1、免疫组织化学染色技术组织化学染色技术组织化学染色技术v Histochemistry Techniquev 观察对象 组织、细胞v 使用工具 普通显微镜 荧光显微镜形态与结构免疫组织化学染色技术免疫组织化学染色技术v Immunohistochemistry Technique 指用标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原（目的蛋白）进行定性、定位、定量测定的一项免疫检测方法。Immunohistochemistry Technique特定蛋白（抗原）授课提纲授课提纲v 基质标本的制作v 荧光免疫组化技术v 酶免疫组化技术v 相关问题与解决方案授课提纲授课
2、提纲v 基质标本的制作v 荧光免疫组化技术v 酶免疫组化技术v 相关问题与解决方案标本类型标本类型v 组织标本 冰冻切片 石蜡切片v 细胞标本 体外培养细胞（单层细胞、悬浮细胞） 体液细胞（涂片）固定与保存固定与保存v 固定的目的 防止细胞自溶，保持细胞形态与机构； 保存组织细胞抗原性； 防止标本脱落； 防止滋生微生物，预防组织腐败v 标本固定以不损伤细胞形态、不损伤抗原特异性为基本原则固定与保存固定与保存v 固定剂 蛋白类乙醇或甲醇 微生物类丙酮、三氯化碳 多糖类10%福尔马林抗原修复抗原修复v 目的： 充分暴露抗原表位，利于抗体识别。v 方法： 酶（无花果蛋白酶，胰蛋白酶）消化法； 盐酸水
3、解 微波处理 煮沸法授课提纲授课提纲v 基质标本的制作v 荧光免疫组化技术v 酶免疫组化技术v 相关问题与解决方案标记物标记物v 荧光素 异硫氰酸荧光素（FITC） 四乙基罗丹明（RB200） 藻红蛋白（PE） 藻红蛋白花青苷（PE-Cy5）技术类型技术类型v 直接染色法 荧光素直接标记在特异性抗体（Ab1)v 间接染色法 荧光素直接标记在特异性抗体（Ab2) 第二抗体针对第一抗体种属特异性的表 位（如羊抗鼠Ig或羊抗人Ig）直接法直接法实例：细胞鉴定实例：细胞鉴定v 免疫细胞及其亚群（流式细胞术） T细胞 CD3+ CD4+ CD8+ B细胞 NK细胞免疫细胞分类与计数免疫细胞分类与计数18
4、Suppressor T cellR1T cell / B cellHelper T cell间接法间接法实例：检测抗核抗体实例：检测抗核抗体v 检测原理 已知抗原肝细胞/HEp-2 待检抗体 第二抗体荧光标记兔抗人Ig实例：检测病原体（病毒、细菌）实例：检测病原体（病毒、细菌）v检测原理待检病毒（抗原）已知抗体单抗或多抗第二抗体荧光标记羊抗鼠（或兔）Ig荧光显微镜（落射式）荧光显微镜（落射式）v关键 汞灯光源 激发滤片 暗场聚光镜 吸收滤片荧光显微镜（落射式）荧光显微镜（落射式）荧光显微镜（落射式）荧光显微镜（落射式）授课提纲授课提纲v 基质标本的制作v 荧光免疫组化技术v 酶免疫组化技术v
5、 相关问题与解决方案主要类型主要类型v 酶标记抗体 同荧光免疫组化v 非酶标记抗体 酶-抗酶系统 生物素-链霉亲和素系统技术特点技术特点v以酶作为抗原，制备抗酶抗体；v酶（抗原）与抗酶（抗体）结合制备酶-抗酶复合物；v通过桥联抗体与识别系统（待检抗原-特异性抗体）连接；酶桥法酶桥法常用酶和相应底物常用酶和相应底物v 过氧化物酶 Peroxidase（P） 二氨基联苯胺（DAB）v 碱性磷酸酶（AP） alkaline phosphatase（AP） 溴氯羟吲哚磷酸盐（BCIP） 过氧化物酶过氧化物酶- -抗过氧化物酶（抗过氧化物酶（PAPPAP）法）法PAPPAP复合物抗体选择抗体选择v 第一
6、抗体 识别抗原v 第二抗体（桥联抗体） 能同时与第一、第三抗体结合v 第三抗体 抗酶抗体 与第一抗体同源PPPAAA 图图 双酶双底物双酶双底物(复合物法复合物法)双重酶标染色原理双重酶标染色原理兔兔PAPGAR IgG兔抗兔抗Ag鼠鼠APAAPGAM. IgG鼠抗鼠抗实例：淋巴瘤轻链双重染色法实例：淋巴瘤轻链双重染色法v 一抗一抗 兔抗兔抗 鼠抗鼠抗v 二抗二抗 羊抗兔羊抗兔 羊抗鼠羊抗鼠v 显色系统显色系统 PAPPAP APAAP APAAP亲和素亲和素- -生物素生物素- -过氧化物酶复合体（过氧化物酶复合体（ABCABC）v 生物素（Biotin）v 亲和素（Avidin）v 生物素
7、标记抗体（B-Ab）v 生物素标记过氧化物酶（B-P）亲和素亲和素- -生物素生物素- -过氧化物酶复合体（过氧化物酶复合体（ABCABC）EnVision授课提纲授课提纲v 基质标本的制作v 荧光免疫组化技术v 酶免疫组化技术v 相关问题与解决方案识别抗体（第一）选择识别抗体（第一）选择v 单克隆抗体（McAb） 特异性强 敏感性差v 多克隆抗体（McAb） 特异性差 敏感性强识别（第一）抗体选择识别（第一）抗体选择第二抗体选择第二抗体选择选择显色系统选择显色系统v 荧光免疫组化v 酶免疫组化 PAP APAAP ABC LAB？封闭非特异性结合封闭非特异性结合特异性显色特异性显色v 具备 特定部位显色特定组织、特定细胞、特定结构 不均一显色 非特异性显色非特异性显色v主要原因 内源性酶 内源性生物素 抗体特异性不强 漂洗不充分 基质制作 非特异性背景显色非特异性背景显色v 预先处理 加底物消耗 正常血清封闭
