1、第六章第六章 一般毒性作用一般毒性作用（General Toxicity of Xenobiotics）汪春红027-68759956补充参考书补充参考书毒性评价或安全性评价的基本目的毒性评价或安全性评价的基本目的毒性试验的设计不是为了证明化学品的安全性，而是为毒性试验的设计不是为了证明化学品的安全性，而是为了表征化学品可能产生的毒作用。了表征化学品可能产生的毒作用。第一节第一节 概述概述（毒理学实验基础）（毒理学实验基础）gy外推外推 A.人是最敏感的物种人是最敏感的物种B.人和实验动物的生物学过程包括化学物的代谢与体重（或体表面积）相关。人和实验动物的生物学过程包括化学物的代谢与体重（或体
2、表面积）相关。以单位体表面积计算在人产生毒作用的剂量和实验动物相近，以体重计算则以单位体表面积计算在人产生毒作用的剂量和实验动物相近，以体重计算则人通常比实验动物敏感，差别可达人通常比实验动物敏感，差别可达10倍。如果某一化学物对几个物种实验动倍。如果某一化学物对几个物种实验动物的毒性是相同的，则人的反应也可能是相似的物的毒性是相同的，则人的反应也可能是相似的毒理学研究方法毒理学研究方法 人体观察人体观察 流行病学研究流行病学研究动物实验动物实验人群调查人群调查动物实验动物实验整体动物实验整体动物实验（in vivo）体外试验体外试验（in vitro）一般毒性一般毒性试试 验验特殊毒性特殊毒
3、性试试 验验微微 生生 物物试试 验验哺乳动物哺乳动物试试 验验急性毒性急性毒性重复剂量毒性重复剂量毒性亚慢性毒性亚慢性毒性慢性毒性慢性毒性致突变致突变致癌致癌致畸致畸致突变致突变器官水平器官水平组织水平组织水平细胞水平细胞水平亚细胞水平亚细胞水平分子水平分子水平以动物实验为中心，动物以动物实验为中心，动物实验的设计、实施、结果实验的设计、实施、结果观察和评价是毒理学研究观察和评价是毒理学研究 的基本功的基本功Lumley(1990)/Igarashi(1994)Lumley(1990)/Igarashi(1994)根据有限的临床资料报告对人的根据有限的临床资料报告对人的毒性约一半不能由临床前
4、（动物）毒性研究预测。毒性约一半不能由临床前（动物）毒性研究预测。HeywoodHeywood（19831983）报告）报告2727个化学物（多为药物）的靶器官毒性在个化学物（多为药物）的靶器官毒性在大鼠和狗（或猴）之间的相符率仅大鼠和狗（或猴）之间的相符率仅20%20%。OlsonOlson等（等（19981998）报告）报告131131种化学物对动物的毒性与人的毒性的相种化学物对动物的毒性与人的毒性的相符率，啮齿类符率，啮齿类6%6%，非啮齿类，非啮齿类28%28%，合并达，合并达36%36%，所有物种相符率可，所有物种相符率可达达69%69%。按照目前的广泛进行毒理学安全性评价，可在一定
5、程度上提高新按照目前的广泛进行毒理学安全性评价，可在一定程度上提高新药和各种化学品的使用安全性，但仍不能完全排除对人健康危害药和各种化学品的使用安全性，但仍不能完全排除对人健康危害的风险的风险WHOWHO在在临床前药物安全性实验原则临床前药物安全性实验原则的文件中指出：的文件中指出：虽然事先虽然事先对生物活性物质进行了最仔细彻底的研究，但给人使用时总是不对生物活性物质进行了最仔细彻底的研究，但给人使用时总是不可能避免地要冒一定的风险可能避免地要冒一定的风险。4 4、小数量实验动物结果外推大数量人群的不确定性。毒理、小数量实验动物结果外推大数量人群的不确定性。毒理学实验所用动物数量有限，那些发生
6、率很低的毒性反应，学实验所用动物数量有限，那些发生率很低的毒性反应，在少量动物中难以发现。在少量动物中难以发现。v1统计原则 随机随机：代表性：代表性 对照对照：鉴别处理因素与非处理因素的差异鉴别处理因素与非处理因素的差异及处理因素效应大小，消除和减少随机化原及处理因素效应大小，消除和减少随机化原则所不能控制的抽样误差及实验者操作熟练则所不能控制的抽样误差及实验者操作熟练程度等造成的差异程度等造成的差异 空白空白/阴阴/阳性对照，自身对照，历史性对照阳性对照，自身对照，历史性对照 重复重复：样本量、重复次数：样本量、重复次数实验设计过程应遵循基本原则实验设计过程应遵循基本原则v 2动物选择原则
7、 首先考虑首先考虑代谢与毒性效应上与人一致代谢与毒性效应上与人一致 注重对受试物毒性敏感的动物物种注重对受试物毒性敏感的动物物种 种属、品系、个体差异种属、品系、个体差异 自然寿命不太长、易于饲养和实验操自然寿命不太长、易于饲养和实验操作、经济易获得作、经济易获得 动物年龄、性别动物年龄、性别毒理学实验设计基本原则没有一种实验动物完全符合物种选择的原则，没有一种实验动物完全符合物种选择的原则，目前常规选择目前常规选择2 2个物种：啮齿类个物种：啮齿类+非啮齿类非啮齿类为什么常选大、小鼠呢？为什么常选大、小鼠呢？人与大鼠对不同化合物的急性毒性敏感比值人与大鼠对不同化合物的急性毒性敏感比值 化合物
8、种类化合物种类化合物数目化合物数目敏感比值敏感比值*无机化合物无机化合物404.20.66有机磷化合物有机磷化合物161.90.46有机氯化合物有机氯化合物201.80.30药物药物6210.55.80*以大鼠为以大鼠为1，人：大鼠，人：大鼠n实验中小动物至少应为清洁动物及以上级别，国际上实验中小动物至少应为清洁动物及以上级别，国际上SPFSPF动物已成为毒理学实验的标准实验动物。动物已成为毒理学实验的标准实验动物。实验动物微生物等级标准实验动物微生物等级标准 等级等级 要要 求求级级 普通动物普通动物(CV)应没有传染给人的疾病应没有传染给人的疾病级级 清洁动物清洁动物(CL)除除级标准外，
9、种系清楚，没有该动物特有的疾病级标准外，种系清楚，没有该动物特有的疾病级级 无特定病无特定病原体动物原体动物(SPF)除除级标准外，动物为剖腹产或子宫切除产、按纯级标准外，动物为剖腹产或子宫切除产、按纯系要求繁殖，在隔离器内或层流室内饲养，可有不系要求繁殖，在隔离器内或层流室内饲养，可有不致病细菌丛，没有致病病原体致病细菌丛，没有致病病原体级级 无菌动物无菌动物(GF)在全封闭无菌条件下饲养的纯系动物，动物体外不在全封闭无菌条件下饲养的纯系动物，动物体外不带有任何微生物和寄生虫带有任何微生物和寄生虫(包括绝大部分病毒包括绝大部分病毒)v 3剂量分组原则 实验动物必须暴露于高剂量，这是发现对人潜
10、在实验动物必须暴露于高剂量，这是发现对人潜在危害的必需和可靠的办法。危害的必需和可靠的办法。除对照组外，一般设除对照组外，一般设3 3个或个或3 3个以上剂量组，以观个以上剂量组，以观察剂量察剂量-反应反应(效应效应)关系，确定受试化学物引起的关系，确定受试化学物引起的毒效应及其毒性参数。毒效应及其毒性参数。v 4试验期限 一般由毒性实验的定义决定：一般由毒性实验的定义决定：急性毒性：一次或急性毒性：一次或1d1d内多次观察内多次观察14d14d 亚慢性毒性：持续至实验动物寿命的亚慢性毒性：持续至实验动物寿命的10%10%（大（大/小鼠小鼠90d90d，狗，狗1 1年）年）某些试验（如致畸和多
11、代生殖试验）由受试实验某些试验（如致畸和多代生殖试验）由受试实验动物物种或品系决定。动物物种或品系决定。v 5给受试物途径 尽可能利用人拟用途径尽可能利用人拟用途径 吸收速率：静脉注射吸收速率：静脉注射 吸入吸入 腹腔注射腹腔注射 经口经口 经皮经皮v 质量控制 优良实验室规范（优良实验室规范（good laboratory practicegood laboratory practice，GLPGLP）：严格控制可能影响实验结果准确性的各种主客观因素，降低试验误差，确严格控制可能影响实验结果准确性的各种主客观因素，降低试验误差，确保实验结果的真实性保实验结果的真实性 实验操作规程、试剂实验操
12、作规程、试剂/动物选择、仪器使用、实验环境动物选择、仪器使用、实验环境 安全性评价的最终产品并没有实体，而是数据。因此，安全性评价的最终产品并没有实体，而是数据。因此，难以通过检查最终产品来保证其质量，只有通过保证有难以通过检查最终产品来保证其质量，只有通过保证有关安全性试验的计划、实施等所有的因素和过程的可靠关安全性试验的计划、实施等所有的因素和过程的可靠性才能保证最终产品的可靠性性才能保证最终产品的可靠性v 毒理学实验结果评价 统计学意义统计学意义 生物学意义生物学意义 毒理学意义毒理学意义统计分析统计分析有统计学意义有统计学意义无生物学意义无生物学意义有统计学意义有统计学意义有生物学意义
13、有生物学意义无统计学意义无统计学意义无生物学意义无生物学意义无统计学意义无统计学意义有生物学意义有生物学意义 I IIIV IIIv 毒理学实验结果评价 统计学意义统计学意义 生物学意义生物学意义 毒理学意义毒理学意义在判断生物学意义时应先考虑：在判断生物学意义时应先考虑：剂量依赖性趋势剂量依赖性趋势 结果的重现性结果的重现性 相关指标结果的一致性相关指标结果的一致性 差别的大小和类型差别的大小和类型 两种性别的一致性两种性别的一致性一般毒性污染物理化特性污染物理化特性了解毒性大小和特征了解毒性大小和特征了解在体内蓄积和耐受了解在体内蓄积和耐受了解对机体毒作用靶点和指标了解对机体毒作用靶点和指
14、标确定阈和阈下剂量确定阈和阈下剂量急性毒性试验急性毒性试验亚急性毒性试验亚急性毒性试验亚慢性毒性试验亚慢性毒性试验慢性毒性试验慢性毒性试验一般毒性试验一般毒性试验外源化学物对全身各系统的毒性效应外源化学物对全身各系统的毒性效应全身各系统对外源化学物的毒性反应全身各系统对外源化学物的毒性反应目的要求目的要求第二节第二节 急性毒性作用急性毒性作用acute toxicityacute toxicity 机体一次或24h内多次接触外源化学物后在短期内（最长14天）所产生的毒性效应，包括一般行为和外观改变、大体形态变化以及死亡效应一、急性毒性的概念急性毒性（急性毒性（acute toxicityacu
15、te toxicity）急性毒性的概念需要注意需要注意 急性接触的次数 一次:经口、注射；呼吸道、皮肤(一段时间)24h多次（不超过3次）中毒效应出现的时间 不能仅以接触毒物后毒性症状出现的时间，主要以接触毒物的时间，观察时间：714天 强度 一次性大剂量，中毒症状明显，常发生死亡二、急性毒性试验的目的二、急性毒性试验的目的 求出致死剂量及其他急性毒性参数 观察中毒表现、毒作用强度和死亡情况，初步评价毒物的毒效应特征、靶器官、剂量-反应（效应）关系 等 为其他毒理试验提供接触剂量和选择观察指标的依据 为毒理学机制研究提供线索 急性毒性的参数 半数致死剂量：LD50GB15193.3-2003食
16、品安全性毒理学评价食品安全性毒理学评价程序和方法程序和方法的急性毒性分级标准的急性毒性分级标准急性毒性危害类别和急性毒性估计值（急性毒性危害类别和急性毒性估计值（GHS）（WHO-全球化学品统一分类和标签制度全球化学品统一分类和标签制度）接触途径接触途径第第1类类第第2类类第第3类类第第4类类第第5类类经口（经口（mg/kg体重）体重）5503002000经皮（经皮（mg/kg体重）体重）50200100020005000气体（气体（ppm，V）10050025005000蒸气（蒸气（mg/L）0.52.01020粉尘与烟雾粉尘与烟雾（mg/L）0.050.51.05急性毒性的参数 剂量-反应
17、曲线 ED,TD：ED50,TD50,（1）霍恩法（Horn）（2）改进寇氏法（3）Bliss法 最大似然性法（maximum likelihood method），最精确的计算方法LD50的几种计算方法（1）霍恩法（Horn）：（剂量递增法/平均移动法）剂量对数与死亡率（反应率）的转换数（概率单位）呈直线关系。简单、精确度不够！剂量对数与死亡率（反应率）的转换数（概率单位）呈直线关系。简单、精确度不够！4个剂量组，每组动物数相等（4-5只），剂量按等比级排列一般为2个参考染毒系列：剂量组距为2.15倍或3.16倍根据每组动物数、组距、每组动物死亡数，查表求出受试物LD50、95%CILD50
18、的几种计算方法（2）改进寇氏法）改进寇氏法（Karber法法/平均致死剂量法）平均致死剂量法）lgLD50及其及其95可信限为可信限为1.35211.960.02131.35210.0417LD50及及95可信区间范围为可信区间范围为22.50mgkg(20.4424.76mgkg)（1）霍恩法（Horn）（2）改进寇氏法（3）Bliss法 最大似然性法（maximum likelihood method），最精确的计算方法LD50的几种计算方法三、急性毒性试验方法的要点三、急性毒性试验方法的要点 经典急性毒性试验：死亡经典急性毒性试验：死亡 急性毒性替代试验急性毒性替代试验固定剂量法固定剂量
19、法急性毒性分级法急性毒性分级法上上-下移动法（阶梯法）下移动法（阶梯法）限量试验限量试验经典急性致死（经典急性致死（LDLD5050）试验设计流程）试验设计流程总体原则总体原则经典急性毒性试验经典急性毒性试验 实验动物 染毒途径 染毒剂量 观察周期 观察指标的选择、计算方法和评价 急性毒性反应与人近似 易于饲养、操作方便 繁殖力较强，数量较大 价格较低，易于获得（一）实验动物的选择和要求一）实验动物的选择和要求主要原则主要原则除特殊需要外，首选哺乳动物除特殊需要外，首选哺乳动物实验动物的物种和品系实验动物的物种和品系v 啮齿类啮齿类（rodent species）v 非啮齿类非啮齿类（nonr
20、odent species）小鼠：昆明种、NIH、ICR 大鼠：Sprague-Dawley（SD）、Wistar 犬或猴 为了有利于预测化合物对人的危害，要求选择两种以上为了有利于预测化合物对人的危害，要求选择两种以上的实验动物，最好一种为啮齿类，一种为非啮齿类，分别求的实验动物，最好一种为啮齿类，一种为非啮齿类，分别求出其急性毒性参数。出其急性毒性参数。v 根据接触途径选择实验动物 急性经口和吸入毒性试验大鼠、小鼠 急性经皮毒性试验成年大鼠、豚鼠、家兔实验动物的物种和品系实验动物的年龄和体重实验动物的年龄和体重v 刚成年、健康、未曾交配和受孕的动物v 小动物根据体重v 同一次试验相同性别实
21、验动物起始体重变异范围不应超过平均体重的20%实验动物的生存年限与体重选择动物种类动物种类生活年限生活年限（年）（年）生殖年龄生殖年龄（月）（月）初成年体初成年体重（克）重（克）急性实验选择急性实验选择体重（克）体重（克）慢性实验选慢性实验选择体重（克）择体重（克）小白鼠小白鼠1.5221518251518大白鼠大白鼠22.52315010015050100豚豚 鼠鼠683250200250150200家家 兔兔493415001500200012001500猫猫10123410001500250010001500狗狗1520341200080001500040006000实验动物的性别实验动
22、物的性别 雌雄各半雌雄各半 如雌、雄动物毒效应有明显差异，应分如雌、雄动物毒效应有明显差异，应分别并求出雌性和雄性动物的别并求出雌性和雄性动物的LDLD5050值值 特殊的试验研究可仅作单一性别的急性特殊的试验研究可仅作单一性别的急性毒性试验毒性试验实验动物分组与数量实验动物分组与数量 根据组数和每组数量来决定总数量根据组数和每组数量来决定总数量 LDLD5050，一般为一般为4-64-6组组 大、小鼠每组每性别至少大、小鼠每组每性别至少5 5只，犬类只，犬类3 3只只 严格遵循随机、均衡的原则严格遵循随机、均衡的原则控制离散度控制离散度控制均衡性控制均衡性实验动物的预检实验动物的预检 给药前
23、检疫观察给药前检疫观察 大、小鼠、兔、豚鼠大、小鼠、兔、豚鼠1 1周，犬猴周，犬猴2-32-3周周适应新环境，减少环境和生理条件变化可能对试适应新环境，减少环境和生理条件变化可能对试验结果的影响验结果的影响筛检健康状况不符合试验要求的动物筛检健康状况不符合试验要求的动物实验动物的给药前禁食处理实验动物的给药前禁食处理 经口途径染毒，实验动物胃肠道内食物存留经口途径染毒，实验动物胃肠道内食物存留量对化学毒物的毒性可产生较明显的干扰量对化学毒物的毒性可产生较明显的干扰 大、小鼠隔夜禁食，染毒大、小鼠隔夜禁食，染毒2h2h后提供饲料后提供饲料 经口多次染毒可不禁食经口多次染毒可不禁食（二）受试物及处
24、理（二）受试物及处理 理化特性理化特性 水溶液、混悬液、油溶液水溶液、混悬液、油溶液 水溶性受试物：蒸馏水、去离子水、生理盐水溶性受试物：蒸馏水、去离子水、生理盐水，保持与体内渗透压一致水，保持与体内渗透压一致（注射）（注射）水不溶性受试物：溶于或悬浮于适当的有机水不溶性受试物：溶于或悬浮于适当的有机溶剂中溶剂中 受试物一般应临用前新配受试物一般应临用前新配受试物成分和配方应稳定不变受试物成分和配方应稳定不变适宜容积染毒适宜容积染毒 毒性较大的受试物给药量较小毒性较大的受试物给药量较小 毒性较低的受试物常需较大量的染毒毒性较低的受试物常需较大量的染毒 给药容积根据染毒途径和实验动物给药容积根据
25、染毒途径和实验动物 经口：经口：20ml/kg(20ml/kg(空腹动物空腹动物)经皮：经皮：2ml/kg2ml/kg 静脉：静脉：1ml/kg(5min1ml/kg(5min以上以上)受试物及处理(三三)染毒方法染毒方法 模拟实际接触的途径和方式模拟实际接触的途径和方式 受试物的性质和用途受试物的性质和用途 受试物毒性评价程序的要求受试物毒性评价程序的要求 有利于不同化学物之间结果的比较有利于不同化学物之间结果的比较 工业毒物：经呼吸道、皮肤工业毒物：经呼吸道、皮肤 农用化学物：经口、皮肤、呼吸道农用化学物：经口、皮肤、呼吸道 药品：经口、注射、皮肤药品：经口、注射、皮肤 食品：经口食品：经
26、口 环境污染物：经口、呼吸道、皮肤环境污染物：经口、呼吸道、皮肤 染毒途径染毒方法 消化道、呼吸道、皮肤、注射 染毒途径影响受试物急性毒性 染毒方法 不同途径的吸收量和吸收速率 吸收速率：静脉注射吸收速率：静脉注射呼吸道呼吸道肌肉注射肌肉注射腹腹腔注射腔注射皮下注射皮下注射消化道消化道皮内注射皮内注射经皮经皮 同一受试物不同染毒途径同一受试物不同染毒途径LD50的大小通常的大小通常符合上述规律符合上述规律经口（胃肠道）染毒LD50值来比较不同化学物急性毒性大小 灌胃灌胃：溶液或混悬液，以注射器经导管注入胃：溶液或混悬液，以注射器经导管注入胃内，内，等容量灌胃法等容量灌胃法 吞咽胶囊：将受试物装
27、入胶囊中，放至舌后部，吞咽胶囊：将受试物装入胶囊中，放至舌后部，迫使动物咽下。犬、猴迫使动物咽下。犬、猴 喂饲：将受试物掺入动物饲料或饮水中供实验喂饲：将受试物掺入动物饲料或饮水中供实验动物自行摄入动物自行摄入染毒方法灌胃法灌胃法常用实验动物一次参考最大灌胃量常用实验动物一次参考最大灌胃量动物动物体重体重（g）最大灌胃量最大灌胃量（ml）动物动物体重体重（g）最大灌胃量最大灌胃量（ml）小鼠小鼠20240.8豚鼠豚鼠2503004525300.93006.0301.0家兔家兔20002400100.0大鼠大鼠1001993.025003500150.0200249453500200.02503
28、006.0猫猫2500300050803008.03000100150狗狗1000015000200500灌胃法 灌胃法是用灌胃器将所应投给动物的药灌到动物胃内。小鼠的灌胃针长约45cm，直径为1mm，大鼠的灌胃针长约68cm，直径约1.2mm。灌胃针的尖端焊有一小圆金属球，金属球为中空的。焊金属球的目的是防止针头刺入气管或损伤消化道。针头金属球端弯曲成20左右的角度，以适应口腔、食道的生理弯曲度走向染毒方法 鼠类的灌胃法：用左手固定鼠，右手持灌胃器，将灌胃针从鼠的口腔插入，压迫鼠的头部，使口腔与食道成一直线,将灌胃针沿咽后壁慢慢插入食道，可感到轻微的阻力,此时可略改变一下灌胃针方向，以刺激引
29、起吞咽动作，顺势将药液注入。一般灌胃针插入小鼠深度为34cm，大鼠或豚鼠为46cm。静式吸入染毒 动式吸入染毒经呼吸道染毒v 气管内注入染毒方法v 吸入染毒静式吸入染毒染毒方法l方法：方法：一定体积的密闭容器，加入易挥发的液态或气态受试物一定体积的密闭容器，加入易挥发的液态或气态受试物l染毒柜体积、动物数、时间，依据实验动物最低需气量计算染毒柜体积、动物数、时间，依据实验动物最低需气量计算l优点：简单、方便、受试物消耗少，适合于小鼠优点：简单、方便、受试物消耗少，适合于小鼠l缺点：氧气减少，浓度不稳定，经皮吸收，不适合稍大动物，缺点：氧气减少，浓度不稳定，经皮吸收，不适合稍大动物，挥发性不强的
30、受试物用此法受限挥发性不强的受试物用此法受限 实验动物的最低需气量及不同染毒柜容积放置动物数（染毒实验动物的最低需气量及不同染毒柜容积放置动物数（染毒2h2h）实验动物实验动物呼吸量呼吸量最低需氧量最低需氧量定式染毒定式染毒2h2h可放动物数可放动物数(L/h)(L/h)(L/h)(L/h)25L25L50L50L100L100L300L300L1000L1000L小鼠小鼠1.451.454.504.503 35 56 610101212151536364040120120150150大鼠大鼠10.1810.1830.5430.540 01 11 1 2 25 56 616161818豚鼠豚鼠
31、10.1810.1830.5430.540 01 11 1 2 25 56 616161818猫猫19.3019.3057.9057.900 00 00 03 34 49 91010家兔家兔42.2542.25126.80126.800 00 00 01 14 45 5猴猴51.6051.60154.80154.800 00 00 01 13 34 4狗狗312.60312.6097.8097.800 00 00 00 01 1 动式吸入染毒 将实验动物处于有空气流动的染毒柜中，新鲜将实验动物处于有空气流动的染毒柜中，新鲜空气不断流入，污染空气不断流出。温度、湿度、空气不断流入，污染空气不断流
32、出。温度、湿度、氧及二氧化碳分压相对恒定，并有随时补充受试氧及二氧化碳分压相对恒定，并有随时补充受试物，维持浓度稳定。可采样监测受试物浓度，可物，维持浓度稳定。可采样监测受试物浓度，可持续接触受试物，无时间限制持续接触受试物，无时间限制 染毒方法动式吸入染毒装置的组成l染毒柜l机械通风系统l配气系统染毒方法动式吸入染毒设备动式吸入染毒设备A 整体暴露整体暴露 B 口鼻暴露口鼻暴露动式吸入染毒优缺点染毒方法l优点：受试物浓度和氧分压比较稳定优点：受试物浓度和氧分压比较稳定l缺点：设备要求高，消耗受试物量很大，缺点：设备要求高，消耗受试物量很大，操作比较复杂，费时费工操作比较复杂，费时费工经皮肤染
33、毒染毒方法 农药、化妆品、工业、环境、外用药物农药、化妆品、工业、环境、外用药物 常用大鼠常用大鼠 染毒方式：染毒方式：脱毛：化学或机械法脱毛（体表面积的10%）染毒：局部涂敷或大鼠、小鼠浸尾法 经注射途径染毒染毒方法 注射药品、机制研究、毒物代谢动力学 分类：几种动物不同注射途径注射量几种动物不同注射途径注射量(ml)(ml)范围范围（四）（四）剂量选择剂量选择 参考新化学物的理化性质参考新化学物的理化性质 参考相关资料参考相关资料 先用少量动物，以较大的剂量间隔染毒，找先用少量动物，以较大的剂量间隔染毒，找出出10%-90%10%-90%（或（或0%-100%0%-100%）的致死剂量范围
34、，）的致死剂量范围，然后设计正式实验的剂量和分组然后设计正式实验的剂量和分组 根据试验所选的根据试验所选的LDLD5050计算方法确定剂量组数计算方法确定剂量组数预试一般每组预试一般每组4只动物，每只动物，每次次3组，以组，以10倍为组距。根倍为组距。根据第一次预试结果判定需据第一次预试结果判定需要增加还是降低剂量，组要增加还是降低剂量，组距保持不变，直至粗略预距保持不变，直至粗略预测到测到LD100及及LD0为止。为止。各组剂量的计算i=（lgLD90-lgLD10）/（n-1）或 i=（lgLD100-lgLD0）/（n-1）i i为组距，为组距，n n为设计的剂量组数。以最为设计的剂量组
35、数。以最低剂量值（低剂量值（LDLD0 0或或LDLD1010）的对数剂量加上一）的对数剂量加上一个个i i值，即是第二个剂量组的对数剂量，值，即是第二个剂量组的对数剂量，依次类推直至最高剂量组依次类推直至最高剂量组剂量选择剂量选择 化学物化学物LDLD5050大于大于2g/kg 2g/kg 或或5g/kg5g/kg，表明毒性不大，表明毒性不大 我国药品的毒理研究指导原则规定要以最大容我国药品的毒理研究指导原则规定要以最大容积最高浓度给予动物后未见死亡积最高浓度给予动物后未见死亡不必计算LD50全面观察动物的各种反应和变化，仔细分析全面观察动物的各种反应和变化，仔细分析实验动物在染毒后出现的实
36、验动物在染毒后出现的中毒表现中毒表现、剂量效剂量效应应、时间分布时间分布。观察记录的内容：。观察记录的内容：中毒体征及发生过程中毒体征及发生过程 死亡情况和时间分布死亡情况和时间分布 体重体重 病理形态学变化病理形态学变化（五）（五）毒性作用观察毒性作用观察毒性作用观察中毒体征及发生过程 详细观察和记录动物出现的中毒体征详细观察和记录动物出现的中毒体征 发生时间发生时间 体征发展的经过体征发展的经过各个系统的特征各个系统的特征初步确定急性毒性靶器官初步确定急性毒性靶器官不同表现提供毒性机制的信息不同表现提供毒性机制的信息 续表6-1 啮齿类动物急性中毒表现 毒性作用观察死亡情况和时间分布 实验
37、动物的死亡数对LD50值产生明显影响 分析中毒死亡时间的分布规律可以提供重要信息：原形，代谢体重毒性作用观察 反映动物中毒后综合性整体变化，比较客观反映动物中毒后综合性整体变化，比较客观简便的量化指标简便的量化指标 应定期多次称量动物的体重变化，一般为每应定期多次称量动物的体重变化，一般为每周周1 1次或次或2 2次次 对体重指标的变化要仔细观察和分析对体重指标的变化要仔细观察和分析 体重变化的原因毒性作用观察影响食欲或消化系统的功能影响食欲或消化系统的功能影响食物的吸收和利用影响食物的吸收和利用影响水的摄取影响水的摄取肾功能急性损伤肾功能急性损伤毒性作用观察病理检查 死亡动物：大体病理变化，
38、如脏器外观、大小、死亡动物：大体病理变化，如脏器外观、大小、色泽的变化，有无充血、出血、水肿或其他改色泽的变化，有无充血、出血、水肿或其他改变变 存活动物：观察期结束时亦应进行解剖检查，存活动物：观察期结束时亦应进行解剖检查，必要时做组织病理学检查必要时做组织病理学检查（六）（六）观察时间和周期观察时间和周期 染毒以后应即刻开始观察动物中毒表现和死染毒以后应即刻开始观察动物中毒表现和死亡情况亡情况 给药当天应连续或多次观察，以后可根据情给药当天应连续或多次观察，以后可根据情况，每天况，每天2 2次或多次观察直至试验周期结束次或多次观察直至试验周期结束 观察周期一般为观察周期一般为1414天天
39、LDLD5050(LC(LC5050)计算时以观察周期内各组动物的计算时以观察周期内各组动物的总死亡数为依据总死亡数为依据 不同化学物质引起动物死亡的时间存在个不同化学物质引起动物死亡的时间存在个体差异体差异 速杀型化学毒物仅计算速杀型化学毒物仅计算24h24h的死亡率的死亡率 观察时间和周期急性毒性替代试验急性毒性替代试验-固定剂量法固定剂量法OECD组织验证组织验证：（：（11个国家的个国家的33个实验室个实验室比较固定法和经典法的结果）比较固定法和经典法的结果）替代试验替代试验-急性毒性分级法急性毒性分级法上下移动法（阶梯法）上下移动法（阶梯法）急性毒性试验求出急性毒性试验求出LDLD5
40、050(LC(LC5050)值，通过值，通过LDLD5050值进行急性毒性分级值进行急性毒性分级(acute toxicity(acute toxicity classification)classification)，评价毒物的急性毒性强弱，评价毒物的急性毒性强弱，比较毒物的急性毒性大小比较毒物的急性毒性大小四、急性毒性分级和评价四、急性毒性分级和评价急性毒性分级和评价 外源化学物急性毒性分级(WHO,2003）GB15193.3-2003食品安全性毒理学评价食品安全性毒理学评价程序和方法程序和方法的急性毒性分级标准的急性毒性分级标准农药急性毒性分级标准（农药急性毒性分级标准（GB1567G
41、B1567农药登农药登记毒理学试验方法记毒理学试验方法）大鼠、兔、大鼠、兔、豚鼠豚鼠大鼠大鼠大鼠大鼠急性毒性危害类别和急性毒性估计值（急性毒性危害类别和急性毒性估计值（GHS）（WHO-全球化学品统一分类和标签制度全球化学品统一分类和标签制度）接触途径接触途径第第1类类第第2类类第第3类类第第4类类第第5类类经口经口（mg/kg体重）体重）5503002000经皮经皮（mg/kg体重）体重）50200100020005000气体（气体（ppm，V）10050025005000蒸气（蒸气（mg/L）0.52.01020粉尘与烟雾粉尘与烟雾（mg/L）0.050.51.05LDLD5050的局限性
42、的局限性急性毒性试验程序急性毒性试验程序鉴定报告应包括如下内容鉴定报告应包括如下内容1.1.受试样品名称、理化性状、配制方法、所用浓度；受试样品名称、理化性状、配制方法、所用浓度；2.2.实验动物的种属、品系和来源（注明合格证号和动物级别）实验动物的种属、品系和来源（注明合格证号和动物级别）;3.3.实验动物饲养环境，包括饲料来源、室温、相对湿度、动物实验动物饲养环境，包括饲料来源、室温、相对湿度、动物实验室合格证号；实验室合格证号；4.4.所用染毒途径、染毒浓度和动物分组，每组所用动物性别、所用染毒途径、染毒浓度和动物分组，每组所用动物性别、数量及体重范围；数量及体重范围；5.5.计算计算L
43、DLD5050/LC/LC5050的方法；的方法；6.6.染毒后动物中毒表现及出现时间和恢复情况、死亡时间、大染毒后动物中毒表现及出现时间和恢复情况、死亡时间、大体解剖所见；体解剖所见；7.7.列表报告结果，计算的列表报告结果，计算的LDLD5050/LC/LC5050及其及其95%95%可信区间；可信区间；8.8.结论。结论。复习复习第三节第三节 局部毒性试验局部毒性试验 (Local toxic effect)(Local irritant effect)n机体暴露于化学物后，在其接触和暴露部分造机体暴露于化学物后，在其接触和暴露部分造成的局部毒性损伤、刺激（如眼刺激、皮肤刺成的局部毒性损
44、伤、刺激（如眼刺激、皮肤刺激）和（或）变态反应等激）和（或）变态反应等n刺激性、腐蚀性、致敏性刺激性、腐蚀性、致敏性n家兔一、眼刺激试验Draize眼刺激试验眼刺激试验（标准方法标准方法）部位及损伤情况部位及损伤情况积分积分A A混浊程度混浊程度(以最致密部位为准以最致密部位为准)无混浊无混浊0 0 散在或弥漫性混浊，虹膜清晰可见散在或弥漫性混浊，虹膜清晰可见1 1 半透明区易分辨，虹膜轻度模糊不清半透明区易分辨，虹膜轻度模糊不清2 2 出现灰白色半透明区，虹膜模糊不清，瞳孔大小勉强可见出现灰白色半透明区，虹膜模糊不清，瞳孔大小勉强可见3 3 角膜混浊，虹膜无法辨认角膜混浊，虹膜无法辨认4 4
45、B B角膜受损范围角膜受损范围 1/41/41 1 1/4 1/4l/2l/22 2 1/2 1/23/43/43 3 3/4 3/41 14 4眼各部位损伤评分表眼各部位损伤评分表积分积分AB5 最高积为最高积为80 角膜角膜 虹膜虹膜 结膜结膜 化学品毒性鉴定技术规范化学品毒性鉴定技术规范染毒后前染毒后前4 4天天最高总积分平均值最高总积分平均值刺激反应持续时间刺激反应持续时间（总积分平均值）（总积分平均值）刺激强度刺激强度0 0第第1d01d0无刺激性无刺激性2.52.5第第2d02d0轻刺激性轻刺激性1515第第4d=04d=0轻刺激性轻刺激性第第4d4d0 0中度刺激性中度刺激性25
46、25第第7d207d20，半数以上动物第，半数以上动物第7d107d10中度刺激性中度刺激性第第7d207d20，半数以上动物第，半数以上动物第7d7d10,10,但是无任但是无任何一只动物何一只动物7d7d3030中度刺激性中度刺激性第第7d207d20，半数以上动物第，半数以上动物第7d7d10,10,而且有一而且有一只动物只动物7d7d3030重度刺激性重度刺激性第第7d7d2020重度刺激性重度刺激性眼刺激强度评价标准眼刺激强度评价标准 化学品毒性鉴定技术规范化学品毒性鉴定技术规范二、皮肤刺激试验皮肤刺激试验皮肤刺激试验n取受试物取受试物0.5ml0.5ml（g g）n于除去受试物后的
47、于除去受试物后的1 1、2424和和48h48h观察涂抹部位皮肤反应观察涂抹部位皮肤反应 ，依据依据红斑红斑 和和水肿水肿的情况进行皮肤刺激反应评分的情况进行皮肤刺激反应评分n物种差异：有学者用物种差异：有学者用DraizeDraize试验测试了试验测试了4040种化学品成分，种化学品成分，皮肤反应的敏感顺序：兔皮肤反应的敏感顺序：兔 豚鼠豚鼠 人人 猪猪OECD皮肤腐蚀性体外试验方法皮肤腐蚀性体外试验方法n分离的大鼠皮肤、重建的人体皮肤、人分离的大鼠皮肤、重建的人体皮肤、人工膜模拟人体皮肤工膜模拟人体皮肤n评价指南规定：经上述体外皮肤腐蚀性评价指南规定：经上述体外皮肤腐蚀性试验发现受试物具有
48、皮肤腐蚀性作用，试验发现受试物具有皮肤腐蚀性作用，可不再进行动物皮肤刺激可不再进行动物皮肤刺激/腐蚀试验，并腐蚀试验，并可根据体外结果进行危害分级可根据体外结果进行危害分级n豚鼠豚鼠n豚鼠最大值试验：豚鼠最大值试验：诱导接触诱导接触（弗氏佐剂弗氏佐剂FCA+FCA+受受试物试物）间隔间隔10-1410-14天天激发接触激发接触n局部淋巴结试验局部淋巴结试验（local lymph node assaylocal lymph node assay，LLNALLNA）三、皮肤变态反应试验局部毒作用替代试验n眼刺激试验：眼刺激试验：家兔家兔n皮肤原发性刺激试验：皮肤原发性刺激试验：家兔家兔/豚鼠豚鼠n皮肤致敏实验：皮肤致敏实验：豚鼠，诱导接触和激发接触豚鼠，诱导接触和激发接触农药、化妆品、消毒剂农药、化妆品、消毒剂
