1、第十五章第十五章 免疫学应用免疫学应用教学目的：教学目的：掌握掌握：基于抗原抗体反应的检测方法；免疫细胞的检测方法 ；人工（自然）主动免疫、人工（自然）被动免疫的概念。理解理解：基于抗原-抗体反应的特点及影响因素；免疫分子的检测原理；免疫细胞的检测方法与原理；以抗体、细胞和细胞因子为基础的免疫治疗了解了解：免疫分子的检测原理；免疫学诊断的原理、常用的免疫功能检测指标；免疫治疗制剂的类型和作用机制 使用教材：使用教材：医学免疫学医学免疫学（第二版），龚非力主编，科学出（第二版），龚非力主编，科学出版社，版社，2019年。年。参考教材：参考教材：医学免疫学医学免疫学（第五版），金伯泉主编，（第五版
2、），金伯泉主编，人民卫生出版社，人民卫生出版社，2019年；年；/（一）特异性和交叉反应（一）特异性和交叉反应 特异性特异性：一种抗原通常仅能：一种抗原通常仅能与由它刺激所产生的抗体结合与由它刺激所产生的抗体结合。分子基础：分子基础：抗原表位与抗体分抗原表位与抗体分子高变区之间空间构型的互补子高变区之间空间构型的互补性性。结合价：结合价：天然抗原分子表面一般含多种抗原决定基，可与天然抗原分子表面一般含多种抗原决定基，可与多个抗体分子结合，为多价。单体形式的抗体分多个抗体分子结合，为多价。单体形式的抗体分子有两个子有两个FabFab段，能结合两个相同的抗原决定基，段，能结合两个相同的抗原决定基，
3、为两价。为两价。前带现象（前带现象（prozoneprozone）和后带现象）和后带现象(postzone)(postzone)Ab过剩和过剩和Ag过剩过剩（二）抗原（二）抗原-抗体结合的带现象与可见性抗体结合的带现象与可见性前带现象（前带现象（prozoneprozone）和后带现象）和后带现象(postzone)(postzone)AbAb过剩和过剩和AgAg过剩过剩抗原抗原-抗体反应为分子表面的非共价结合，结合抗体反应为分子表面的非共价结合，结合虽稳定但可逆。在一定条件下（如低虽稳定但可逆。在一定条件下（如低pHpH、高浓度、高浓度盐、冻融等），抗原盐、冻融等），抗原-抗体复合物可被解离
4、。解抗体复合物可被解离。解离后的抗原和抗体仍保持原有理化特性和生物学离后的抗原和抗体仍保持原有理化特性和生物学活性。根据此特点，可借助亲和层析法纯化抗原活性。根据此特点，可借助亲和层析法纯化抗原或抗体。或抗体。（三）可逆性（三）可逆性 抗原和抗体有对应的极性基团，能相互吸附并抗原和抗体有对应的极性基团，能相互吸附并由亲水性变为疏水性。电解质的存在使抗原由亲水性变为疏水性。电解质的存在使抗原-抗抗体复合物失去电荷而凝聚，出现可见反应，故体复合物失去电荷而凝聚，出现可见反应，故免疫学试验中免疫学试验中多用生理盐水稀释抗原或抗体多用生理盐水稀释抗原或抗体。抗原抗体反应的最适抗原抗体反应的最适pHpH
5、是是6-86-8。最适温度为最适温度为3737。有些例外，如冷凝集素在。有些例外，如冷凝集素在 44左右与红细胞结合最好，左右与红细胞结合最好，2020以上反而以上反而解离。解离。抗体分子上一个抗抗体分子上一个抗原结合点与对应的原结合点与对应的抗原决定基之间的抗原决定基之间的结合能力结合能力亲和力亲和力(affinity)一个抗体分子与一个抗体分子与整个抗原分子间整个抗原分子间的结合强度的结合强度亲合力亲合力(avidity)根据抗原的性质、结合反应的现象、参与反根据抗原的性质、结合反应的现象、参与反应的成分等因素分类：应的成分等因素分类：（一）凝集反应（一）凝集反应（二）沉淀反应（二）沉淀反
6、应（三）补体参加的反应（三）补体参加的反应（四）（四）免疫标记技术免疫标记技术颗粒性抗原（细菌或细胞等）与相应抗体结合，颗粒性抗原（细菌或细胞等）与相应抗体结合，在一定条件下，出现肉眼可见的凝集物，称为凝在一定条件下，出现肉眼可见的凝集物，称为凝集反应集反应(agglutination)(agglutination)。（一）凝集反应（一）凝集反应（Agglutination TestsAgglutination Tests）直接凝集直接凝集+Qualitative agglutination test（定性（定性凝集凝集实验）实验）Ag or Ab Applications Blood typ
7、ing（血型测定）Bacterial infections（细菌性感染）Practical considerations Easy（简便）Semi-quantitative（半定量）lApplications Measurement of antibodies to soluble antigens+3 3、间接凝集抑制试验、间接凝集抑制试验应用：可用于检测抗原或抗体（如早孕的检测），其应用：可用于检测抗原或抗体（如早孕的检测），其 灵敏度高于一般间接凝集试验。灵敏度高于一般间接凝集试验。（二）沉淀反应（二）沉淀反应Definition:Definition:可溶性抗原可溶性抗原（血清蛋白、外
8、毒素、（血清蛋白、外毒素、细菌滤液等）与相应抗体结合，在一定条件下，细菌滤液等）与相应抗体结合，在一定条件下，形成出现肉眼可见的沉淀物的现象称为沉淀反应。形成出现肉眼可见的沉淀物的现象称为沉淀反应。该反应多用半固体琼脂凝胶作为介质进行琼脂扩散或免疫扩散，即可溶性抗原与抗体在凝胶中扩散，在比例合适处相遇即形成可见的白色沉淀。（二）沉淀反应（二）沉淀反应（Precipitation Tests）（二）沉淀反应（二）沉淀反应单扩与双单扩与双扩原理扩原理Ag-Ab反应的基本检测方法反应的基本检测方法用荧光素、酶、放射性核素或化学发光物质等标用荧光素、酶、放射性核素或化学发光物质等标记抗体或抗原，进行抗
9、原记抗体或抗原，进行抗原-抗体反应的检测，是目抗体反应的检测，是目前应用最为广泛的免疫学检测技术。标记物与抗前应用最为广泛的免疫学检测技术。标记物与抗体或抗原连接后并不改变抗原抗体的免疫特性，体或抗原连接后并不改变抗原抗体的免疫特性，具有灵敏度高、快速、可定性、定量、定位等优具有灵敏度高、快速、可定性、定量、定位等优点。点。免疫标记技术免疫标记技术（Immunolabelling techniqueImmunolabelling technique）此法乃用荧光素与抗体连接成荧光抗体，此法乃用荧光素与抗体连接成荧光抗体，再与待检标本中抗原反应，置荧光显微镜下观再与待检标本中抗原反应，置荧光显微
10、镜下观察，抗原察，抗原-抗体复合物散发荧光，借此对抗原抗体复合物散发荧光，借此对抗原进行定性或定位。进行定性或定位。1 1免疫荧光法免疫荧光法(immunofluorescence,IF)(immunofluorescence,IF)免疫荧光法分类免疫荧光法分类Mouse kidney sectionControlTSLP HASMC 此法将抗原此法将抗原-抗体反应的特异性与抗体反应的特异性与酶催化作用酶催化作用的高效性相结合，借助酶作用于底物的显色反应的高效性相结合，借助酶作用于底物的显色反应判定结果。应用酶标测定仪测定光密度（判定结果。应用酶标测定仪测定光密度（ODOD）值）值可反映抗原含
11、量，灵敏度达可反映抗原含量，灵敏度达ng/mlng/ml甚至甚至pg/mlpg/ml水平。水平。常见的标记物为：辣根过氧化物酶（常见的标记物为：辣根过氧化物酶（HRPHRP）和碱）和碱性磷酸酶（性磷酸酶（APAP）酶免疫测定酶免疫测定(enzyme immunoassay,EIA)(enzyme immunoassay,EIA)是酶免疫测定中应用最广的技术，用于是酶免疫测定中应用最广的技术，用于测定测定可溶性抗原或抗体。可溶性抗原或抗体。优点：灵优点：灵敏度高、操作简便、稳定性强，可敏度高、操作简便、稳定性强，可自动化检测，从而被广泛用于检测多种病原自动化检测，从而被广泛用于检测多种病原体抗原
12、或抗体、血液及其他体液中微量蛋白体抗原或抗体、血液及其他体液中微量蛋白成分、细胞因子等。成分、细胞因子等。双抗体夹心法：双抗体夹心法：用于检测特异性抗原用于检测特异性抗原。该试验所用的包被抗体与酶。该试验所用的包被抗体与酶标抗体应分别针对不同抗原决定基，或其中之一用标抗体应分别针对不同抗原决定基，或其中之一用多克隆抗体，且相互间应无交叉反应。多克隆抗体，且相互间应无交叉反应。间接法：间接法：用于检测特异性抗体用于检测特异性抗体。用已知抗原包被固相，加入。用已知抗原包被固相，加入待检血清标本，再加酶标记的二抗，加底物观察显待检血清标本，再加酶标记的二抗，加底物观察显色反应。色反应。ELISA反应
13、过程反应过程动画演示动画演示v生物素（生物素（biotinbiotin）是广泛分布于动、植物体内是广泛分布于动、植物体内的一种生长因子，又称辅酶的一种生长因子，又称辅酶R R或维生素或维生素H H。v亲和素亲和素(avidin)(avidin)是卵白及某些微生物中的一种是卵白及某些微生物中的一种蛋白质，由蛋白质，由4 4个亚单位组成。个亚单位组成。v生物素与亲和素间具有高度亲和力，且均能偶生物素与亲和素间具有高度亲和力，且均能偶联抗体、抗原和辣根过氧化物酶而不影响其生物联抗体、抗原和辣根过氧化物酶而不影响其生物学活性。学活性。3）BAS（biotin avidin system)-ELISA：
14、BAS-ELISA 应用应用酶标记酶标记的抗体与的抗体与组织或细胞抗原组织或细胞抗原发生反发生反应，应，结合形态学观察结合形态学观察，对组织或细胞表面抗原，对组织或细胞表面抗原进行定性、定量、定位。进行定性、定量、定位。IHC 乃用放射性核素标记抗原或抗体进行免疫学乃用放射性核素标记抗原或抗体进行免疫学检测。该法兼有放射性核素的高灵敏度和抗原检测。该法兼有放射性核素的高灵敏度和抗原-抗体反应的特异性，检测灵敏度达抗体反应的特异性，检测灵敏度达pgpg水平。常用水平。常用于标记的放射性核素为于标记的放射性核素为125125I I和和131131I I，分为液相和固，分为液相和固相两种方法。相两种
15、方法。该法常用于测定该法常用于测定微量物质微量物质，如胰岛素、生长，如胰岛素、生长激素、甲状腺素、孕酮等激素，吗啡、地高辛、激素、甲状腺素、孕酮等激素，吗啡、地高辛、IgEIgE等。等。3 3放射免疫测定法放射免疫测定法(radioimmunoassay,RIA)(radioimmunoassay,RIA)化学发光免疫分析化学发光免疫分析 将将发光物质（如吖啶酯、鲁米诺等）标记发光物质（如吖啶酯、鲁米诺等）标记抗抗原或抗体，发光物质在反应剂（如过氧化阴离子原或抗体，发光物质在反应剂（如过氧化阴离子）激发下发射光子，通过自动发光分析仪测定光）激发下发射光子，通过自动发光分析仪测定光子产量，可反映
16、待检样品中抗体或抗原含量。子产量，可反映待检样品中抗体或抗原含量。该法灵敏度高，常用于检测该法灵敏度高，常用于检测血清超微量血清超微量活性活性物质（甲状腺素等激素）。物质（甲状腺素等激素）。该法又称该法又称WesternWestern印迹法，其结合凝胶电印迹法，其结合凝胶电泳与固相免疫技术，将借助电泳所区分的蛋泳与固相免疫技术，将借助电泳所区分的蛋白质转移至固相载体，再应用酶免疫、放射白质转移至固相载体，再应用酶免疫、放射免疫等技术进行检测。免疫等技术进行检测。该法能对分子大小不同的蛋白质进行分该法能对分子大小不同的蛋白质进行分离并确定其分子量，常用于检测多种病毒抗离并确定其分子量，常用于检测
17、多种病毒抗体或抗原。体或抗原。免疫印迹法免疫印迹法(immunoblotting)(immunoblotting)免疫印迹法免疫印迹法 一、一、淋巴细胞及亚群的分离淋巴细胞及亚群的分离外周血单个核细胞外周血单个核细胞(PBMC)的分离：的分离：葡聚糖泛影葡胺（即淋葡聚糖泛影葡胺（即淋巴细胞分离液）密度梯度离心法巴细胞分离液）密度梯度离心法 淋巴细胞为不均一的群体，可借助其表面标志及淋巴细胞为不均一的群体，可借助其表面标志及功能差异而分为不同的群和亚群。功能差异而分为不同的群和亚群。1 1尼龙棉分离法尼龙棉分离法 2 2E E花环分离法花环分离法 3 3洗淘法洗淘法 4 4流式细胞术流式细胞术(
18、flow cytometry(flow cytometry，FCM)FCM)5 5磁珠分离技术磁珠分离技术E花环实验花环实验Removal of T cells from marrow graft MagnetMagnetic antibodies二、免疫细胞功能的测定二、免疫细胞功能的测定 1.T1.T细胞功能测定：细胞功能测定：(1)(1)细胞增殖细胞增殖(转化转化)试验：试验：可分为非特异性丝裂原和特异性抗原两类。可分为非特异性丝裂原和特异性抗原两类。*丝裂原主要有丝裂原主要有PHA、Con A和和PWM；*抗原刺激物有破伤风类毒素、抗原刺激物有破伤风类毒素、PPD和白色念和白色念珠菌等
19、；珠菌等；淋淋巴巴细细胞胞增增殖殖实实验验CTL(1)B(1)B细胞增殖细胞增殖(转化转化)试验试验 (2)(2)溶血空斑形成试验溶血空斑形成试验(3)(3)酶联免疫斑点法酶联免疫斑点法(ELISPOT):ELISPOT):2.B2.B细胞功能判定细胞功能判定溶溶血血空空斑斑实实验验 在体外用已知抗原检测相应抗体：见前述在体外用已知抗原检测相应抗体：见前述 用已知抗体对各类免疫球蛋白作定性、定量用已知抗体对各类免疫球蛋白作定性、定量测定：测定：检测血清含量高的检测血清含量高的IgGIgG、IgAIgA和和IgMIgM时，可用免疫比浊时，可用免疫比浊法；法；检测检测IgDIgD和和IgEIgE选
20、用选用ELISAELISA、RIARIA等灵敏度高的方法。等灵敏度高的方法。诊断免疫球蛋白异常性疾病（如骨髓瘤、性联无丙诊断免疫球蛋白异常性疾病（如骨髓瘤、性联无丙种球蛋白血症等），可用免疫电泳等方法。种球蛋白血症等），可用免疫电泳等方法。一、免疫球蛋白的测定一、免疫球蛋白的测定 了解体内补体激活状况，辅助有关疾病的诊了解体内补体激活状况，辅助有关疾病的诊断。对血清含量高的断。对血清含量高的C3C3、C4C4、B B因子等，可用免因子等，可用免疫比浊法，其他含量低的成分则借助疫比浊法，其他含量低的成分则借助ELISAELISA、RIARIA等方法。血清总补体活性测定常采用等方法。血清总补体活性
21、测定常采用50%50%补体溶补体溶血法（血法（CH50CH50），），其原理是：用其原理是：用SRBCSRBC和兔抗和兔抗SRBCSRBC作作为抗原抗体复合物，通过经典途径激活待检血清为抗原抗体复合物，通过经典途径激活待检血清中的补体，导致中的补体，导致SRBCSRBC溶解。若待检血清补体含量溶解。若待检血清补体含量减少或成分缺失，则影响溶血结果。减少或成分缺失，则影响溶血结果。二、补体测定二、补体测定（一）免疫学测定法（一）免疫学测定法以细胞因子作为抗原，用相应抗体进行定量或半以细胞因子作为抗原，用相应抗体进行定量或半定量检测。对于分泌性细胞因子，常用方法为双定量检测。对于分泌性细胞因子，常
22、用方法为双抗体夹心法抗体夹心法ELISAELISA、RIARIA、ELISPOTELISPOT、免疫印迹法等、免疫印迹法等方法检测。对于胞内细胞因子，采用方法检测。对于胞内细胞因子，采用FCMFCM免疫荧光免疫荧光技术检测技术检测三、细胞因子（三、细胞因子（CKsCKs）检测）检测一、免疫学预防一、免疫学预防免疫包括：免疫包括：先天免疫先天免疫：生物体在长期种系发育和进化：生物体在长期种系发育和进化中逐渐形成的一系列防卫机制。中逐渐形成的一系列防卫机制。特异性免疫特异性免疫：个体在生命过程中接受抗原：个体在生命过程中接受抗原刺激后主动产生或被动获得的。刺激后主动产生或被动获得的。特异性免疫获得
23、方式有两种：特异性免疫获得方式有两种：1、自然免疫（、自然免疫（natural immunization)自然主动免疫自然主动免疫：指机体受到各种病原体隐性：指机体受到各种病原体隐性或显性感染后主动产生的特异性免疫。或显性感染后主动产生的特异性免疫。自然被动免疫自然被动免疫：指机体经胎盘或初乳被动获：指机体经胎盘或初乳被动获得的特异性免疫。得的特异性免疫。p人工主动免疫人工主动免疫(artificial active immunization)(artificial active immunization)：指给机体接种抗原性物质如疫苗、类毒素等，刺激机指给机体接种抗原性物质如疫苗、类毒素等，
24、刺激机体免疫系统产生特异性免疫力的方法。体免疫系统产生特异性免疫力的方法。p人工被动免疫人工被动免疫(artificial passive(artificial passive immunization)immunization)：指给人体注射含特异性抗体的免疫血清或细胞指给人体注射含特异性抗体的免疫血清或细胞因子等制剂因子等制剂,使受者迅速获得特异性免疫力的方法。使受者迅速获得特异性免疫力的方法。人工主动免疫的接种物人工主动免疫的接种物疫苗疫苗（VaccineVaccine）：细菌，病毒，螺旋体，）：细菌，病毒，螺旋体，立克次体和类毒素等立克次体和类毒素等抗原性生物制品抗原性生物制品统称统称
25、为疫苗。为疫苗。理想疫苗的标准：理想疫苗的标准：安全；有效；实用安全；有效；实用2 2、减毒活疫苗、减毒活疫苗（live-attenuated Vaccinelive-attenuated Vaccine）用人工定向变异或从自然界筛选得到的毒力高度减弱或基本无毒的病原微生物制成的预防制剂。优点优点：一次免疫即可获得长久免疫力，类似自然状态下的轻型或隐性感染。诱导体液免疫和细胞免疫。缺点缺点：不易保存，存在回复突变的危险如卡介苗，牛痘，麻疹等3 3、类毒素（、类毒素（ToxidToxid）细菌外毒素经细菌外毒素经0.3-0.4%0.3-0.4%甲醛处理，使其毒性减弱而保留其甲醛处理，使其毒性减弱
26、而保留其免疫原性。免疫原性。白百破：白喉类毒素白百破：白喉类毒素+百日咳杆菌死疫苗百日咳杆菌死疫苗+破伤风类毒素破伤风类毒素4 4、新型疫苗、新型疫苗 亚单位疫苗（亚单位疫苗（Subunit VaccineSubunit Vaccine）结合疫苗结合疫苗 合成肽疫苗合成肽疫苗 基因工程疫苗基因工程疫苗人工被动免疫的接种物人工被动免疫的接种物1 1、抗毒素、抗毒素（antitoxinantitoxin）是用细菌外毒素或类毒素免疫动物制备的免疫血清，具有是用细菌外毒素或类毒素免疫动物制备的免疫血清，具有中和外毒素毒性的作用。使用时注意超敏反应。中和外毒素毒性的作用。使用时注意超敏反应。2 2、人免疫球蛋白：胎盘球蛋白和血浆丙种球蛋白、人免疫球蛋白：胎盘球蛋白和血浆丙种球蛋白分别由健康产妇胎盘血和正常人血浆中提取的丙种球蛋白分别由健康产妇胎盘血和正常人血浆中提取的丙种球蛋白制成的生物制品：制成的生物制品：IgGIgG和和IgMIgM3 3、激活的淋巴细胞：、激活的淋巴细胞：TILTIL和和LAKLAK等等预防接种的禁忌症：预防接种的禁忌症：1 1、免疫功能缺陷、免疫功能缺陷2 2、高热，严重心脏病，肝肾病，甲亢等、高热，严重心脏病，肝肾病，甲亢等3 3、妊娠期及月经期、妊娠期及月经期4 4、湿疹及其他严重皮肤病。、湿疹及其他严重皮肤病。
