1、第一节、毛细管色谱第一节、毛细管色谱1.1.毛细管色谱柱的结构特点毛细管色谱柱的结构特点（1）不装填料阻力小，长度可达百米的毛细管柱，）不装填料阻力小，长度可达百米的毛细管柱，管管径径0.2mm。（2）气流单途径通过柱子，消除了组分在柱中的涡流）气流单途径通过柱子，消除了组分在柱中的涡流扩散。扩散。（3）固定液直接涂在管壁上，总柱内壁面积较大）固定液直接涂在管壁上，总柱内壁面积较大,涂层涂层很薄，则气相和液相传质阻力大大降低。很薄，则气相和液相传质阻力大大降低。（4）毛细管色谱柱柱效高达每米）毛细管色谱柱柱效高达每米30004000块理论塔块理论塔板，一支长度板，一支长度100米的毛细管柱，总
2、的理论塔板数可达米的毛细管柱，总的理论塔板数可达104106。2.2.毛细管色谱分离能力提高的途径毛细管色谱分离能力提高的途径 (1)由塔板理论：增加柱长减小柱径，由塔板理论：增加柱长减小柱径，即增加柱子即增加柱子 塔板数；塔板数；(2)由速率理论：减小组分在柱中的涡流扩散由速率理论：减小组分在柱中的涡流扩散 和传质阻力，也即降低塔板高度和传质阻力，也即降低塔板高度3.3.毛细管色谱具有的优点毛细管色谱具有的优点 （1）分离效率高：比填充柱高）分离效率高：比填充柱高10100倍；倍；（2）分析速度快：用毛细管色谱分析比用填充柱）分析速度快：用毛细管色谱分析比用填充柱色谱速度色谱速度 （3）色谱
3、峰窄、峰形对称。）色谱峰窄、峰形对称。（4）灵敏度高，一般采用氢焰检测器。）灵敏度高，一般采用氢焰检测器。（5）涡流扩散为零。）涡流扩散为零。4.毛细管色谱的 种类与制备方法毛细管柱按其制备方法可分为以下几种：毛细管柱按其制备方法可分为以下几种：涂壁开管柱涂壁开管柱（wall coated opentubular，WCOT柱）：柱）：将固定液直接涂敷在管内壁上。柱制作相对简单，但柱制将固定液直接涂敷在管内壁上。柱制作相对简单，但柱制备的重现性差、寿命短。备的重现性差、寿命短。多孔层开管柱多孔层开管柱（porous layer open tubular，PLOT柱）：在管壁上涂敷一层多孔性吸附剂
4、固体微粒。构成毛柱）：在管壁上涂敷一层多孔性吸附剂固体微粒。构成毛细管气固色谱。细管气固色谱。载体涂渍开管柱载体涂渍开管柱（support coated open tubular，SCOT柱）：将非常细的担体微粒粘接在管壁上，再涂固柱）：将非常细的担体微粒粘接在管壁上，再涂固定液。柱效较定液。柱效较WCOT柱高。柱高。化学键合或交联柱：化学键合或交联柱：将固定液通过化学反应键合在管壁将固定液通过化学反应键合在管壁上或交联在一起。使柱效和柱寿命进一步提高。上或交联在一起。使柱效和柱寿命进一步提高。5.5.毛细管色谱实验技术毛细管色谱实验技术毛细管柱内径很细，因而带来三个问题：毛细管柱内径很细，因
5、而带来三个问题：（1）允许通过的载气流量很小。）允许通过的载气流量很小。（2）柱容量很小，允许的进样量小。需采用）柱容量很小，允许的进样量小。需采用分流技术分流技术，（3）分流后，柱后流出的试样组分量少、流速慢。解）分流后，柱后流出的试样组分量少、流速慢。解决方法：灵敏度高的氢焰检测器，采用决方法：灵敏度高的氢焰检测器，采用尾吹技术尾吹技术。分流比：放空的试样量分流比：放空的试样量与进入毛细管柱的试样与进入毛细管柱的试样量之比。一般在量之比。一般在50：1到到500：1之间调节。之间调节。1.基本原理及方法基本原理：基本原理：在一定条件下，高分子及非挥发性有机化合物遵循一定在一定条件下，高分子
6、及非挥发性有机化合物遵循一定的的裂解规律裂解规律，即，即特定特定的样品能够产生的样品能够产生特征特征的裂解产物及产物的裂解产物及产物分布，采用气相色谱分析、鉴定裂解产物，据此可对原样品分布，采用气相色谱分析、鉴定裂解产物，据此可对原样品进行表征。进行表征。方法：方法：样品置于裂解器中，在样品置于裂解器中，在严格控制严格控制的条件下，的条件下，快速快速加热，加热，使之迅速分解成为可挥发的小分子产物，然后直接将裂解产使之迅速分解成为可挥发的小分子产物，然后直接将裂解产物送入色谱柱中进行分离，获得定性定量数据。物送入色谱柱中进行分离，获得定性定量数据。第二节、裂解气相色谱的原理与应用第二节、裂解气相
7、色谱的原理与应用特点特点:(1)(1)分离效率高分离效率高(色谱法自身的特点色谱法自身的特点)(2)(2)灵敏度高灵敏度高(色谱法自身的特点色谱法自身的特点)(3)(3)分析速度快分析速度快 快速裂解、快速分析；不丢失信息；快速裂解、快速分析；不丢失信息；(4)(4)信息量大信息量大 裂解条件与裂解产物关系；样品组成与裂解产物；裂解条件与裂解产物关系；样品组成与裂解产物；裂解机理和反应动力学研究裂解机理和反应动力学研究 (5)(5)适合于各种形态样品适合于各种形态样品 粘稠液体、粉末、纤维及弹性体、固化树脂、涂料粘稠液体、粉末、纤维及弹性体、固化树脂、涂料 硫化橡胶、塑料等；硫化橡胶、塑料等；
8、(6)(6)简单、易行简单、易行2.2.流程流程载气载气裂解器裂解器六通阀六通阀气化室气化室色谱柱色谱柱GC检测器检测器数据处理数据处理质谱仪质谱仪数据处理数据处理压力表3.对裂解器的要求 (1)(1)裂解反应控制裂解反应控制 裂解温度的精确控制裂解温度的精确控制(裂解温度不同，裂解产物不裂解温度不同，裂解产物不同同)；可重复进行；可重复进行；(2)(2)裂解温度范围可调裂解温度范围可调 不同物质需要不同的裂解温度；不同物质需要不同的裂解温度；400-1500 400-1500 C C (3)(3)裂解器与接口的体积小裂解器与接口的体积小 减小死体积；防止色谱峰变宽；减小死体积；防止色谱峰变宽
9、；(4)(4)对裂解反应无催化反应对裂解反应无催化反应 防止歧化反应和二次反应；防止歧化反应和二次反应；4.裂解器 (1)(1)管式炉裂解器管式炉裂解器 外壁加热的圆管，简单，易于控制。死体积大，二外壁加热的圆管，简单，易于控制。死体积大，二次反应突出；次反应突出；(2)(2)热丝裂解器热丝裂解器 样品放置在加热丝的螺旋管中；样品放置在加热丝的螺旋管中；(3)(3)居里点裂解器居里点裂解器 利用电磁感应加热；铁磁性材料置于高频电场中，利用电磁感应加热；铁磁性材料置于高频电场中，吸收射频能量迅速升温，达到居里点温度时，变为顺磁吸收射频能量迅速升温，达到居里点温度时，变为顺磁质，不再吸收能量，温度
10、稳定在该点；样品放置在铁磁质，不再吸收能量，温度稳定在该点；样品放置在铁磁性材料制成的加热元件上。不同组成的铁磁质合金具有性材料制成的加热元件上。不同组成的铁磁质合金具有不同居里点温度；不同居里点温度；(3)(3)激光裂解器激光裂解器第三节、顶空气相色谱的技术与应用对液体或固体试样中的挥发性成分进行气相色谱分对液体或固体试样中的挥发性成分进行气相色谱分析的技术；析的技术；试样置于密闭的恒温系统中，气试样置于密闭的恒温系统中，气-液（气液（气-固）两相固）两相达到热力学平衡时，测定气相组成。达到热力学平衡时，测定气相组成。两种方式：两种方式：静态法：恒温密闭系统，平衡时，测定气相组成；静态法：恒
11、温密闭系统，平衡时，测定气相组成；动态法：吹扫动态法：吹扫-捕集法，采用吸附剂吸附，加热解捕集法，采用吸附剂吸附，加热解吸。吸。理论依据理论依据 当顶空瓶中样品上面的蒸气压相当低时，峰面积当顶空瓶中样品上面的蒸气压相当低时，峰面积Ai的的大小与样品上面的气相中挥发性组分大小与样品上面的气相中挥发性组分 i 的蒸气压的蒸气压pi成正比成正比 Ai=fi pifi为校正因子，在真实体系中，蒸气分压通常用下式表为校正因子，在真实体系中，蒸气分压通常用下式表示：示：pi=poiixi poi为气相中组分为气相中组分i 的摩尔分数；的摩尔分数；xi为样品中组分为样品中组分i 的摩尔的摩尔分数；分数；i为
12、组分为组分i 的活度系数。的活度系数。Ai=fi pi=fiixi poi当系统平衡时：当系统平衡时：Ai=fi pi=ki xi 通过顶空分析，可确定试样中的含量。通过顶空分析，可确定试样中的含量。一、概述一、概述质谱：纯物质结构分析质谱：纯物质结构分析色谱：化合物分离色谱：化合物分离色谱色谱-质谱联用：共同优点质谱联用：共同优点GC-MS；LC-MS；CZE-MS（毛细管电泳（毛细管电泳-质谱）质谱）困难点困难点：载气载气(或流动液或流动液)的分离；的分离；出峰时间监测；出峰时间监测；仪器小型化；仪器小型化；关键点：接口技术关键点：接口技术(分子分离器分子分离器)m/z1529435785
13、9911314271第四节第四节 色谱质谱联用仪色谱质谱联用仪GC-MS中的分子分离器中的分子分离器 分子分离器类型：分子分离器类型：微孔玻璃式、半透膜式和喷射式三种。微孔玻璃式、半透膜式和喷射式三种。喷射式分子分离器：喷射式分子分离器：由一对同轴收缩型喷嘴构成，喷嘴被封在一真空室由一对同轴收缩型喷嘴构成，喷嘴被封在一真空室中，如图所示。可做成多级。中，如图所示。可做成多级。四极杆质量分析器四极杆质量分析器￥+Electron BeamABCSample inIon Beam三、三、LC-MS联用仪器联用仪器1 1.大气压电离技术（大气压电离技术（APIAPI）（1）电喷雾电离（）电喷雾电离（
14、API Electrospray）不适用于非极性化合物不适用于非极性化合物RayleighLimitReached+-+-+-+-Evaporation+Charged Droplets试样离子准分子离子Analyte Ions Solvent Ion ClustersSalts/Ion pairsNeutrals+-其他离子（2）大气压化学电离）大气压化学电离热喷雾热喷雾(100-120 C)，化学电离化学电离;适用于热稳定化合物分析适用于热稳定化合物分析电喷雾电离电喷雾电离流出液在高电场下形成带电喷雾，在电场力流出液在高电场下形成带电喷雾，在电场力作用下穿过气帘；作用下穿过气帘；气帘的作用
15、：雾化；蒸发溶剂；阻止中性溶气帘的作用：雾化；蒸发溶剂；阻止中性溶剂分子剂分子2 2.离子阱质量分析器离子阱质量分析器 特定特定m/z离子在阱内离子在阱内一定轨道上稳定旋转，一定轨道上稳定旋转，改变端电极电压，不同改变端电极电压，不同m/z离子飞出阱到达检测离子飞出阱到达检测器；器；&在电解质溶液中，位于电场中的带电离子在电场力的作用下，以不同的速度向其所带电荷相反的电极方向迁移的现象，称之为电泳。由于不同离子所带电荷及性质的不同，迁移速率不同可实现分离。1.经典电泳分离法的不足 所用分离柱的柱径大，柱较短，分离效率不高（远低于HPLC），温度影响大。高效毛细管电泳在技术上采取了两项重要改进。
16、第五节 高效毛细管电泳色谱 一、高效毛细管电泳一、高效毛细管电泳(HPCE)(HPCE)基本原理基本原理2.2.高效毛细管电泳技术上的重要突破高效毛细管电泳技术上的重要突破高效毛细管电泳在技术上采取了两项重要改进：高效毛细管电泳在技术上采取了两项重要改进：一是采用了0.05mm内径的毛细管,；二是采用了高达数千伏的电压。毛细管的采用使产生的热量能够较快散发，大大减小了温度效应，使电场电压可以很高。电压升高，电场推动力大，又可进一步使柱径变小，柱长增加，高效毛细管电泳的柱效远高于高效液相色谱，理论塔板数高达几十万块/米，特殊柱子可以达到数百万。3.3.高效毛细管电泳高效毛细管电泳(HPCE)(H
17、PCE)基本原理基本原理 电泳是指带电离子在电场中的定向移动，不同离子电泳是指带电离子在电场中的定向移动，不同离子具有不同的迁移速度，具有不同的迁移速度，迁移速度与哪些因素有关？迁移速度与哪些因素有关？当带电离子以速度当带电离子以速度 在电场中移动时，受到大小在电场中移动时，受到大小相等、方向相反的电场推动力和平动摩擦阻力的作用。相等、方向相反的电场推动力和平动摩擦阻力的作用。电场力：电场力：FE=qE 阻阻 力：力：F=f故：故：qE=fq离子所带的有效电荷；离子所带的有效电荷；E 电场强度；电场强度；离子在电场中的迁移速度；离子在电场中的迁移速度；f 平动摩擦系数平动摩擦系数(对于球形离子
18、：对于球形离子：f=6；离子的表离子的表观液态动力学半径；观液态动力学半径；介质的粘度；介质的粘度；)所以，迁移速度：所以，迁移速度：EqfqE 6 （球形离子球形离子）物质离子在电场中物质离子在电场中差速迁移差速迁移是电泳分离的基础。是电泳分离的基础。淌度淌度：单位电场强度下的平均电泳速度。：单位电场强度下的平均电泳速度。6qE 二、电渗现象与电渗流二、电渗现象与电渗流1.1.电渗流现象电渗流现象 当固体与液体接触时，固体表面由于某种原因带一当固体与液体接触时，固体表面由于某种原因带一种电荷，则因静电引力使其周围液体带有相反电荷，在种电荷，则因静电引力使其周围液体带有相反电荷，在液液-固界面
19、形成双电层，二者之间存在电位差。固界面形成双电层，二者之间存在电位差。当液体两端施加电压时，当液体两端施加电压时，就会发生液体相对于固体表就会发生液体相对于固体表面的移动，这种液体相对于面的移动，这种液体相对于固体表面的移动的现象叫固体表面的移动的现象叫电电渗现象渗现象。电渗现象中整体移动着电渗现象中整体移动着的液体叫的液体叫电渗流（简称电渗流（简称EOF）。2.2.HPCE中的电渗现象与电渗流中的电渗现象与电渗流 石英毛细管柱，内充液石英毛细管柱，内充液pH3pH3时，表面电离成时，表面电离成-SiOSiO-,管内壁带负电荷，形成双电层。管内壁带负电荷，形成双电层。在高电场的作用下在高电场的
20、作用下,带正电荷的溶液表面及扩散带正电荷的溶液表面及扩散层向阴极移动，由于这些阳离子实际上是溶剂化的，层向阴极移动，由于这些阳离子实际上是溶剂化的，故将引起柱中的溶液整体向负极移动，速度故将引起柱中的溶液整体向负极移动，速度电渗流电渗流。3.3.HPCE中电渗流的大小与方向中电渗流的大小与方向 电渗流的大小用电渗流速度电渗流的大小用电渗流速度电渗流电渗流表示，取决于电表示，取决于电渗淌度渗淌度和电场强度和电场强度E E。即。即 电渗流电渗流=E E电渗淌度取决于电泳介质及双电层的电渗淌度取决于电泳介质及双电层的ZetaZeta电势，即电势，即 =0 0/0-真空介电常数;-介电常数;-毛细管壁
21、的Zeta电势。电渗流电渗流=0 0E E/实际电泳分析，可在实验测定相应参数后，按下式计算实际电泳分析，可在实验测定相应参数后，按下式计算 电渗流电渗流=L Lefef/t/teoeoLef-毛细管有效长度;teo-电渗流标记物（中性物质）的迁移时间。HPCE中电渗流的方向中电渗流的方向 电渗流的方向取决于毛细管内表面电荷的性质：电渗流的方向取决于毛细管内表面电荷的性质：内表面带负电荷内表面带负电荷,溶液带正电荷溶液带正电荷,电渗流流向阴极；电渗流流向阴极；内表面带正电荷内表面带正电荷,溶液带负电荷溶液带负电荷,电渗流流向阳极；电渗流流向阳极；石英毛细管；带负电荷，电渗流流向阴极；石英毛细管
22、；带负电荷，电渗流流向阴极；改变电渗流方向的方法：改变电渗流方向的方法：（1 1）毛细管改性）毛细管改性 表面键合阳离子基团；表面键合阳离子基团；（2 2）加电渗流反转剂）加电渗流反转剂 内充液中加入大量的阳离子表面活性剂内充液中加入大量的阳离子表面活性剂,将使石英将使石英毛细管壁带正电荷毛细管壁带正电荷,溶液表面带负电荷溶液表面带负电荷.电渗流流向阳极电渗流流向阳极.4.4.HPCE中电渗流的流形中电渗流的流形 电荷均匀分布，整体移动，电渗流的流动为平流，塞式流动（谱带展宽很小）；液相色谱中的溶液流动为层流，抛物线流型，管壁处流速为零，管中心处的速度为平均速度的2倍（引起谱带展宽较大）。5.
23、5.HPCE中电渗流的作用中电渗流的作用 电渗流的速度约等于一般离子电泳速度的电渗流的速度约等于一般离子电泳速度的5 57 7倍；倍；各种电性离子在毛细管柱中的迁移速度为：各种电性离子在毛细管柱中的迁移速度为：+=电渗流电渗流 +ef +ef 阳离子运动方向与电渗流阳离子运动方向与电渗流一致一致；-=电渗流电渗流 -ef -ef 阴离子运动方向与电渗流阴离子运动方向与电渗流相反相反；0 0=电渗流电渗流 中性粒子运动方向与电渗流中性粒子运动方向与电渗流一致一致；（1 1）可一次完成阳离子、阴离子、中性粒子的分离；）可一次完成阳离子、阴离子、中性粒子的分离；（2 2）改变电渗流的大小和方向可改变
24、分离效率和选择性，）改变电渗流的大小和方向可改变分离效率和选择性，这是这是HPCEHPCE中优化分离的重要因素；中优化分离的重要因素；（3 3）电渗流的微小变化影响结果的重现性；）电渗流的微小变化影响结果的重现性；在在HPCEHPCE中，控制电渗流非常重要。中，控制电渗流非常重要。三、三、HPCE中影响电渗流的因素中影响电渗流的因素1.1.电场强度的影响电场强度的影响 电渗流速度和电场强度成正比，当毛细管长度一定电渗流速度和电场强度成正比，当毛细管长度一定时，电渗流速度正比于工作电压。时，电渗流速度正比于工作电压。2.2.毛细管材料的影响毛细管材料的影响 不同材料毛细管的表面不同材料毛细管的表
25、面电荷特性不同，产生的电渗电荷特性不同，产生的电渗流大小不同；流大小不同；电渗流电渗流=0 0E E/3.3.电解质溶液性质的影响电解质溶液性质的影响（1 1）溶液）溶液pHpH的影响的影响 对于石英毛细管，溶液对于石英毛细管，溶液pHpH增高时，表面电离多，电增高时，表面电离多，电荷密度增加，荷密度增加，管壁管壁zetazeta电势增大电势增大，电渗流增大，电渗流增大，pH=7pH=7，达到最大达到最大；pH3pH3，完全被氢离子中和，表面电中性，完全被氢离子中和，表面电中性，电渗流为零。分析时，采用缓冲溶液来保持电渗流为零。分析时，采用缓冲溶液来保持pHpH稳定。稳定。（2 2）阴离子的影
26、响）阴离子的影响 在其他条件相同，浓度相同而阴离子不同时，毛细在其他条件相同，浓度相同而阴离子不同时，毛细管中的电流有较大差别，产生的焦耳热不同。管中的电流有较大差别，产生的焦耳热不同。缓冲溶液离子强度，影响双电层的厚度、溶缓冲溶液离子强度，影响双电层的厚度、溶液黏度和工作电流，明显影响电渗流大小。缓冲液黏度和工作电流，明显影响电渗流大小。缓冲溶液离子强度增加，电渗流下降。溶液离子强度增加，电渗流下降。4.4.温度的影响温度的影响 毛细管内温度的升高，使溶液的黏度下降，电毛细管内温度的升高，使溶液的黏度下降，电渗流增大。温度变化来自于渗流增大。温度变化来自于“焦耳热焦耳热”；焦耳热：焦耳热：毛
27、细管溶液中有电流通过时，产生的毛细管溶液中有电流通过时，产生的热量；热量；HPCEHPCE中的焦耳热与背景电解质的摩尔电导、浓中的焦耳热与背景电解质的摩尔电导、浓度及电场强度成正比。度及电场强度成正比。温度每变化温度每变化1 1度，将引起背景电解质溶液黏度度，将引起背景电解质溶液黏度变化变化2%2%3%3%；5.5.添加剂的影响添加剂的影响（1 1）加入浓度较大的中性盐，如）加入浓度较大的中性盐，如K K2 2SOSO4 4，溶液离子强度，溶液离子强度增大，使溶液的黏度增大，电渗流减小。增大，使溶液的黏度增大，电渗流减小。（2 2）加入表面活性剂，可改变）加入表面活性剂，可改变电渗流的大小和方
28、向；电渗流的大小和方向；加入不同阳离子表面活性加入不同阳离子表面活性剂来控制电渗流。剂来控制电渗流。加入阴离子表面活性剂，加入阴离子表面活性剂，如十二烷基硫酸钠（如十二烷基硫酸钠（SDSSDS），可），可以使壁表面负电荷增加，以使壁表面负电荷增加，zetazeta电势增大，电渗流增大；电势增大，电渗流增大；（3 3）加入有机溶剂如甲醇、乙）加入有机溶剂如甲醇、乙腈，使电渗流增大。腈，使电渗流增大。四、淌度四、淌度 mobility mobility 淌度淌度：带电离子在单位电场下的迁移速度；：带电离子在单位电场下的迁移速度；淌度不同是电泳分离的基础。淌度不同是电泳分离的基础。1.1.绝对淌度绝
29、对淌度(absolute mobility)ab 无限稀释溶液中带电离子在单位电场强度下的平均无限稀释溶液中带电离子在单位电场强度下的平均迁移速度，简称淌度。可在手册中查阅。迁移速度，简称淌度。可在手册中查阅。2.2.有效淌度有效淌度(effective mobility)ef 实际溶液中的淌度实际溶液中的淌度(实验中测定的实验中测定的)。efef=a ai ii i a ai i-溶质溶质i i 的解离度的解离度;i i-溶质溶质i i 在解离状态下的绝对淌度在解离状态下的绝对淌度3.3.表观淌度表观淌度 ap 离子在实际分离过程中的迁移速度（表观迁移速度）：离子在实际分离过程中的迁移速度（
30、表观迁移速度）：apap=ap ap E E五、五、HPCE中的参数与关系式中的参数与关系式 1.1.迁移时间（保留时间）迁移时间（保留时间）HPCEHPCE兼具有电化学的特性和色谱分析的特性。有关色谱兼具有电化学的特性和色谱分析的特性。有关色谱理论也适用。理论也适用。VLLELLtapefapefapef V V外加电压；外加电压；L L毛细管总长度；毛细管总长度；2.2.分离效率（塔板数）分离效率（塔板数）在在HPCEHPCE中，仅存在纵向扩散，中，仅存在纵向扩散，2 2=2=2DtDt 扩散系数小的溶质比扩散系数大的分离效率高，分离生扩散系数小的溶质比扩散系数大的分离效率高，分离生物大分
31、子的依据。物大分子的依据。N;22 DELDLVLefapefap Lef=()2N=5.54(tR/Y1/2)23.3.分离度分离度 DLVLRefap 平均平均 177.0 影响分离度的主要因素；工作电压影响分离度的主要因素；工作电压V V；毛细管有效；毛细管有效长度与总长度比；有效淌度差。分离度可按谱图直接由长度与总长度比；有效淌度差。分离度可按谱图直接由下式计算下式计算：221apap 平均平均1212)(2WWttR六、影响分离效率的因素六、影响分离效率的因素区带展宽区带展宽1.1.纵向扩散的影响纵向扩散的影响 在在HPCEHPCE中，纵向扩散引起的峰展宽：中，纵向扩散引起的峰展宽：
32、2 2=2=2DtDt 由扩散系数和迁移时间决定。大分子的扩散系数小，由扩散系数和迁移时间决定。大分子的扩散系数小，可获得更高的分离效率，大分子生物试样分离的依据。可获得更高的分离效率，大分子生物试样分离的依据。2.2.进样的影响进样的影响 当进样塞长度太大时，引起的峰展宽大于纵向扩散。当进样塞长度太大时，引起的峰展宽大于纵向扩散。分离效率明显下降；理想情况下，进样塞长度分离效率明显下降；理想情况下，进样塞长度：Winj=(24D t)1/2 实际操作时进样塞长度小于或等于毛细管总长度的实际操作时进样塞长度小于或等于毛细管总长度的1%1%2%2%。3.3.焦耳热与温度梯度的影响焦耳热与温度梯度
33、的影响 电泳过程产生的焦耳热可由下式计算：电泳过程产生的焦耳热可由下式计算：22EcLrIVQbm m m电解质溶液的摩尔电导；电解质溶液的摩尔电导；I I工作电流：工作电流：c cb b电解质浓度；电解质浓度；散热过程中，在毛细管内形成温度梯度（中心温散热过程中，在毛细管内形成温度梯度（中心温度高），破坏了塞流，导致区带展宽。度高），破坏了塞流，导致区带展宽。改善方法：改善方法：（1 1）减小毛细管内径；）减小毛细管内径；（2 2）控制散热；）控制散热；4.4.溶质与管壁间的相互作用溶质与管壁间的相互作用 存在吸附与疏水作用，造成谱带展宽；存在吸附与疏水作用，造成谱带展宽；蛋白质、多肽带电荷
34、数多，有较多的疏水基，吸附蛋白质、多肽带电荷数多，有较多的疏水基，吸附问题特别严重，是目前分离分析该类物质的一问题特别严重，是目前分离分析该类物质的一大难题大难题。细内径毛细管柱，一方面有利于散热，另一方面比细内径毛细管柱，一方面有利于散热，另一方面比表面积大，又增加了溶质吸附的机会。表面积大，又增加了溶质吸附的机会。减小吸附的方法和途径：减小吸附的方法和途径：加入两性离子代替强电解加入两性离子代替强电解质，两性离子一端带正电，另一端带负电，带正电一端质，两性离子一端带正电，另一端带负电，带正电一端与管壁负电中心作用，浓度约为溶质的与管壁负电中心作用，浓度约为溶质的100-1000100-10
35、00倍时，倍时，抑制对蛋白质吸附，又不增加溶液电导，对电渗流影响抑制对蛋白质吸附，又不增加溶液电导，对电渗流影响不大。不大。5.5.其他影响因素其他影响因素 （1 1）电分散作用对谱带展宽的影响）电分散作用对谱带展宽的影响 当溶质区带与缓冲溶液区带的电导不同时，也造成谱当溶质区带与缓冲溶液区带的电导不同时，也造成谱带展宽；尽量选择与试样淌度相匹配的背景电解质溶液。带展宽；尽量选择与试样淌度相匹配的背景电解质溶液。（2 2）“层流层流”现象对谱带展宽的影响现象对谱带展宽的影响 一般情况下，一般情况下，HPCEHPCE中不存在层流，但当毛细管两端存中不存在层流，但当毛细管两端存在压力差时，出现抛物
36、线形的层流；在压力差时，出现抛物线形的层流；产生的原因：毛细管两端液面高度不同。产生的原因：毛细管两端液面高度不同。实际操作时，保持毛细管两端缓冲溶液平面实际操作时，保持毛细管两端缓冲溶液平面高度高度相同。相同。1 1、仪器流程与主要部件、仪器流程与主要部件 电压：电压：0 030kV30kV；分离柱不涂敷任何固定液；分离柱不涂敷任何固定液；紫外或激光诱导荧光检测器；紫外或激光诱导荧光检测器；（可检测到：（可检测到：1010-19-191010-21-21 mol/L mol/L）七、高效毛细管电泳仪1）高压电源（1 1）0 03030 kV kV 稳定、连续可调的直流电源；稳定、连续可调的直
37、流电源；（2 2）具有恒压、恒流、恒功率输出；）具有恒压、恒流、恒功率输出；（3 3）电场强度程序控制系统；）电场强度程序控制系统；（4 4）电压稳定性：）电压稳定性：0.1%0.1%；（5 5）电源极性易转换；）电源极性易转换；2 2）毛细管柱毛细管柱（1 1）材料：石英：各）材料：石英：各项性能好；玻璃：光学、项性能好；玻璃：光学、机械性能差；机械性能差；（2 2）规格：内径）规格：内径20207575m m，外径，外径350350400400m m；长度；长度=1m电泳电泳时时,阴离阴离子在负极最后流出子在负极最后流出,在这种情况在这种情况下下,不但可以按类分离不但可以按类分离,同种类同
38、种类离子由于离子由于差速迁移差速迁移被相互分离。被相互分离。最基本、应用广的分离模式；最基本、应用广的分离模式；2 2、毛细管凝胶电泳、毛细管凝胶电泳(CGE)(CGE)将聚丙烯酰胺等在毛细管柱内交联生成凝胶。将聚丙烯酰胺等在毛细管柱内交联生成凝胶。其具有多孔性，类似分子筛的作用，试样分子按大其具有多孔性，类似分子筛的作用，试样分子按大小分离。能够有效减小组分扩散，所得峰型尖锐，分离小分离。能够有效减小组分扩散，所得峰型尖锐，分离效率高。效率高。蛋白质、蛋白质、DNADNA等的电荷等的电荷/质量比与分子大小无关，质量比与分子大小无关，CZECZE模式很难分离，采用模式很难分离，采用CGECGE
39、能获得良好分离，能获得良好分离，DANDAN排序排序的重要手段。的重要手段。特点：特点：抗对流性好，散热性好，分离度极高。抗对流性好，散热性好，分离度极高。无胶筛分技术：无胶筛分技术：采用低粘度的线性聚合物溶液代替采用低粘度的线性聚合物溶液代替高粘度交联聚丙烯酰胺。柱便宜、易制备。高粘度交联聚丙烯酰胺。柱便宜、易制备。1)1)缓冲溶液中加入离子型表面活性剂，其浓度达到缓冲溶液中加入离子型表面活性剂，其浓度达到临界浓度，形成一疏水内核、外部带负电的胶束。临界浓度，形成一疏水内核、外部带负电的胶束。3 3、胶束电动毛细管色谱胶束电动毛细管色谱（MECC，MEKC）在电场力的作在电场力的作用下，胶束
40、在柱中用下，胶束在柱中移动。移动。2)2)电泳流和电渗流的方向相反电泳流和电渗流的方向相反,且且电渗流电渗流 电泳电泳 ，负电胶束以较慢的速度向负极移动；负电胶束以较慢的速度向负极移动；5)5)色谱与电泳分离模色谱与电泳分离模式的结合。式的结合。3)3)中性分子在胶束相和溶液（水相）间分配，疏中性分子在胶束相和溶液（水相）间分配，疏水性强的组分与胶束结合的较牢，流出时间长；水性强的组分与胶束结合的较牢，流出时间长；4)4)可用来分离中性物质，扩展了高效毛细管电泳可用来分离中性物质，扩展了高效毛细管电泳的应用范围；的应用范围；1)1)根据等电点差别分离生物大分子的高分辨率电根据等电点差别分离生物
41、大分子的高分辨率电泳技术；泳技术；2)2)毛细管内充有两性电解质（合成的具有不同等毛细管内充有两性电解质（合成的具有不同等电点范围的脂肪族多胺基多羧酸混合物），当施加电点范围的脂肪族多胺基多羧酸混合物），当施加直流电压（直流电压（6 68 8V V）时，管内将建立一个由阳极到阴）时，管内将建立一个由阳极到阴极逐步升高的极逐步升高的pHpH梯度；梯度；3)3)氨基酸、蛋白质、多肽等的所带电荷与溶液氨基酸、蛋白质、多肽等的所带电荷与溶液pHpH有关，在酸性溶液中带正电荷，反之带负电荷。在有关，在酸性溶液中带正电荷，反之带负电荷。在其等电点时，呈电中性，淌度为零；其等电点时，呈电中性，淌度为零；4
42、4、毛细管等电聚焦、毛细管等电聚焦 4)4)聚焦：具有不同等电点的生物试样在电场力的聚焦：具有不同等电点的生物试样在电场力的作用下迁移，分别到达满足其等电点作用下迁移，分别到达满足其等电点pHpH的位置时，的位置时，呈电中性，停止移动，形成窄溶质带而相互分离；呈电中性，停止移动，形成窄溶质带而相互分离；5)5)阳极端装稀磷酸溶液，阴极端装稀阳极端装稀磷酸溶液，阴极端装稀NaOHNaOH溶液；溶液；6)6)加压将毛细管内分离后的溶液推出经过检测器加压将毛细管内分离后的溶液推出经过检测器检测；检测；7)7)电渗流在电渗流在CIEFCIEF中不利，应消除或减小。中不利，应消除或减小。1.1.将两种淌
43、度差别很大的缓冲液分别作为前导将两种淌度差别很大的缓冲液分别作为前导离子离子(充满毛细管充满毛细管)和尾随离子，试样离子的淌度全和尾随离子，试样离子的淌度全部位于两者之间，并以同一速度移动。部位于两者之间，并以同一速度移动。2.2.负离子分析时，前导电解质的淌度大于试样负离子分析时，前导电解质的淌度大于试样中所有负离子的。所有试样都按前导离子的速度等中所有负离子的。所有试样都按前导离子的速度等速向阳极前进，逐渐形成各自独立的区带而分离。速向阳极前进，逐渐形成各自独立的区带而分离。阴极进样，阳极检测。阴极进样，阳极检测。5 5、毛细管等速电泳、毛细管等速电泳 3.3.不同离子的淌度不同，所形成区
44、带的电场强不同离子的淌度不同，所形成区带的电场强度不同度不同(=EE)，淌度大的离子区带电场强度小；，淌度大的离子区带电场强度小；沿出口到进口，将不同区带依次排序沿出口到进口，将不同区带依次排序1 1、2 2、3 3、4 4 电场强度依次增大。假设电场强度依次增大。假设“2”2”号中离子扩号中离子扩散到散到“3”3”号，该区电场强度大，离子被加速，返号，该区电场强度大，离子被加速，返回到回到“2”2”区；当区；当“2”2”号中离子跑到号中离子跑到“1”1”号区，号区，离子被减速使之归队；离子被减速使之归队；4.4.特点：界面明显，富集、浓缩作用；特点：界面明显，富集、浓缩作用；在毛细管壁上键合
45、或涂渍高效液相色谱的固定在毛细管壁上键合或涂渍高效液相色谱的固定液，以电渗流为流动相，试样组分在两相间的分配液，以电渗流为流动相，试样组分在两相间的分配为分离机理的电动色谱过程；为分离机理的电动色谱过程；6 6、毛细管电渗色谱、毛细管电渗色谱九、高效毛细管电泳应用与进展九、高效毛细管电泳应用与进展 1 1、离子分析、离子分析阳离子分析阳离子分析迁移方向和电渗流方迁移方向和电渗流方向一致；向一致；4.5min4.5min内分离了内分离了2424种种金属离子；金属离子；阳极进样，阴极检测；阳极进样，阴极检测；具有很高的灵敏度；具有很高的灵敏度；阴离子分析阴离子分析 阴离子电泳方向和电渗流阴离子电泳
46、方向和电渗流方向相反、速度接近，分析方向相反、速度接近，分析时间长、效率低；时间长、效率低；质量小、电荷密度大的离质量小、电荷密度大的离子如：子如：SOSO4 4-2-2、ClCl-、F F-等，电等，电泳速率大于电渗流，阳极端泳速率大于电渗流，阳极端流出，在阴极端无法检测；流出，在阴极端无法检测；加入电渗流改性剂，十六加入电渗流改性剂，十六烷基三甲基溴化胺等，使电烷基三甲基溴化胺等，使电泳方向和电渗流方向一致，泳方向和电渗流方向一致，可在可在3.1min3.1min内分离内分离3636种阴离种阴离子；阴极进样，阳极检测；子；阴极进样，阳极检测；2 2、药物分析、药物分析 检测体液或细胞检测体
47、液或细胞中某些代谢产物的分中某些代谢产物的分析；析；尿液中的氨基酸尿液中的氨基酸含量作为临床诊断糖含量作为临床诊断糖尿病的辅助手段；尿病的辅助手段；采用毛细管区带采用毛细管区带电泳方式，在电泳方式，在11min11min内分离内分离1717种药物；种药物；采用采用MEKCMEKC模式，模式，鉴定违禁药物；鉴定违禁药物；效果优于效果优于HPLGHPLG法法3 3、手性化合物分析、手性化合物分析 合成获得单一手性化合物相当困难；合成获得单一手性化合物相当困难；528528种手性种手性合成药物，合成药物，6161种以单一对映体形式销售，其他为外种以单一对映体形式销售，其他为外消旋体；检测分析也相当困
48、难；研究热点；消旋体；检测分析也相当困难；研究热点；R-R-反应停是安眠药，反应停是安眠药，S-S-式致胎儿畸形；式致胎儿畸形；HPCEHPCE分离分析手性化合物的方法：加入手性选分离分析手性化合物的方法：加入手性选择剂；形成配合物的稳定常数有差异，结合择剂；形成配合物的稳定常数有差异，结合HPCEHPCE的的高效率；高效率；常用手性选择剂：环糊精及其衍生物；手性冠常用手性选择剂：环糊精及其衍生物；手性冠醚；手性表面活性剂（氨基酸衍生物、胆酸钠、牛醚；手性表面活性剂（氨基酸衍生物、胆酸钠、牛磺脱氧胆酸及其钠盐、低聚糖等天然手性表面活性磺脱氧胆酸及其钠盐、低聚糖等天然手性表面活性剂）剂）4 4、
49、氨基酸与蛋白质分析、氨基酸与蛋白质分析采用采用MEKCMEKC模式，在模式，在2525分钟内分离了分钟内分离了2323种丹酰化氨基酸；种丹酰化氨基酸；HPCEHPCE可取代传统的氨基酸分析仪；可取代传统的氨基酸分析仪；问题：吸附和检测；问题：吸附和检测；蛋白质分析蛋白质分析5 5、核酸分析及、核酸分析及DNADNA排序排序重要分析手段；图，酶解的双螺旋DNA限制性片段的分离；6 6、新进展、新进展1 1）微型化）微型化 整体化学分析系统（整体化学分析系统（TASTAS）及）及TASTAS微型化微型化 在硅片上光刻出矩形槽作为毛细管在硅片上光刻出矩形槽作为毛细管，理论塔板数理论塔板数10105 5/m/m；2 2）联用仪器）联用仪器 CE-MS；3 3）阵列毛细管凝胶电泳）阵列毛细管凝胶电泳 应用于人类基因应用于人类基因DNADNA测序；测序；
