1、生物标志物与分子流行病学生物标志物与分子流行病学吕嘉春吕嘉春广州医学院广州医学院学习目标学习目标 掌握生物学标志物的概念掌握生物学标志物的概念 掌握生物学标志物的分类掌握生物学标志物的分类 理解生物学标志物的用途理解生物学标志物的用途 理解在流行病学研究中使用生物学标志理解在流行病学研究中使用生物学标志物应注意的问题物应注意的问题操作目标操作目标 在设计应用生物学标志物的流行病学研在设计应用生物学标志物的流行病学研究时能够做到究时能够做到合理选择标志物合理选择标志物 阅读应用生物学标志物的文献时能够分阅读应用生物学标志物的文献时能够分析其合理性析其合理性什么是生物标志物什么是生物标志物生物标志
2、物生物标志物是从生物学介质中可以检测到是从生物学介质中可以检测到的细胞、生物化学或分子改变。的细胞、生物化学或分子改变。生物学介质包括各种体液（如血液、尿生物学介质包括各种体液（如血液、尿液）、粪便、组织、细胞、头发、呼气液）、粪便、组织、细胞、头发、呼气等。等。为什么要用生物标志物为什么要用生物标志物 暴露测量：精确暴露测量：精确 研究对象选择：减少错分研究对象选择：减少错分 机体反应：提前发现机体反应：提前发现 个体易感性：个体易感性： 暴露暴露 健康损害：有助于阐明机健康损害：有助于阐明机理理从暴露到发病的途径从暴露到发病的途径暴露内部剂量生物学有效剂量早期反应机体结构/机能改变疾病个体
3、易感性生物标志物的分类生物标志物的分类 暴露标志物暴露标志物 内部剂量标志物内部剂量标志物 生物学有效剂量标志物生物学有效剂量标志物 易感性标志物易感性标志物 效应标志物：机体早期反应与疾病标志效应标志物：机体早期反应与疾病标志内部剂量标志物内部剂量标志物内部剂量标志物举例标志物暴露生物学介质Cotinine香烟中的尼古丁 体液铅环境中的铅体液及组织(如头发、指甲、牙齿)4-A*TNT体液（血液、尿液）DDEDDT脂肪组织黄曲霉毒素 食物中的黄曲毒霉素体液致突变实验 化学性致突变物 体液* 4-氨基-2,6-二硝基甲苯内部剂量标志物是在生物材料中测得的暴露物质或暴露物质的代谢产物。生物学有效剂
4、量标志物生物学有效剂量标志物生物学有效剂量标志物举例标志物暴露生物学介质DNA加合物苯并芘组织、白细胞蛋白质加合物环氧乙烷，TNT红细胞与重要的亚细胞靶结构相互作用的暴露与重要的亚细胞靶结构相互作用的暴露物质剂量即生物学有效剂量物质剂量即生物学有效剂量。易感性标志物易感性标志物可测得的遗传或获得性因素的指示物。易感可测得的遗传或获得性因素的指示物。易感性本身不引起疾病，但可影响暴露引发疾病性本身不引起疾病，但可影响暴露引发疾病的概率。的概率。易感性标志物举例标志物暴露疾病1抗胰蛋白酶吸烟肺气肿N-乙酰转移酶芳香胺膀胱癌芳香烃羟化酶吸烟肺癌生物学反应标志物生物学反应标志物生 物 学 反应 标 志
5、物 举 例标 志 物暴 露生 物 学 介质染 色 体致 突 性 化学 物 质断 裂白 细 胞姊 妹 染 色单 体 变换白 细 胞微 核粘 膜点 突 变致 突 性 化学 物 质次 黄 嘌 呤 鸟 嘌呤 磷 酸核 苷 转 移酶白 细 胞胸 苷 激 酶白 细 胞癌 基 因 活化化 学 致 癌物组 织原 卟 啉 升高铅红 细 胞乙 酰 胆 硷脂 酶 活性 降 低有 机 磷 杀虫 剂血 浆因对暴露反应而引起的靶细胞或组织的生物学改变因对暴露反应而引起的靶细胞或组织的生物学改变疾病标志物疾病标志物某 些 疾 病 的 亚 临 床 期 标 志 物标 志 物疾 病血 清 胎 儿 蛋 白肝 癌 、 胃 肠 疾 病
6、 、 胎 儿神 经 管 缺 陷癌 胚 胎 抗 原胃 肠 癌 、 其 它 胃 肠 疾 病肿 瘤 相 关 抗 原多 种 癌 症血 清 谷 丙 转 氨 酶心 肌 梗 塞疾病标志物是一生物学或生物化学事件的指示物，疾病标志物是一生物学或生物化学事件的指示物，它预示着疾病的亚临床期或是疾病自身的一种表现它预示着疾病的亚临床期或是疾病自身的一种表现流行病学研究中常用的流行病学研究中常用的几种生物标志物几种生物标志物 暴露物质本身或其体内代谢产物暴露物质本身或其体内代谢产物 染色体改变：如染色体畸变、姊妹染色染色体改变：如染色体畸变、姊妹染色单体交换、微核等单体交换、微核等 DNA加合物、蛋白质加合物加合物
7、、蛋白质加合物 各种酶类各种酶类 基因与癌基因基因与癌基因暴露剂量生物学标志物的用途暴露剂量生物学标志物的用途 综合反映多途径暴露综合反映多途径暴露 综合反映飘忽不定的暴露综合反映飘忽不定的暴露 将暴露发生时间同内部剂量联系起来将暴露发生时间同内部剂量联系起来 研究急性暴露与健康结局之间的联系研究急性暴露与健康结局之间的联系 研究长期暴露与健康结局之间的联系研究长期暴露与健康结局之间的联系 从混合暴露物中区分出致病性物质从混合暴露物中区分出致病性物质 增加对发病机制的认识增加对发病机制的认识 估计总的健康危害估计总的健康危害易感性生物学标志物的用途易感性生物学标志物的用途估计个体发病危险性估计
8、个体发病危险性增加对暴露增加对暴露-疾病联系强度估计的精确性疾病联系强度估计的精确性提供发病机理的线索提供发病机理的线索 目前研究热点：目前研究热点： 代谢酶、受体、代谢酶、受体、DNA修复酶修复酶 基因的多态基因的多态性与人群的肿瘤易感性研究。性与人群的肿瘤易感性研究。早期生物学反应和疾病生物标早期生物学反应和疾病生物标志物的用途志物的用途 有助于早期发现健康损害有助于早期发现健康损害 在建立队列时，将亚临床期疾病病人排除在建立队列时，将亚临床期疾病病人排除 改进对疾病诱导期、潜伏期的估计改进对疾病诱导期、潜伏期的估计 确定暴露发生作用的疾病发展阶段确定暴露发生作用的疾病发展阶段 使疾病的分
9、类更为合理使疾病的分类更为合理例例1、用、用TNT-Hb加合物估计加合物估计TNT的暴露剂量的暴露剂量 三硝基甲苯三硝基甲苯(TNT)进入体内途径：呼吸道、进入体内途径：呼吸道、消化道、皮肤消化道、皮肤 暴露剂量因工种、时间而异暴露剂量因工种、时间而异 传统对暴露的测定方法：环境传统对暴露的测定方法：环境TNT粉尘粉尘浓度，对经消化道和皮肤吸收难以估计浓度，对经消化道和皮肤吸收难以估计 生物检测：血、尿中生物检测：血、尿中TNT代谢物测定：代谢物测定：反映近期暴露反映近期暴露 TNT从各种途径吸收进入血液以后，部分与从各种途径吸收进入血液以后，部分与血红蛋白结合，形成血红蛋白结合，形成TNT-
10、Hb加合物加合物 TNT-Hb加合物与传统的暴露剂量指标、工加合物与传统的暴露剂量指标、工种、种、TNT晶状体白内障有无等相关，表明这晶状体白内障有无等相关，表明这加合物能够真实反映暴露水平加合物能够真实反映暴露水平 TNT-Hb加合物相对稳定加合物相对稳定(3个月内个月内) TNT-Hb反映了多途径总的暴露剂量反映了多途径总的暴露剂量例例2、黄曲霉毒素与肝癌关系研究、黄曲霉毒素与肝癌关系研究 以往多次流行病学调查表明，食用霉变以往多次流行病学调查表明，食用霉变食物增加肝癌发生的危险性食物增加肝癌发生的危险性 食物中的黄曲霉毒素含量因季节、地区、食物中的黄曲霉毒素含量因季节、地区、因素习惯不同
11、而不同因素习惯不同而不同 对个体黄曲霉毒素的摄入量估计困难对个体黄曲霉毒素的摄入量估计困难 缺乏黄曲霉致病的直接证据缺乏黄曲霉致病的直接证据 队列内病例对照研究：队列内病例对照研究：18,000份份45-64岁健岁健康男性尿液标本，随访康男性尿液标本，随访7年，年，50人发生肝人发生肝癌。癌。 尿中黄曲霉毒素阳性发生肝癌的危险度尿中黄曲霉毒素阳性发生肝癌的危险度RR为为3，乙肝表面抗原阳性的危险度，乙肝表面抗原阳性的危险度RR为为7，两者均阳性的危险度为，两者均阳性的危险度为60。可见两。可见两种危险因素的作用间有相乘作用。种危险因素的作用间有相乘作用。生物标志物的选择生物标志物的选择 关联性
12、：所选用的生物学标志物应与所关联性：所选用的生物学标志物应与所研究的暴露研究的暴露-疾病关系有关联疾病关系有关联 真实性：所选用的暴露标志物应能反映真实性：所选用的暴露标志物应能反映暴露有无及其剂量暴露有无及其剂量 可靠性：即可重复性可靠性：即可重复性 稳定性：所选用的标志物应相对稳定稳定性：所选用的标志物应相对稳定应用生物学标志物应注意的问题应用生物学标志物应注意的问题 个体间变异：不同个体同一组织器官中个体间变异：不同个体同一组织器官中标志物的出现频率和量有可能相差很大标志物的出现频率和量有可能相差很大 组织间变异：同一个体不同组织器官之组织间变异：同一个体不同组织器官之间标志物出现的频率
13、和量可能差别较大间标志物出现的频率和量可能差别较大 测定方法；不同测定方法的灵敏度不同测定方法；不同测定方法的灵敏度不同 样本含量：由于测定方法的复杂性或费样本含量：由于测定方法的复杂性或费用问题，样本含量一般较小，因此统计用问题，样本含量一般较小，因此统计把握度较低把握度较低流行病学研究设计特点流行病学研究设计特点 横断面研究：横断面研究：应用生物学标志物的流行病学研应用生物学标志物的流行病学研究大多具有横断面的特点究大多具有横断面的特点 病例病例-对照研究对照研究：实质上也为横断面：实质上也为横断面 病例病例-病例研究：病例研究：将某种疾病病例按标志物有将某种疾病病例按标志物有无分为两组，
14、比较两组间某些因素的差异无分为两组，比较两组间某些因素的差异 队列内（巢式）病例队列内（巢式）病例-对照研究对照研究：需要在队列：需要在队列建立时采取并储存生物标本，如血清建立时采取并储存生物标本，如血清应用生物学标志物的优点应用生物学标志物的优点 暴露标志物暴露标志物 对暴露的测定更精确对暴露的测定更精确 减少暴露错分减少暴露错分 易感性标志物易感性标志物 可筛检出易感个体可筛检出易感个体 估计个体危险性估计个体危险性 生物学反应标志物生物学反应标志物 可发现早期反应可发现早期反应 有助于揭示暴露致病机理有助于揭示暴露致病机理应用生物学标志物的缺点应用生物学标志物的缺点 有些标志物测定方法复
15、杂、费用昂贵有些标志物测定方法复杂、费用昂贵 无法对久远的暴露进行测量无法对久远的暴露进行测量 不宜对随时间变动较大的暴露进行测量不宜对随时间变动较大的暴露进行测量 样本量一般较小，研究的把握度较小样本量一般较小，研究的把握度较小 不易控制多个因素的混杂作用不易控制多个因素的混杂作用 许多标志物的本质尚不完全明了许多标志物的本质尚不完全明了生物标志物生物标志物 小结小结 合理选用生物学标志物会增强流行病学合理选用生物学标志物会增强流行病学在探索暴露在探索暴露-疾病之间关系方面的能力疾病之间关系方面的能力 不加选择地使用生物学标志物并不能提不加选择地使用生物学标志物并不能提高流行病学研究的质量高
16、流行病学研究的质量 传统方式的流行病学调查仍会继续应用传统方式的流行病学调查仍会继续应用分子流行病学分子流行病学定义：利用现代分子生物学原理和技术，定义：利用现代分子生物学原理和技术， 从分子乃至基因水平阐明疾病和健康状从分子乃至基因水平阐明疾病和健康状态的相关生物标志物（或分子事件）在态的相关生物标志物（或分子事件）在人群中的分布及其影响因素，并研究防人群中的分布及其影响因素，并研究防制疾病、促进健康的策略与措施的科学。制疾病、促进健康的策略与措施的科学。传统流行病学传统流行病学与与分子流行病学分子流行病学传统流行病学：传统流行病学： 暴露暴露 疾病疾病 以分布为基础，进行病因推断。以分布为
17、基础，进行病因推断。分子流行病学的切入点分子流行病学的切入点暴暴露露内部剂量生物学有效剂量早期反应机体结构/机能改变疾疾病病易感标志物易感标志物-暴露标志暴露标志-效应标志标志-生物标志物的种类生物标志物的种类1、暴露标志2、易感标志3、效应标志如何进行工作？如何进行工作？1、标志物的筛选：、标志物的筛选： 能反映疾病的进程； 特异性高、稳定性好； 检测方法灵敏、特异、快速方便。2、标本采集与储存、标本采集与储存：无污染；不变质；标本档案材料要齐全。3、检测技术要合适。、检测技术要合适。 （1） DNA水平：PCR、SSCP、测序 （2）RNA水平：RT-PCR、Northern Blot （
18、3）蛋白质水平：Western Blot、组化 （4）功能水平：酶学、机能学4、设计方案的要求：、设计方案的要求： （1）与流行病学研究方法一致。 （2）样本种类和样本量的确定。 （3）检测指标的选择：要有理论依据； 考虑到纵向和横向对比。 （4）强调多学科的合作。分子流行病学主要研究方法分子流行病学主要研究方法一、选择生物标志物作为测量指标一、选择生物标志物作为测量指标 “暴露暴露-易感易感-效应效应” 三大类三大类 要求：要求：（1）. 特异、稳定特异、稳定 （2）.标本采集、储存方便标本采集、储存方便 （3）.检测方法简便、实用、规范检测方法简便、实用、规范 （4）.灵敏度和特异度高灵敏
19、度和特异度高二、标本收集与储存二、标本收集与储存 建立与检测技术相适应的生物标本库。建立与检测技术相适应的生物标本库。要求要求:（1）.无污染。无污染。 （2）.每个标本都有标识和病例背景。每个标本都有标识和病例背景。 （3）.储存标本在有效期内结果稳定。储存标本在有效期内结果稳定。三、常用分子生物学及相关技术三、常用分子生物学及相关技术 简介简介 1、DNA: Southern blot; PCR; Sequencing. Enzyme restriction; electrophoresis. 2、RNA: Northern blot; Dot blot; RT-PCR. 3、Protei
20、n: Western blot; Immuno-histochemistry.四、资料分析：四、资料分析： 1、传统流行病学指标。、传统流行病学指标。 2、遗传学多态性、杂合度等。、遗传学多态性、杂合度等。 3、连锁与分离分析。、连锁与分离分析。 4、易感性与危险度分析。、易感性与危险度分析。五、质量控制五、质量控制 1、仪器设备的计量校正、正确使用。、仪器设备的计量校正、正确使用。 2、实验试剂的批次不变。、实验试剂的批次不变。 3、标本采集和储存能确保其生物性状。、标本采集和储存能确保其生物性状。 4、实验方法统一，操作规范。、实验方法统一，操作规范。 5、设立多重对照：标准、空白、设立多
21、重对照：标准、空白、+、-。 6、重复试验。、重复试验。六、研究实例六、研究实例1、应用、应用PCR和测序追踪和测序追踪HIV传染源。传染源。 某地某地1名牙医（名牙医（HIV+）与）与7名名HIV感染者感染者(该牙医治疗过的病人该牙医治疗过的病人)有无传播关系？有无传播关系？ 同时抽查同时抽查35名与该牙医无关的名与该牙医无关的HIV感染，感染，取外周血分离单核细胞，经取外周血分离单核细胞，经PCR、测序；、测序；结果：牙医结果：牙医HIV株与株与5名其治疗过的病人名其治疗过的病人的的HIV同株同株,其它毒株与牙医株关系较远。其它毒株与牙医株关系较远。2、GSTm1基因多态与潮汕地区食管癌易
22、基因多态与潮汕地区食管癌易感性的关系。感性的关系。 107例食管癌，例食管癌，111例正常例正常人，外周血提取人，外周血提取DNA，进行，进行PCR扩增。扩增。无产物为无产物为“-”。 GSTm1 case control - 68 55 + 39 56 合计合计 107 111 X2= 4.34, P=0.0371, OR=1.78 (1.01,3.07)研究实例研究实例 1 1研究题目研究题目 波兰某工业区环境中芳香族化合物暴露人群的波兰某工业区环境中芳香族化合物暴露人群的DNADNA加合物研究加合物研究测量指标测量指标 DNADNA加合物加合物/ /淋巴细胞淋巴细胞DNADNA（介质）（
23、介质）测量方法测量方法 荧光检测竞争荧光检测竞争ELISA法、法、DNADNA加合物加合物32P32P后标记技术后标记技术研究设计研究设计 横断面分析研究横断面分析研究 暴露组暴露组 煤焦油作业工人煤焦油作业工人 对照组对照组 当地城市居民、近郊农民当地城市居民、近郊农民 排除年龄、吸烟、其他职业暴露等因素影响排除年龄、吸烟、其他职业暴露等因素影响 比较比较3 3组组DNADNA加合物水平加合物水平结果分析结果分析 当地城市居民（当地城市居民（1919例）与煤焦沥青作业工人例）与煤焦沥青作业工人（6363例）的例）的DNADNA加合物水平和谱型相似加合物水平和谱型相似 近郊农民（近郊农民（15
24、15例）的例）的DNADNA加合物水平仅为煤焦加合物水平仅为煤焦油作业工人的油作业工人的1/21/2或或1/31/3 结论结论 环境中芳香族化合物（煤焦油）暴露可导致环境中芳香族化合物（煤焦油）暴露可导致体内体内DNADNA加合物水平加合物水平质量控制质量控制 每份标本同时在不同实验室检测每份标本同时在不同实验室检测 结果一致性好结果一致性好( (r=0.66, =0.66, p0.01)0.01)研究实例研究实例 2 2研究题目研究题目 应用应用HBV-DNA序列多态性研究序列多态性研究HBV的传播的传播测量标志测量标志 HBV 2551-2650HBV 2551-2650位点核酸序列位点核
25、酸序列/ /血清血清HBV-DNA HBV-DNA 测量方法测量方法 ELISA法和法和PCRPCR法法 研究设计研究设计 类病例对照研究（病例病例研究）类病例对照研究（病例病例研究） 9696名名HBeAg阳性儿童和用阳性儿童和用ELISAELISA检测检测HBVHBV血清阳性的血清阳性的9797名父母名父母 假设该位点核酸序列在儿童与父母之间分配是随机的假设该位点核酸序列在儿童与父母之间分配是随机的结果分析结果分析 该序列在儿童和父母之间是非随机分配的（该序列在儿童和父母之间是非随机分配的（P0.00005)P0.00005) 结论结论 HBVHBV具有家庭内传播具有家庭内传播质量控制质量控制 关于家庭成员之间关于家庭成员之间1%1%的序列差异的解释的序列差异的解释 排除了排除了PCRPCR错配可能错配可能返回主菜单返回主菜单
