重组体导入受体细胞；重组克隆的筛选与鉴定；重组克隆的筛选与鉴定；目的基因在受体细胞中的表达及表达产物的分离纯化。目的基因在受体细胞中的表达及表达产物的分离纯化。3 基因重组
3、技术基因重组技术1 概述概述1.2 基因重组技术的主要内容和步骤基因重组技术的主要内容和步骤基因重组技术的主要内容基因重组技术的主要内容5分离分离重组重组转化转化表达表达筛选筛选 载体载体基因重组技术的主要步骤基因重组技术的主要步骤6 定义定义 是一类以环状或线性双链是一类以环状或线性双链DNA为底物，能识别为底物，能识别DNA中特定核苷酸序列，并在合适反应条件下使中特定核苷酸序列，并在合适反应条件下使每条链的一个磷酸二酯键断开，产生具每条链的一个磷酸二酯键断开，产生具3-OH和和5-P基团基团DNA片段的内脱氧核苷酸酶片段的内脱氧核苷酸酶(endo-deoxyribonuclease)。 简
4、称简称 限制性内切酶、限制酶、内切酶。限制性内切酶、限制酶、内切酶。3 基因重组技术基因重组技术2 基因重组技术的工具酶基因重组技术的工具酶2.1 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶(Restriction endonuclease)分子剪刀分子剪刀7 种类种类 目前，已从近目前，已从近300种不同的微生物分种不同的微生物分离出约离出约500种种限制性核酸内切酶。限制性核酸内切酶。类型类型（ 三种类型）三种类型） 型酶、型酶、 型酶和型酶和 型酶。型酶。 若无说明，通常的若无说明，通常的限制性核酸内切限制性核酸内切酶就是指酶就是指 型酶型酶。8 三种核酸限制性内切酶的主要特性比较三种核酸限制性内
5、切酶的主要特性比较特特 性性I 型酶型酶II 型酶型酶III 型酶型酶酶分子的结构与功能酶分子的结构与功能三亚基多功能的酶三亚基多功能的酶单一功能的酶单一功能的酶二亚基双功能酶二亚基双功能酶辅助因子辅助因子ATP、Mg2+、S-腺苷腺苷甲硫氨酸（甲硫氨酸（SAM）Mg2+ATP、Mg2+、S-腺腺苷甲硫氨酸苷甲硫氨酸识别序列识别序列特异性，非对称序列特异性，非对称序列特异性，旋转对称特异性，旋转对称特异性，非对称序列特异性，非对称序列切割位点切割位点距特异性位点至少距特异性位点至少1000 bp处随机切割处随机切割在识别序列内部或在识别序列内部或附近特异切割附近特异切割距识别序列下游距识别序列
6、下游24 26bp处切割处切割在在DNA克隆中的用途克隆中的用途无用无用十分有用十分有用有用有用9识别序列识别序列 定义定义 限制性核酸内切酶在双链限制性核酸内切酶在双链DNA分子上能识别的分子上能识别的特定核苷酸序列。又称为识别位点、靶位点或切割特定核苷酸序列。又称为识别位点、靶位点或切割位点。位点。 长度长度 4、5、6或或7个核苷酸。个核苷酸。 结构特点结构特点 具有双重旋转对称结构，即：回文结构具有双重旋转对称结构，即：回文结构（palindromic sequence）。）。 GAATTC CTTAAG5353Eco RI 10切割方式切割方式已知大多数已知大多数II型限制性核酸内切
7、酶在其识别序列内部型限制性核酸内切酶在其识别序列内部切割双链切割双链DNA，水解磷酸二酯键中的，水解磷酸二酯键中的3位的酯键，位的酯键，产生产生3端为羟基、端为羟基、5端为磷酸基团的片段。端为磷酸基团的片段。切割后形成切割后形成3种不同末端结构的种不同末端结构的DNA片段：片段：在识别序列的对称轴上同时切割，形成在识别序列的对称轴上同时切割，形成平头末端平头末端（blunt end），如），如Hae III；在识别序列的双侧末端切割，若于对称轴的在识别序列的双侧末端切割，若于对称轴的5末端切割，末端切割，可产生可产生5端突出的末端端突出的末端，如，如Eco RI；在识别序列的双侧末端切割，若于
8、对称轴的在识别序列的双侧末端切割，若于对称轴的3末端切割，末端切割，可产生可产生3端突出的末端端突出的末端，如，如Pst I。任何一种任何一种II型酶产生的两个突出末端，都能在适当温度型酶产生的两个突出末端，都能在适当温度下，退火互补，因此这种末端称为下，退火互补，因此这种末端称为黏性末端黏性末端（cohesive end）。）。1112限制性核酸内切酶在基因重组中的用途限制性核酸内切酶在基因重组中的用途1. 分割基因组分割基因组DNA;132. 获得分子重组所必获得分子重组所必需的末端；需的末端；限制性内切酶在基因工程中的用途限制性内切酶在基因工程中的用途AABA+BB14 定义：能催化双链
9、定义：能催化双链DNA分子中相邻的分子中相邻的5-P与与3 -OH之间形成磷酸二酯键的酶。之间形成磷酸二酯键的酶。 活性：封闭缺口活性：封闭缺口(nick)，不能封闭裂口，不能封闭裂口(gap)。3 基因重组技术基因重组技术2 基因重组技术的工具酶基因重组技术的工具酶2.2 DNA连接酶（连接酶（DNA ligase）分子浆糊分子浆糊15两种两种DNA连接酶比较连接酶比较DNA连接酶连接酶T4 DNA连接酶连接酶来源来源大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌T4噬菌体噬菌体辅助因子辅助因子NAD+ATP功能功能缺口（缺口（nick）修补修补缺口修补和平头末端连缺口修补和平头末端连接接16T4 DNA
10、连接酶在基因重组中的用途连接酶在基因重组中的用途 补缺口补缺口 平头末端连接平头末端连接 粘性末端连接粘性末端连接17磷酸二酯法合成寡核苷酸磷酸二酯法合成寡核苷酸磷酸三酯法合成寡核苷酸磷酸三酯法合成寡核苷酸固相亚磷酸三酯法合成寡核苷酸固相亚磷酸三酯法合成寡核苷酸3 基因重组技术基因重组技术3 目的基因的分离目的基因的分离1 基因的化学合成基因的化学合成局限性：局限性： 目前，化学合成寡核苷酸片段的能力一般局限于目前，化学合成寡核苷酸片段的能力一般局限于150200bp以内。然而，绝大多数基因的大小都超以内。然而，绝大多数基因的大小都超过了这个范围。因此，需要一种特殊的程序，才能过了这个范围。因
11、此，需要一种特殊的程序，才能够把合成的寡核苷酸片段构建成完整的基因。够把合成的寡核苷酸片段构建成完整的基因。18寡核苷酸片段组装基因的方式寡核苷酸片段组装基因的方式基因的组装：按设计要求用许多寡核苷酸片段装基因的组装：按设计要求用许多寡核苷酸片段装配成完整基因的过程。配成完整基因的过程。第一种方法是先将寡核苷酸第一种方法是先将寡核苷酸激活，带上必要的激活，带上必要的5-P基团，基团，然后再与相应的互补寡核苷然后再与相应的互补寡核苷酸片段退火，形成带有粘性酸片段退火，形成带有粘性末端的双链寡核苷酸片段。末端的双链寡核苷酸片段。把这些双链寡核苷酸片段混把这些双链寡核苷酸片段混合在一个试管中，加上合
12、在一个试管中，加上T4 DNA连接酶，使它们彼此连连接酶，使它们彼此连接组成一个完整的基因或者接组成一个完整的基因或者是基因的一个片段。是基因的一个片段。19寡核苷酸片段组装基因的方式寡核苷酸片段组装基因的方式第二种方法是尽可能的第二种方法是尽可能的减少合成寡核苷酸片段减少合成寡核苷酸片段的用量。将两条具有互的用量。将两条具有互补补3末端的长的寡核苷末端的长的寡核苷酸片段彼此退火，所产酸片段彼此退火，所产生的单链区域以生的单链区域以3-OH为引物，用为引物，用DNA聚合酶聚合酶处理，便会合成出相应处理，便会合成出相应的互补链。的互补链。20概念：概念：(Gene bank；Gene libra
13、ry)将一个基因组的将一个基因组的DNA用限制酶切割成适当大小用限制酶切割成适当大小的片段，并进行克隆化，从而形成的含有重组的片段，并进行克隆化，从而形成的含有重组DNA分子的群体。分子的群体。3 基因重组技术基因重组技术3 目的基因的分离目的基因的分离2 构建基因文库法构建基因文库法21基因文库的构建过程基因文库的构建过程22几个相关概念几个相关概念DNA双螺旋结构的生物功能主要在于复制和转录。双螺旋结构的生物功能主要在于复制和转录。加热或变性作用可以使加热或变性作用可以使DNA双螺旋的氢键断裂，双双螺旋的氢键断裂，双链解离，形成单链链解离，形成单链DNA，这称为，这称为DNA变性变性（de
14、nature）。）。解除变性条件之后，变性的单链可以重新结合起来，解除变性条件之后，变性的单链可以重新结合起来，形成双链，此过程称为形成双链，此过程称为DNA复性复性（renature），也），也叫叫退火退火（annealing）。变性和复性在一定条件下是）。变性和复性在一定条件下是完全可逆的。完全可逆的。DNA双链解离一半时的温度叫做双链解离一半时的温度叫做解链温度解链温度（melting temperature，Tm）。）。3 基因重组技术基因重组技术3 目的基因的分离目的基因的分离3 PCR制备基因制备基因233 基因重组技术基因重组技术3 目的基因的分离目的基因的分离3 PCR制备基因
15、制备基因原理：原理：聚合酶链式反应（聚合酶链式反应（PCR）是一种特定区段的）是一种特定区段的DNA复复制，必须有制，必须有DNA模板（模板（template）、）、DNA聚合酶聚合酶（DNA polymerase）、）、DNA引物（引物（primer）、四种）、四种dNTP和和Mg2。要扩增模板要扩增模板DNA中的中的AB区间的区间的DNA片段，首先要片段，首先要设计两条寡核苷酸引物，而设计两条寡核苷酸引物，而PCR扩增扩增DNA的特异性的特异性和长度就由人工合成的这两条引物决定。引物和长度就由人工合成的这两条引物决定。引物1和引和引物物2这段这段DNA的序列是已知的，这是的序列是已知的，这
16、是PCR扩增的必要扩增的必要条件。条件。243 基因重组技术基因重组技术3 目的基因的分离目的基因的分离3 PCR制备基因制备基因步骤：步骤：PCR是通过是通过3个温度依赖性步骤完成的反复循环。其反应个温度依赖性步骤完成的反复循环。其反应主要分主要分3步进行：步进行：1. 变性变性，即双链，即双链DNA在在94下通过热变性使其双链间氢下通过热变性使其双链间氢键断裂而解离成单链。键断裂而解离成单链。2. 退火退火，即当变性温度突然降至引物，即当变性温度突然降至引物Tm值以下时，引物值以下时，引物与模板与模板DNA互补序列杂交。互补序列杂交。 延伸延伸，即在，即在DNA聚合酶、聚合酶、4种脱氧核糖
17、核苷酸、底物及种脱氧核糖核苷酸、底物及Mg2存在的条件下，存在的条件下，DNA聚合酶依赖其聚合酶依赖其53的聚合酶的聚合酶活力，以引物为起始，互补的活力，以引物为起始，互补的DNA链为模板，使引物序链为模板，使引物序列得以延伸，形成模板列得以延伸，形成模板DNA的互补链。经过高温变性、的互补链。经过高温变性、低温退火、中温延伸低温退火、中温延伸3个温度的循环，模板上介于两引物个温度的循环，模板上介于两引物之间的片断不断扩展。之间的片断不断扩展。252627 载体载体(vector)的定义：的定义： 在基因重组中，可与外源在基因重组中，可与外源DNA片段构成重组体，片段构成重组体，并能将重组体并
18、能将重组体DNA导入受体细胞，使外源导入受体细胞，使外源DNA得以复得以复制或表达的制或表达的DNA分子。分子。 载体应具备的基本特性：载体应具备的基本特性： 在宿主细胞中能独立复制；在宿主细胞中能独立复制； 具一段不影响其复制的非必需区域；具一段不影响其复制的非必需区域； 具具1 2个选择标记；个选择标记； 分子量小，易操作；分子量小，易操作； 多拷贝；多拷贝； 安全可靠。安全可靠。3 基因重组技术基因重组技术4 基因重组技术的载体基因重组技术的载体4.1 载体的定义和基本特性载体的定义和基本特性28 来源与性质的不同来源与性质的不同 质粒载体质粒载体 噬菌体载体噬菌体载体 黏粒载体黏粒载体
19、 噬菌粒载体噬菌粒载体 病毒载体病毒载体 人工染色体等人工染色体等功能和用途不同功能和用途不同 克隆载体用于克隆载体用于DNA片段的扩增片段的扩增 表达载体可在寄主细胞中表达性状表达载体可在寄主细胞中表达性状 穿梭质粒可转化两种以上寄主细胞穿梭质粒可转化两种以上寄主细胞3 基因重组技术基因重组技术4 基因重组技术的载体基因重组技术的载体4.2 载体的种类载体的种类29根据受体细胞不同根据受体细胞不同 大肠杆菌载体大肠杆菌载体 酵母载体酵母载体 动物基因工程载体动物基因工程载体 植物基因工程载体植物基因工程载体等等3 基因重组技术基因重组技术4 基因重组技术的载体基因重组技术的载体4.2 载体的
20、种类载体的种类30质粒质粒(plasmid)的定义的定义 ： 质粒是染色体外能自我复制的小型质粒是染色体外能自我复制的小型DNA分子。广分子。广泛存在于细菌细胞中，也存在于霉菌、蓝藻、酵母和泛存在于细菌细胞中，也存在于霉菌、蓝藻、酵母和少数动植物细胞中，甚至线粒体中都发现有质粒的存少数动植物细胞中，甚至线粒体中都发现有质粒的存在。在。注意：酵母的杀伤质粒（注意：酵母的杀伤质粒（killer plasmid）为）为RNA质质粒。粒。3 基因重组技术基因重组技术4 基因重组技术的载体基因重组技术的载体4.3 质粒载体质粒载体质粒载体质粒载体是基因重组中最常用的载体，主要是以细是基因重组中最常用的载
21、体，主要是以细菌质粒的各种元件为基础组建而成的。它必须包含菌质粒的各种元件为基础组建而成的。它必须包含有三种共同的组成部分：复制必须区、选择标记基有三种共同的组成部分：复制必须区、选择标记基因和限制性核酸内切酶的酶切位点（克隆位点）。因和限制性核酸内切酶的酶切位点（克隆位点）。31克隆质粒载体克隆质粒载体专用于基因或专用于基因或DNADNA片段无性繁殖的质粒载体。片段无性繁殖的质粒载体。选择标选择标记基因记基因克隆位克隆位点点复制必复制必需区需区保证质粒拷贝保证质粒拷贝数数便于插入外源便于插入外源DNA筛选重组子筛选重组子3 基因重组技术基因重组技术4 基因重组技术的载体基因重组技术的载体4.
22、3 质粒载体质粒载体32表达质粒载体表达质粒载体专用于在宿主细胞中高水平表达外源蛋白质的质粒载专用于在宿主细胞中高水平表达外源蛋白质的质粒载体。除了具有克隆质粒载体的三个基本构件外，还需体。除了具有克隆质粒载体的三个基本构件外，还需要有能控制插入的外源基因进行有效转录的序列以及要有能控制插入的外源基因进行有效转录的序列以及适当的翻译调控序列。适当的翻译调控序列。启动子启动子 PLac来源于大肠杆菌（乳糖操纵子）、来源于大肠杆菌（乳糖操纵子）、 PTrp(色氨酸操纵子色氨酸操纵子) PTac（来源于（来源于Lac和和Trp的杂合启动子）的杂合启动子）强转录终止序列强转录终止序列核糖体结合位点（核
23、糖体结合位点（S-D序列）、起始密码子、终序列）、起始密码子、终密码止子密码止子等等3 基因重组技术基因重组技术4 基因重组技术的载体基因重组技术的载体4.3 质粒载体质粒载体33pGEX表达质粒载体表达质粒载体34酵母是一类单细胞的真核生物，作为一种真核生物酵母是一类单细胞的真核生物，作为一种真核生物表达系统，其表达系统，其优势优势在于：在于：基因表达调控机理比较清楚，遗传操作相对简单；基因表达调控机理比较清楚，遗传操作相对简单；具有真核生物蛋白翻译后修饰加工系统；具有真核生物蛋白翻译后修饰加工系统；不含有特异性病毒，不产毒素，较为安全；不含有特异性病毒，不产毒素，较为安全；发酵工艺简单，成
24、本低廉；发酵工艺简单，成本低廉；能将外源基因表达产物分泌至培养基中。能将外源基因表达产物分泌至培养基中。3 基因重组技术基因重组技术4 基因重组技术的载体基因重组技术的载体4.4 酵母载体酵母载体35按载体在酵母细胞中的复制形式按载体在酵母细胞中的复制形式分类分类酵母整合载体（酵母整合载体（yeast integrating vector）酵母人工染色体（酵母人工染色体（yeast artificial chromosome）质粒载体质粒载体酵母附加型质粒（酵母附加型质粒（yeast episomal plasmid, YEp）酵母复制质粒（酵母复制质粒（yeast replicating p
25、lasmid, YRp）酵母着丝粒质粒（酵母着丝粒质粒（yeast centromere plasmid, YCp）3 基因重组技术基因重组技术4 基因重组技术的载体基因重组技术的载体4.4 酵母载体酵母载体3637主要由动物病毒构建的一类载体。主要由动物病毒构建的一类载体。例如：例如：SV40病毒载体、反转录病毒载体、杆状病毒载体、反转录病毒载体、杆状病毒载体、病毒载体、痘苗病毒载体痘苗病毒载体、腺病毒载体、乳头、腺病毒载体、乳头状病毒载体、单纯疱疹病毒载体等。状病毒载体、单纯疱疹病毒载体等。3 基因重组技术基因重组技术4 基因重组技术的载体基因重组技术的载体4.5 动物基因工程载体动物基因
26、工程载体38痘苗病毒具有线性双链痘苗病毒具有线性双链DNA，其转录和复制都在细胞，其转录和复制都在细胞 质中。质中。痘苗病毒基因组痘苗病毒基因组DNA分子量大（分子量大（180kb），操作起），操作起 来很不方便，不适于直接用作基因克隆的载体。来很不方便，不适于直接用作基因克隆的载体。痘苗病毒基因组中有一痘苗病毒基因组中有一Hind -J片段，当其被外源片段，当其被外源 DNA取代之后不会影响到病毒基因组的复制能力。取代之后不会影响到病毒基因组的复制能力。痘苗病毒载体的特点：痘苗病毒载体的特点：3 基因重组技术基因重组技术4 基因重组技术的载体基因重组技术的载体4.5 动物基因工程载体动物基因
27、工程载体39痘苗病毒载体痘苗病毒载体40痘苗病毒载体痘苗病毒载体4142 载体与外源载体与外源DNA用同一种限制酶处理后得到相同用同一种限制酶处理后得到相同的粘性末端，碱基可以配对，由的粘性末端，碱基可以配对，由T4 DNA连接酶催化，连接酶催化，进行两种进行两种DNA分子间的共价连接，形成重组体分子。分子间的共价连接，形成重组体分子。3 基因重组技术基因重组技术目的基因与载体的重组目的基因与载体的重组43外源外源DNA质质粒粒酶切位点酶切位点酶切酶切酶切酶切混合混合DNA连接酶连接酶44 方法：方法：重组体向细菌细胞的导入重组体向细菌细胞的导入 化学转化法化学转化法 电击转化法电击转化法重组
28、体向动物细胞的导入重组体向动物细胞的导入病毒转染法等病毒转染法等3 基因重组技术基因重组技术5 重组体导入受体细胞重组体导入受体细胞转化（转化（transformation）转染（转染（transfection）转导（转导（transduction）45 概念概念: 细菌细胞经过一定浓度的冰冻细菌细胞经过一定浓度的冰冻CaCl2处理处理( - 4) ，便处于容易摄取各种外源便处于容易摄取各种外源DNA或噬菌体的状态，称为感或噬菌体的状态，称为感受态（受态（compentnt）。）。受体：细菌受体：细菌转化效率（转化效率（细菌）细菌） 转化效率为转化效率为106-107转化子转化子/g DNA。
29、转化子：导入外源转化子：导入外源DNA后获得了新的遗传标志的细菌细后获得了新的遗传标志的细菌细胞或其它受体细胞。胞或其它受体细胞。3 基因重组技术基因重组技术5 重组体导入受体细胞重组体导入受体细胞5.1 CaCl2感受态法感受态法化学转化法化学转化法46 概念概念: 将宿主细胞（或将宿主细胞（或 DNA受体细胞）与受体细胞）与 DNA分子置于一个高分子置于一个高强电场内，通过电场脉冲使宿主细胞发生电穿孔作用，使外源强电场内，通过电场脉冲使宿主细胞发生电穿孔作用，使外源DNA分子随即进入的方法。分子随即进入的方法。 受体：细菌、真核生物受体：细菌、真核生物 转化效率（转化效率（细菌）细菌） 小
30、质粒：小质粒：109 转化子转化子/微克微克DNA; 大质粒（大质粒（100kb）：）：106 转化子转化子/ g DNA。 3 基因重组技术基因重组技术5 重组体导入受体细胞重组体导入受体细胞5.2 电击转化法电击转化法47借助病毒转染细胞来实现外源基因的转移是病借助病毒转染细胞来实现外源基因的转移是病毒转染法的基本思路。该技术使用的病毒主要毒转染法的基本思路。该技术使用的病毒主要有痘苗病毒、腺病毒、逆转录病毒等。有痘苗病毒、腺病毒、逆转录病毒等。3 基因重组技术基因重组技术5 重组体导入受体细胞重组体导入受体细胞5.3 病毒转染法病毒转染法重组痘苗病毒转染法的优点：重组痘苗病毒转染法的优点
31、：宿主广泛，能感染几乎所有培养的动物细胞；宿主广泛，能感染几乎所有培养的动物细胞；表达的外源蛋白能在感染细胞内进行有效的加工表达的外源蛋白能在感染细胞内进行有效的加工修饰，并分泌到细胞外；修饰，并分泌到细胞外；具有较大的容纳外源细胞的能力和较高的表达效具有较大的容纳外源细胞的能力和较高的表达效率。率。48 利用外源基因或利用外源基因或DNA片段插入后，重组质粒片段插入后，重组质粒及含重组质粒菌株的遗传性状的改变来检测重组及含重组质粒菌株的遗传性状的改变来检测重组体。体。3 基因重组技术基因重组技术6 重组体的筛选与鉴定重组体的筛选与鉴定6.1 遗传学检测法遗传学检测法49 对于带有抗药性对于带有抗药性基因的质粒，可通基因的质粒，可通过检测受体菌是否过检测受体菌是否由敏感状态变成抗由敏感状态变成抗药状态进行筛选。药状态进行筛选。 抗生素抗性基抗生素抗性基因：因：Ampr、Tetr、Kanr抗性抗性筛选筛选50Lac Z 基因基因 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶底物底物IPTGIPTG（异丙基（异丙基- - -D- -D-硫代硫代半乳糖苷）半乳糖苷）插入失活型载体的重组体筛选原理插入失活型载体的重组体筛选原理外源外源DNADNA重组体重组体（白色）（白色）未转化体未转化体（蓝色）（蓝色）51在含在含X-gal和和IPTG的培养基上筛选重组菌株的培养基上筛选重组菌株
