1、 第十三章第十三章 可见分光光度法和可见分光光度法和紫外紫外分光光度法（分光光度法（spectrophotometry)分析化学分析化学化学分析法化学分析法仪器分析法仪器分析法光谱分析法光谱分析法色谱分析法色谱分析法质谱分析法质谱分析法电化学分析法电化学分析法核磁共振分析法核磁共振分析法可见、紫外可见、紫外、红外分、红外分光光度法、荧光光度光光度法、荧光光度法、原子吸收法等法、原子吸收法等激光诱导荧光光谱的灵敏度已达激光诱导荧光光谱的灵敏度已达10-22克，达到了检测单个分子的水平，克，达到了检测单个分子的水平，可用于癌症的早期诊断。可用于癌症的早期诊断。分光光度法分光光度法是根据物质的是根据
2、物质的吸收光谱吸收光谱和和光的吸收定光的吸收定律律，对物质进行定量，对物质进行定量、定性分析的一种仪器分析方法。定性分析的一种仪器分析方法。所选用的光源所选用的光源 紫外分光光度法紫外分光光度法 特点：灵敏度高特点：灵敏度高-10-5 mol/L 10-6 mol/L 相对误差小相对误差小-2%5%应用广泛应用广泛-医药、卫生、环保、化工医药、卫生、环保、化工可见分光光度法可见分光光度法红外分光光度法红外分光光度法4第一节第一节 物质的吸收光谱物质的吸收光谱第二节第二节 分光光度法基本原理分光光度法基本原理第三节第三节 可见分光光度法可见分光光度法第四节第四节 提高测量灵敏度和准确度的方法提高
3、测量灵敏度和准确度的方法第五节第五节 紫外分光光度法简介（紫外分光光度法简介（不要求不要求）本章内容：本章内容：起源于比色法起源于比色法试金石试金石61、溶液的颜色、溶液的颜色紫紫400红红660橙橙600黄黄560绿绿530青蓝青蓝450蓝蓝420青青500互补色互补色溶液的颜色是由于它选择性地吸收了一部分光，溶液的颜色是由于它选择性地吸收了一部分光，而呈现它的互补色而呈现它的互补色第一节第一节 物质的吸收光谱物质的吸收光谱72、物质对光的选择性吸收物质对光的选择性吸收（2）不同物质，它们的选择吸收性质不同）不同物质，它们的选择吸收性质不同（1）同一种物质对不同波长光的吸光度不同。）同一种物
4、质对不同波长光的吸光度不同。（3）溶液的颜色并不是某一个波长，而是一个波长带。）溶液的颜色并不是某一个波长，而是一个波长带。8分子吸收光谱产生：分子吸收光谱产生：分子吸收外界能量分子吸收外界能量（光、电、热）引起分子能级跃迁，从基态（光、电、热）引起分子能级跃迁，从基态跃迁到激发态跃迁到激发态 E=E1 E2=h=hc/E=Ee+Ev+Er微观（量子）解释：微观（量子）解释：11A=-lgT=lgI0It吸光度吸光度 T=ItI0透光率透光率3、物质的吸收光谱物质的吸收光谱12吸收光谱吸收光谱（absorption spectrum）A480 520 560nm 最大吸光度相对应最大吸光度相对
5、应的波长称为的波长称为最大吸最大吸收波长收波长，max光吸收曲线光吸收曲线 用不同波长的单色光用不同波长的单色光照射某一物质测定吸光度，照射某一物质测定吸光度，以波长为横坐标，以吸光以波长为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制曲线，度为纵坐标，绘制曲线，描述物质对不同波长光的描述物质对不同波长光的吸收能力。吸收能力。13 吸收曲线的形状和吸收曲线的形状和 max定性分析定性分析溶液的浓度愈大溶液的浓度愈大Amax愈大愈大(强度特征强度特征)定量分析定量分析吸收曲线作用：吸收曲线作用：14第二节第二节 分光光度法基本原理分光光度法基本原理一、透光率（一、透光率（transmittance）和吸光度（）
6、和吸光度（absorbance）I0 =Ia+It+IrI0It则上式简化为则上式简化为 I0 =Ia+It IrIa吸收池表面对入射光有吸收池表面对入射光有反射等反射等作用。为作用。为消除吸收池对光的反射等与被消除吸收池对光的反射等与被测物吸收无关的因素的影响，必须测物吸收无关的因素的影响，必须采用采用参比溶液参比溶液校正：在相同的吸收校正：在相同的吸收池中装入参比溶液池中装入参比溶液(又称空白溶液又称空白溶液)，调节仪器使透过参比池的吸光度，调节仪器使透过参比池的吸光度为零为零(称为工作零点称为工作零点)。在此条件下去测待测溶液，则。在此条件下去测待测溶液，则反射光强度大反射光强度大小近似
7、可相互抵消小近似可相互抵消(扣除参比扣除参比)。1516单位单位b 液层厚度：液层厚度：cmc 物质的量浓度：物质的量浓度：mol L-1 摩尔吸光系数：摩尔吸光系数：L mol-1 cm-1A=a b 单位单位b 液层厚度：液层厚度：cm 质量浓度：质量浓度：g L-1a 质量吸光系数：质量吸光系数：L g-1 cm-1二、二、Lambert-Beer 定律定律A=b c =a MT=10-bc17或或a越大，表明溶液对光越容易吸收。越大，表明溶液对光越容易吸收。一般，一般，大于大于103可用分光光度计测定。可用分光光度计测定。或或a与与、溶剂或溶质种类、温度有、溶剂或溶质种类、温度有关，与
8、关，与c、b无关无关吸光系数的讨论吸光系数的讨论18 朗伯朗伯-比耳定律的物理意义：当平行比耳定律的物理意义：当平行单色单色光光通过单一均匀的通过单一均匀的吸光物质吸光物质溶液时溶液时,溶液的溶液的吸光度与溶液浓度和液层厚度的乘积成正比。吸光度与溶液浓度和液层厚度的乘积成正比。朗伯朗伯-比耳定律是吸光光度法的理论基础比耳定律是吸光光度法的理论基础和定量测定的依据。广泛地应用于紫外光、和定量测定的依据。广泛地应用于紫外光、可见光、红外光区的吸收测量，也适用于原可见光、红外光区的吸收测量，也适用于原子吸收测量。子吸收测量。19 解：解：（1）A=a b 0.22=a 2 140 10-6 a=78
9、5.7L/g cm （2）=a M=785.7 112.4=8.83 104 L/mol cm（3 A=-lgT=0.22 lgT=-0.22，T=10-0.22=0.60=60%例例1 Cd2+浓度为浓度为140m mg/L，双硫腙法显色测定波长为，双硫腙法显色测定波长为520nm，液层厚度，液层厚度2cm，吸光度为，吸光度为0.22，求，求a、和和T20例例2 一有色溶液的浓度为一有色溶液的浓度为c，透光率为，透光率为T;求浓度为原来的求浓度为原来的1/2时，透光率为多少？时，透光率为多少？解：解：T=10-bc c T 例例3 有色溶液的液层厚度增加一倍后，透光率和有色溶液的液层厚度增加
10、一倍后，透光率和 吸光度的吸光度的 改变为多少？改变为多少？解：解：T=10-bc b T A 1/2cT 1/2T2 2A2b21第三节第三节 可见分光光度法可见分光光度法一、分光光度计一、分光光度计22分光光度计四大系统分光光度计四大系统光源系统光源系统 检测检测 器器 吸收吸收 池池分光系统分光系统数据处理器数据处理器231.光源系统光源系统提供波长范围为提供波长范围为3601000nm的连续光谱。的连续光谱。可见光光源为钨灯，要求强度高，稳定性好可见光光源为钨灯，要求强度高，稳定性好2.分光系统分光系统提供所需波长的单色光。提供所需波长的单色光。单色器由狭缝、光栅和准直镜组成，要求适单
11、色器由狭缝、光栅和准直镜组成，要求适 当宽度的狭缝，以保证单色光光强和纯度当宽度的狭缝，以保证单色光光强和纯度3.吸收池吸收池用来盛放溶液的容器。用来盛放溶液的容器。可见光区用光学玻璃，要求光洁、透明、相互匹配可见光区用光学玻璃，要求光洁、透明、相互匹配4.检测系统检测系统进行光电转换、信号放大及输出。进行光电转换、信号放大及输出。由光电管、放大器、指示器、数字显示器由光电管、放大器、指示器、数字显示器 和打印器等装置构成和打印器等装置构成241.标准曲线法标准曲线法根据根据 Lambert-Beer Law，以该物质，以该物质吸收光谱图中的吸收光谱图中的，测定被测物质标准品配制的一系列浓，测
12、定被测物质标准品配制的一系列浓度溶液的度溶液的A。以。以A为纵坐标，以溶液浓度为横坐标，可为纵坐标，以溶液浓度为横坐标，可得一条通过坐标原点的直线。然后，在相同的实验条件得一条通过坐标原点的直线。然后，在相同的实验条件下测定被测液的下测定被测液的A，在标准曲线上查出被测液的浓度，在标准曲线上查出被测液的浓度25 二、测定方法二、测定方法 可见紫外分光光度法主要用于定量分析可见紫外分光光度法主要用于定量分析（一）标准曲线法（一）标准曲线法c（mg/L）A max=550nm 40 80 120 2000.60.40.20.01、max为入射光为入射光2、配制溶液、配制溶液,并并测吸光度测吸光度
13、c1c2c3A1A2A33、测待测样品、测待测样品的吸光度的吸光度Ax4、从工作曲线、从工作曲线上查出上查出cxAxcx26第四节第四节 提高测量灵敏度和准确度的方法提高测量灵敏度和准确度的方法一、分光光度法的误差一、分光光度法的误差（一）溶液偏离（一）溶液偏离Beer定律引起的误差定律引起的误差 （1）仪器有关的因素）仪器有关的因素（2）试样溶液有关的因素）试样溶液有关的因素27难以获得真正的纯单色光难以获得真正的纯单色光，分光光度计只能分光光度计只能获得近乎单色的狭窄光带获得近乎单色的狭窄光带如何克服非单色光引起的偏离如何克服非单色光引起的偏离1 1、应选择分辨率高的单色器。、应选择分辨率
14、高的单色器。2 2、工作波长为、工作波长为 max（吸收曲线较平吸收曲线较平坦，即坦，即AA很小，则可近似认为是单很小，则可近似认为是单色光色光）（1）仪器有关的因素）仪器有关的因素28（2）试样溶液有关的因素）试样溶液有关的因素（a a）浓度）浓度 当溶液浓度当溶液浓度c 10-2molL-1时，吸光质点间平均距离缩小时，吸光质点间平均距离缩小,相邻质点间的电荷分布相互影响，从而改变它们对光的相邻质点间的电荷分布相互影响，从而改变它们对光的吸收能力。吸收能力。（b）体系（介质）不均匀）体系（介质）不均匀 大部分被待测物质吸收，还有少部分光因折射、散射或大部分被待测物质吸收，还有少部分光因折射
15、、散射或反射而被损失反射而被损失胶体溶液、乳浊液或悬浊液胶体溶液、乳浊液或悬浊液（c）化学因素的影响）化学因素的影响 朗伯朗伯-比耳定律假定：所有的吸光质点之间不发生相互作用比耳定律假定：所有的吸光质点之间不发生相互作用31用仪器测定时应尽量使溶液透光度值在用仪器测定时应尽量使溶液透光度值在T=2065%(吸光度吸光度 A=0.700.20)。（二）光度误差（二）光度误差（光源不稳定、检测系统的测光源不稳定、检测系统的测量误差等量误差等）32三、选择合适的测定条件三、选择合适的测定条件（一）波长的选择（一）波长的选择问：为什么通常选择波长为问：为什么通常选择波长为 max的光作为入射光？的光作
16、为入射光？1、在在 max处，溶液的吸光系数最大，测定的处，溶液的吸光系数最大，测定的灵敏度灵敏度最高。最高。2、在、在 max附近，吸收曲线较平坦，附近，吸收曲线较平坦，很小，测定误差很小，测定误差小小。（二）空白溶液的选择（二）空白溶液的选择空白溶液（参比）空白溶液（参比）以消除溶液中待测组分以外以消除溶液中待测组分以外（其它组分和溶剂）的吸收以及吸收池的反射（其它组分和溶剂）的吸收以及吸收池的反射等所带来的误差。等所带来的误差。1、溶剂空白、溶剂空白2、试剂空白、试剂空白3、试样空白、试样空白34spectrophotometry 分光光度法分光光度法absorption spectrum 吸收光谱吸收光谱transmittance 透光率透光率absorbance 吸光度吸光度
