1、北京元业伯乐科技发展有限公司北京元业伯乐科技发展有限公司第1页，共90页。第2页，共90页。提纲提纲 PCR PCR简介简介 荧光定量荧光定量PCRPCR技术原理技术原理 荧光化学物质简介荧光化学物质简介 多重多重PCRPCR与内参照基因与内参照基因定量定量PCRPCR技术延伸技术延伸 基因分型（基因分型（SNPSNP）检测）检测 熔解曲线分析熔解曲线分析实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR技术简介：技术简介：第3页，共90页。PCRPCR概念概念什么是什么是PCRPCR？Polymerase Chain Reaction(Polymerase Chain Reaction(PCR)PCR)聚
2、合酶链反应是在体外选聚合酶链反应是在体外选择性的扩增特定择性的扩增特定DNADNA片段的方法。片段的方法。第4页，共90页。PCR PCR 循环循环NoImage第一步第一步 加热变性、双链打开加热变性、双链打开第二步第二步退火、引物与单链结合退火、引物与单链结合第三步第三步-引物延伸引物延伸变为两个双链变为两个双链DNADNA第5页，共90页。第6页，共90页。常规常规PCRPCR常规常规PCRPCR技术：技术：理论上理论上PCRPCR产物的积累是按照产物的积累是按照2 2n n指数扩增指数扩增PCR后借助电泳对扩增反应的后借助电泳对扩增反应的终产物终产物进行定量及进行定量及定定性性分析分析
3、DNA EngineS1 S2 M第7页，共90页。常规常规PCRPCR常规常规电泳分析方法的局限性电泳分析方法的局限性 只能对终产物进行分析，无法对起始模板准确定只能对终产物进行分析，无法对起始模板准确定量量对终产物分析，受对终产物分析，受PCR过程平台效应的干扰，定过程平台效应的干扰，定量准确度难以提高（相对误差量准确度难以提高（相对误差1000%）存在扩增）存在扩增产物的污染问题。产物的污染问题。必须在扩增反应结束后借助电泳方法分析，必须在扩增反应结束后借助电泳方法分析，费时费事而且费时费事而且EBEB有毒有毒无法对扩增反应实时检测无法对扩增反应实时检测第8页，共90页。提纲提纲 PCR
4、 PCR简介简介 荧光定量荧光定量PCRPCR技术原理技术原理 荧光化学物质简介荧光化学物质简介 多重多重PCRPCR与内参照基因与内参照基因 定量定量PCRPCR技术延伸技术延伸 基因分型（基因分型（SNPSNP）检测）检测 熔解曲线分析熔解曲线分析实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR技术简介：技术简介：第9页，共90页。定量定量PCRPCR定量定量PCRPCR技术：技术：利用利用荧光信号的变化实时检测荧光信号的变化实时检测PCRPCR扩增反应中扩增反应中每一个每一个循环扩增产物量的变化循环扩增产物量的变化，通过，通过CtCt值值和标准曲线实现对和标准曲线实现对起起始模板始模板的的定量分析定
5、量分析IQ5 Real-time PCR仪第10页，共90页。定量定量PCRPCR 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR三个关键词：三个关键词：实时，荧光，定量实时，荧光，定量 如何如何实时实时检测？检测？借助借助荧光荧光物质示踪扩增产物量的变化物质示踪扩增产物量的变化第11页，共90页。PCRPCR反应混合物反应混合物Mg2+Mn2+dCTPdGTPdTTPdATPTaq DNA多聚酶多聚酶引物引物模板模板DNA或或缓冲液缓冲液荧光物荧光物质质第12页，共90页。荧光曲线荧光曲线 随着随着PCRPCR反应的进行，扩增产物不断累积，荧光信号强度不反应的进行，扩增产物不断累积，荧光信号强度不断增
6、加。每经过一个循环，收集一次荧光强度信号，得到一断增加。每经过一个循环，收集一次荧光强度信号，得到一条荧光扩增曲线图条荧光扩增曲线图第13页，共90页。定量原理定量原理 如何对起始模板如何对起始模板定量定量？通过通过CtCt值值和和标准曲线标准曲线实现对实现对起始模板起始模板的的定量分析定量分析 引入两个概念：引入两个概念：荧光阈值、荧光阈值、CtCt值值第14页，共90页。定量原理定量原理荧光阈值荧光阈值在荧光扩增曲线指数增长期设定一个荧光强度标准在荧光扩增曲线指数增长期设定一个荧光强度标准(即即PCRPCR扩增产物量的标准扩增产物量的标准)阈值线阈值线第15页，共90页。CtCt值的概念值
7、的概念定量原理定量原理CtCt值的定义是值的定义是PCRPCR扩增过程中，扩增产物扩增过程中，扩增产物(荧光信荧光信号）到达阈值时所经过的扩增循环次数号）到达阈值时所经过的扩增循环次数C(t)值值C(t)值值18.12+/0.04-阈值线阈值线第16页，共90页。模板起始浓度越高，Ct值越小定量原理定量原理CTCT值与值与模板起始浓度模板起始浓度的关系的关系哪个样品浓度高？哪个样品浓度高？第17页，共90页。阈值选择阈值选择阈值的选择阈值的选择荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在指数扩增阶段任意位置上值，它可以设定在指数扩增阶段任意位
8、置上缺省设置一般是缺省设置一般是3-153-15个循环的荧光信号的标准偏差个循环的荧光信号的标准偏差的的1010倍。倍。但实际应用时要结合扩增效率、线形回归系但实际应用时要结合扩增效率、线形回归系数等参数来综合考虑数等参数来综合考虑 第18页，共90页。实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR方法利用方法利用CtCt的概念，在指数扩增的开始的概念，在指数扩增的开始阶段进行检测，此时样品间的细小误差尚未放大，因此阶段进行检测，此时样品间的细小误差尚未放大，因此该该CtCt值具有值具有极好的重复性极好的重复性。CtCt值的重现性值的重现性第19页，共90页。终点处检测产物量不恒定；终点处检测产物量不恒
9、定；CtCt值则极具重现性值则极具重现性 CtCt值的重现性值的重现性相同模板在同一台相同模板在同一台PCRPCR仪上相同条件下重复仪上相同条件下重复9696次扩增的扩增曲线图次扩增的扩增曲线图第20页，共90页。定量原理定量原理 理想的理想的PCRPCR反应：反应：X=X X=X0 0*2 2n n 非理想的非理想的PCRPCR反应：反应：X=X X=X0 0(1+Ex)(1+Ex)n n n n：扩增反应的循环次数：扩增反应的循环次数 X X：第：第n n次循环后的产物量次循环后的产物量 X X0 0：初始模板量：初始模板量 Ex Ex：扩增效率：扩增效率第21页，共90页。在扩增产物达到
10、阈值线时:XCt=X0(1+Ex)Ct=N (1)XCt:荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量.在阈值线设定以后,它是一个常数,我们设为N.方程式(1)两边同时取对数得:logN=logX0(1+Ex)Ct (2)整理方程式(2)得:logXlogX0 0=-log(1+Ex)=-log(1+Ex)*Ct+log NCt+log N (3)(3)Ct=-1/log(1+Ex)Ct=-1/log(1+Ex)*logX0+log N/log(1+Ex)logX0+log N/log(1+Ex)(4)(4)LogLog浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域
11、值的循环数就可计算出样品中所含的模板量到域值的循环数就可计算出样品中所含的模板量定量原理定量原理第22页，共90页。l初始模板的初始模板的对数值对数值与与循循环数（环数（CTCT值值)呈线性关系呈线性关系l初始模板量越多初始模板量越多,扩增产扩增产物达到某一值（域值）时物达到某一值（域值）时所需要的循环数越少所需要的循环数越少确定初始模板的浓度确定初始模板的浓度定量原理定量原理第23页，共90页。Absolute（绝对定量）（绝对定量）Determines input quantity of a nucleic acid targetRequires a standard curve Rela
12、tive（相对定量）（相对定量）Determines fold differences in input target nucleic acid quantities between samplesPerformed with or without a standard curveTypically used for gene expression analysis with a target gene normalized to a reference gene14500 copies定量方法定量方法 第24页，共90页。定量原理：利用已知起始拷贝数的标准样品作出标准曲线,通过未知样品的Ct
13、值,从标准曲线上计算出该样品的起始浓度。绝对定量绝对定量荧光强度荧光强度-循环数曲线循环数曲线初始模板量对数初始模板量对数-C(T)循环数标准曲线循环数标准曲线.未知未知10410310610510210第25页，共90页。首先确定未知样品的首先确定未知样品的 C(t)C(t)值值 借助标准曲线由未知样品的借助标准曲线由未知样品的C(t)C(t)值反推出其初始量值反推出其初始量 得到未知样品初始量绝对值得到未知样品初始量绝对值unknown104103Unknown contains 3108 copies绝对定量绝对定量第26页，共90页。相对定量相对定量相对定量相对定量 CT 法法 未进行
14、归一化未进行归一化经过校正经过校正CT法法 校正加入反应体系当中模板量校正加入反应体系当中模板量 通常使用内参进行校正通常使用内参进行校正 第27页，共90页。CTCT 认为扩增效率为认为扩增效率为100%只能使用一个内参进行校正只能使用一个内参进行校正Pfaffl Modification 根据扩增效率进行分析根据扩增效率进行分析 只能使用一个内参进行校正只能使用一个内参进行校正Vandesompele Method 根据扩增效率进行分析根据扩增效率进行分析 可以使用多个内参进行校正可以使用多个内参进行校正SimpleComplex第28页，共90页。CTGOITissue#2:Tissue
15、#1:2224Delta Ct:24-22=2Fold induction=22=4第29页，共90页。Livak Comparative Ct Method(2-DDCt)for Relative Quantification1.Normalize C(t):C(t)=C(t)target-C(t)hskg2.Calculate C(t)Average:C(t)Ave=Average C(t)of replicates 3.Normalize to calibrator:C(t)=C(t)Sample Ave-C(t)Calibrator Ave(For calibrator,C(t)=0)
16、4.Fold difference:F=2-C(t)=Normalized fold difference(For calibrator,2-C(t)=1)Note,this formula can be modified to account for reaction efficiencies(Dr.M.Pfaffl)and multiple reference genes(Dr.J.Vondosomple).相对定量相对定量 CT 第30页，共90页。ReferenceGOI21Tissue#2:Tissue#1:202224Delta Ct#2:Delta Ct#1:22-21=124-
17、20=41st DeltaDelta Ct:4-1=32nd DeltaFold induction=23=8CT第31页，共90页。Relative QuantificationCtStarting quantity90%2422vProblem with the CT第32页，共90页。Ct90%2422100%Starting quantityRelative QuantificationvCT缺陷v斜率不一样第33页，共90页。Efficiencytarget deltaCt target(control-sample)Fold induction=Efficiencyreferenc
18、e deltaCt reference(control-sample)Efficiency=10-1/slope(Pfaffl,2001;Nucleic Acid Research)Efficiencytarget deltaCt target(control-sample)Fold induction=Efficiencyreference deltaCt reference(control-sample)Relative Quantification Pfaffl第34页，共90页。Primer set#1ReferencePrimer set#2 GOI21Tissue#2:Tissue
19、#1:20222490%=1.9Delta Ct:Efficiency:20-21=-1100%=224-22=22target deltaCt target(24-22=2)Fold induction=1.9reference deltaCt reference(20-21=-1)=40.53=7.50.537.5(From Standard curve)Relative Quantification Pfaffl Modification第35页，共90页。Ct 方法方法:(没有内参没有内参)表达倍数表达倍数:4 Ct 方法方法:(有内参有内参)表达倍数表达倍数:8Pfaffl 修正修正
20、:(内参内参+效率效率)表达倍数表达倍数:7.5方法比较方法比较第36页，共90页。与传统与传统PCRPCR的比较的比较 实现了初始模板的绝对定量实现了初始模板的绝对定量 检测灵敏度高检测灵敏度高 可以检测到低拷贝的目的基因可以检测到低拷贝的目的基因 可以区分微小的拷贝数差异可以区分微小的拷贝数差异 可以对初始模板含量差异较大的样品同时定量可以对初始模板含量差异较大的样品同时定量 省时省力省时省力 检测设计灵活检测设计灵活第37页，共90页。提纲提纲 PCR PCR简介简介 荧光定量荧光定量PCRPCR技术原理技术原理 荧光化学物质简介荧光化学物质简介 多重多重PCRPCR与内参照基因与内参照
21、基因 定量定量PCRPCR技术延伸技术延伸 基因分型（基因分型（SNPSNP）检测）检测 熔解曲线分析熔解曲线分析实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR技术简介：技术简介：第38页，共90页。SYBR Green 1 Molecular Beacons TaqMan荧光化学荧光化学第39页，共90页。SYBR Green ISYBR Green I第40页，共90页。SYBR Green I SYBR Green I 工作原理工作原理l SYBR Green 1SYBR Green 1 结合到双链结合到双链DNADNA的小沟部位的小沟部位l SYBR Green 1SYBR Green 1 染料
22、只有和双链染料只有和双链DNADNA结合后才发荧结合后才发荧光光GTTTGGCCCCCCCAAAGGGACTTGATAGCATCGTAA第41页，共90页。SYBR Green I SYBR Green I 工作原理工作原理Extension53535353Extension ContinuedApply ExcitationWavelength535355TaqTaq353TaqTaq55RepeatBDBDBDBDBDBDBDBDBDBDlllll第42页，共90页。SYBR Green I SYBR Green I 工作原理工作原理第43页，共90页。SYBR Green I SYBR
23、Green I 优点优点l 使用方便使用方便 -不必设计复杂的荧光探针不必设计复杂的荧光探针 l 没有序列特异性没有序列特异性 -可以用于不同的模板可以用于不同的模板 l 便宜便宜 l 灵敏灵敏第44页，共90页。SYBR Green I SYBR Green I 缺点缺点l与非特异性产物结合与非特异性产物结合l无法实现多个目的基因的检测无法实现多个目的基因的检测第45页，共90页。关于关于SYBR Green ISYBR Green I一种一种最基础最基础的实验手段的实验手段评价引物特异性：评价引物特异性：使用熔点曲线分析（使用熔点曲线分析（Melt Curve AnalysisMelt C
24、urve Analysis）评价引物对扩增效率：评价引物对扩增效率：将模板进行梯度稀释将模板进行梯度稀释研究最适反应条件：研究最适反应条件：使用梯度功能进一步优化实验条件使用梯度功能进一步优化实验条件第46页，共90页。Molecular BeaconsMolecular Beacons发夹型杂交探针发夹型杂交探针第47页，共90页。Molecular BeaconsMolecular Beacons原理：荧光偏振能量传递（原理：荧光偏振能量传递（FRETFRET）茎由互补配对的序列组成茎由互补配对的序列组成环与目标序列完全配对环与目标序列完全配对茎茎荧光素荧光素淬灭剂淬灭剂环环第48页，共9
25、0页。变性变性:产生非特异性的荧光产生非特异性的荧光TACCGGGGGTTACGAACGGTAATTACCGGGGGTTACGAACGGTAATMolecular BeaconsMolecular Beacons第49页，共90页。Target-loop interaction more stable than stem-stemTACCGGGGGTTACGAACG GTAATTTTTGCCCCCAAAAQRTarget 退火时退火时:探针与靶序列结合探针与靶序列结合荧光素与淬灭剂分离荧光素与淬灭剂分离发出荧光（靶序列特异的）发出荧光（靶序列特异的）MolecularMolecularBeac
26、onsBeacons第50页，共90页。延伸延伸:没有荧光没有荧光Molecular Beacons SNPMolecular Beacons SNP第51页，共90页。Molecular Beacons Molecular Beacons 实验结果实验结果第52页，共90页。Molecular Beacons Molecular Beacons 优点优点l 对目标序列有很高的特异性对目标序列有很高的特异性 用于用于SNPSNP检测的最灵敏的试剂之一检测的最灵敏的试剂之一l 可以实现多通道检测可以实现多通道检测l 荧光背景低荧光背景低第53页，共90页。Molecular BeaconsMol
27、ecular Beacons缺点缺点l 设计困难设计困难l 只能用于一个特定的目标只能用于一个特定的目标l 价格较高价格较高 第54页，共90页。TaqManTaqMan探针探针荧光素荧光素淬灭剂淬灭剂水解型杂交探针水解型杂交探针第55页，共90页。TaqManTaqManl 目标特异性探针目标特异性探针l 5 5为荧光素，为荧光素，3 3为淬灭剂为淬灭剂5 荧光素3淬灭剂与目标序列互补与目标序列互补第56页，共90页。5533d.NTPsThermal Stable DNA PolymerasePrimers5353535353535353Add Master Mix and SampleD
28、enaturation535353535353AnnealingReaction TubeTaql53RQProbe53RQTaqManTaqMan工作原理工作原理第57页，共90页。535353RQExtension Step531.Strand DisplacementTaq5533QTaqR52.Cleavage3.PolymerizationComplete53QTaqR354.Detection533QTaqR5lTaqManTaqMan工作原理工作原理R3Q第58页，共90页。TaqManTaqMan实验结果实验结果第59页，共90页。TaqManTaqMan优点优点l 对目标序列
29、有很高的特异性对目标序列有很高的特异性 -特别适合于特别适合于SNPSNP检测检测l可以实现可以实现多通道检测多通道检测 l与与 Molecular Beacons Molecular Beacons 相比设计相比设计 相相对简单对简单第60页，共90页。TaqManTaqMan缺点缺点 价格较高价格较高 只适合于一个特定的目标只适合于一个特定的目标 不能进行融解曲线分析不能进行融解曲线分析 背景高背景高第61页，共90页。兼容化学试剂总结兼容化学试剂总结结合于双链结合于双链DNA的小沟的小沟中中发夹型杂交探发夹型杂交探针针水解型杂交探水解型杂交探针（针（5-3外外切）切）延伸延伸复性复性任何
30、任何步骤步骤定量和检测目标基因定量和检测目标基因熔解曲线分析熔解曲线分析SNP分析分析定量和检测目标基因定量和检测目标基因SNP分析分析定量和检测目标基因定量和检测目标基因信号检测信号检测工作原理工作原理有否淬灭剂有否淬灭剂化学试剂化学试剂否否有有有有主要应用范围主要应用范围第62页，共90页。提纲提纲 PCR PCR简介简介 荧光定量荧光定量PCRPCR技术原理技术原理 荧光化学物质简介荧光化学物质简介 多重多重PCR与内参照基因与内参照基因 定量定量PCRPCR技术延伸技术延伸 基因分型（基因分型（SNPSNP）检测）检测 熔解曲线分析熔解曲线分析实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR技术简
31、介：技术简介：第63页，共90页。多重多重PCR在一个在一个PCRPCR管中进行多个不同的管中进行多个不同的PCRPCR反应：反应：同一样本，多对引物，分别扩增不同的靶基因同一样本，多对引物，分别扩增不同的靶基因 目标基因目标基因 内参照基因（看家基因）内参照基因（看家基因）不同荧光标记的探针识别不同的靶基因不同荧光标记的探针识别不同的靶基因第64页，共90页。内参照基因内参照基因 解决模板提取过程中造成的差别解决模板提取过程中造成的差别 解决样品材料不均一造成的差别解决样品材料不均一造成的差别 解决加样过程中的差别解决加样过程中的差别内参照基因内参照基因第65页，共90页。多通道技术多通道技
32、术多通道技术：多通道技术：使用多种荧光染料使用多种荧光染料 在不同的检测通道内同时测定多种不同在不同的检测通道内同时测定多种不同 荧光染料发出的荧光荧光染料发出的荧光第66页，共90页。1 1、引物及探针问题、引物及探针问题-引物及探针的相互干扰引物及探针的相互干扰2 2、不同、不同PCRPCR反应要在同样扩增条件下进行反应要在同样扩增条件下进行2 2、模板量差别、模板量差别-共用资源的相互竞争共用资源的相互竞争多重多重PCR技术问题技术问题一个一个PCRPCR管内进行多重管内进行多重PCRPCR扩增要解决的问题：扩增要解决的问题：第67页，共90页。FRRQFRRQFRRQRQ多重多重PCR
33、PCR技术问题技术问题1 1、引物及探针相互干扰问题、引物及探针相互干扰问题第68页，共90页。FRRQFRRQRQRQRQRQRQRQRQRQRQRQRQRQRQRQRQRQRQRQRQRQ2 2、共用资源的相互竞争、共用资源的相互竞争多重多重PCRPCR技术问题技术问题第69页，共90页。单双通道同时进行，相互验证单双通道同时进行，相互验证FRRQFRRQRQRQRQRQRQRQRQRQRQRQRQRQRQRQRQRQ单单单单双双多重多重PCRPCR技术问题技术问题第70页，共90页。提纲提纲 PCR PCR简介简介 荧光定量荧光定量PCRPCR技术原理技术原理 荧光化学物质简介荧光化学物
34、质简介 多重多重PCR与内参照基因与内参照基因定量定量PCRPCR技术延伸技术延伸 熔解曲线分析熔解曲线分析 基因分型（基因分型（SNPSNP）检测）检测实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR技术简介：技术简介：第71页，共90页。Temperature increasesFluorescencedecreasesTm Graph fluorescence intensity vs.temperature Graph fluorescence intensity vs.temperature Decreasing fluorescence recorded Decreasing fluoresc
35、ence recorded -Due to increasing temperature -Due to increasing temperature -Due to denaturation and release of SGI -Due to denaturation and release of SGI Tm is the point of inflection on the melting curve Tm is the point of inflection on the melting curveSYBR Green I SYBR Green I 融解曲线分析融解曲线分析第72页，
36、共90页。荧光强度值荧光强度值随温度变化速率随温度变化速率对温度作图对温度作图(-dI/dT)-dIdTTmSYBR Green I SYBR Green I 融解曲线分析融解曲线分析第73页，共90页。SYBR Green I SYBR Green I 融解曲线分析融解曲线分析10,000 copies非特异性产物非特异性产物目的产物目的产物目的产物目的产物10 copies第74页，共90页。10,000 copies10 copies0 copies 溶解曲线溶解曲线扩增曲线扩增曲线1.95oC for 15 min2.94oC for 10 sec3.63oC for 15 sec4.
37、72oC for 30 sec5.Plate Read6.84oC for 1 sec7.Plate Read8.Go to line 2 39 more times9.Melting curve from 65oC to 95oC,read every 0.2oC,hold 1 sec.SYBR Green I SYBR Green I 融解曲线分析融解曲线分析第75页，共90页。10,000 copies10 copies0 copies 溶解曲线溶解曲线1.95oC for 15 min2.94oC for 10 sec3.63oC for 15 sec4.72oC for 30 sec
38、5.Plate Read6.84oC for 1 sec7.Plate Read8.Go to line 2 39 more times9.Melting curve from 65oC to 95oC,read every 0.2oC,hold 1 sec.扩增曲线扩增曲线SYBR Green I SYBR Green I 融解曲线分析融解曲线分析第76页，共90页。进行可靠的定量实验需要对引物对进行优化设计进行可靠的定量实验需要对引物对进行优化设计 用于优化扩增产物产量和特异性的参数用于优化扩增产物产量和特异性的参数-引物设计引物设计 -扩增片段选择扩增片段选择-试剂的浓度试剂的浓度-循环
39、条件循环条件l 变性温度和退火温度变性温度和退火温度Real-time PCRReal-time PCR体系优化体系优化第77页，共90页。利用动态温度梯度功能一次实现退火温度的优化利用动态温度梯度功能一次实现退火温度的优化Real-time PCRReal-time PCR体系优化体系优化第78页，共90页。45oC55oC65oC溶解曲线溶解曲线扩增曲线扩增曲线1.95oC for 15 min2.94oC for 10 sec3.Gradient from 45oC to 65oC for 15 sec4.72oC for 30 sec5.83oC for 1 sec6.Plate Re
40、ad7.Go to line 2 39 more times8.Melting curve from 65oC to 95oC,readevery 0.2oC,hold 1 sec.Real-time PCRReal-time PCR体系优化体系优化第79页，共90页。提纲提纲 PCRPCR简介简介 荧光定量荧光定量PCRPCR技术原理技术原理 荧光化学物质简介荧光化学物质简介 多重多重PCRPCR与内参照基因与内参照基因定量定量PCRPCR技术延伸技术延伸 熔解曲线分析熔解曲线分析 基因分型（基因分型（SNP）检测）检测实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR技术简介：技术简介：第80页，共90
41、页。FRFQGVQTCSNP G/AFQGVQTForward primerReverse primerAllele-specific probeAllele-specific probe用用TaqManTaqMan探针进行基因型分析探针进行基因型分析SNPSNP检测检测-基因型分析基因型分析第81页，共90页。Match for Allele 1Mismatch for Allele 1F5 GCQ5 3 CGFQV5 3 CTQ5 3 Hybridization of TaqMan ProbeDigestion of probe-fluorescenceNO digestion of pr
42、obe-NO fluorescenceReduced Efficiency of Probe HybridizationPolymeraseQTVQGFQ多色双通道技术应用多色双通道技术应用-基因型分析基因型分析第82页，共90页。l从病人血液样品中提取从病人血液样品中提取 DNA DNA l基因型分类：基因型分类：A/A(Allele 1)A/A(Allele 1)G/G(Allele 2)G/G(Allele 2)G/A(Heterozygote)G/A(Heterozygote)多色双通道技术应用多色双通道技术应用-基因型分析基因型分析CFQTVQ第83页，共90页。Allele 1 c
43、ontrolVICFAM多色双通道技术应用多色双通道技术应用-基因型分析基因型分析第84页，共90页。Allele 2 controlVICFAM多色双通道技术应用多色双通道技术应用-基因型分析基因型分析第85页，共90页。Heterozygote controlFAMVIC多色双通道技术应用多色双通道技术应用-基因型分析基因型分析第86页，共90页。SYBR Green ISYBR Green I进行进行SNPSNP分析分析 Mismatches are extended at 1,000 fold lower efficiency,resulting in 10-cycle delay i
44、n product accumulation Both matches and mismatches can amplify with similar final quantity of product PCR primers with SNP site at 3 endC5PCR#1T5PCR#2第87页，共90页。SYBR Green ISYBR Green I进行进行SNPSNP分析分析MatchMismatch第88页，共90页。实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR应用应用定量：定量：l DNA DNA定量定量l RNA RNA定量定量定性：定性：l SNP SNP分析分析l 基因型分析基因型分析l RNA RNA变异分析变异分析l 融解曲线分析融解曲线分析 第89页，共90页。感谢各位光临！感谢各位光临！第90页，共90页。
