1、第十一章 食品添加剂的测定8/16/20221目 录8/16/20222第一节第一节 概述概述第二节第二节 甜味剂的测定甜味剂的测定糖精钠、甜蜜素、甜味素糖精钠、甜蜜素、甜味素第三节第三节 防腐剂防腐剂苯甲酸及山梨酸、对羟基苯甲酸及山梨酸、对羟基苯甲酸酯、丙酸钙、脱氢苯甲酸酯、丙酸钙、脱氢乙酸、禁用防腐剂乙酸、禁用防腐剂第四节第四节 抗氧化剂抗氧化剂BHA、BHT、PG、第五节第五节 发色剂发色剂硝酸盐、亚硝酸盐硝酸盐、亚硝酸盐第六节第六节 漂白剂漂白剂亚硫酸盐、过氧化苯甲酰亚硫酸盐、过氧化苯甲酰第七节第七节 着色剂着色剂第一节 概述 一、食品添加剂的定义与用途 在食品的生产加工过程中，由于某
2、些需要，有意识地向食品中添加少量化学合成物质或天然物质，在食品工艺学上把这些物质称为食品添加剂。中华人民共和国食品卫生法对食品添加剂的定义为“为了改善食品品质和色、香、味以及为满足防腐和加工工艺的需要而加入食品中的化学合成物或者天然物质。”该法还规定了食品强化剂的定义是“为增强营养成分而加入食品中的天然或人工合顾的属于天然营养范围的食品添加剂”。8/16/20223食品添加剂按其来源分为天然与合成两类：天然食品添加剂主要来自于动、植物组织或微生物的代谢产物。人工合成食品添加剂是通过化学手段使元素或化合物发生氧化、还原、缩合、聚合、成盐等一系列化学反应而制成。食品添加剂种类有：防腐剂、抗氧化剂、
3、发色剂、漂白剂、酸味剂、凝固剂、疏松剂、增稠剂、消泡剂、甜味剂、着色剂、乳化剂、品质改良剂、抗结剂、酶制剂、香料、营养强化剂、食品加工助剂、增味剂、保鲜剂及其它添加剂等。8/16/20224使用食品添加剂应该遵循以下原则：1.经过规定的食品毒理学安全评价程序的评价证明在使用限量内长期使用对人体安全无害。2.不影响食品感官性质和原味，对食品营养成分不应有破坏作用。3.食品添加剂应有严格的质量标准，其有害杂质不得超过允许限量。4.不得由于使用食品添加剂而降低良好的加工措施和卫生要求。5.不得使用食品添加剂掩盖食品的缺陷或作为伪造的手段。6.未经卫生部允许婴儿及儿童食品不得加入食品添加剂。8/16/
4、20225二、食品添加剂的卫生学问题 1.急性和慢性中毒 2.引起变态反应 3.体内蓄积问题 4.食品添加剂的转化问题 8/16/20226三、食品添加剂的测定 食品添加剂的分析测定一般包括三部分的内容，即：添加剂本身的测定，以保证其应有的质量标准和安全性，主要有鉴别试验、含量分析、质量指标分析等；食品中食用添加剂的定性、定量分析；食品中禁用添加剂的测定。日常检验中经常遇到的食品添加剂主要有防腐剂、抗氧化剂、着色剂、发色剂、甜味剂等，测定方法：比色法、紫外分光光度法、薄层色谱法、HPLC法8/16/20227食品中常见添加剂的测定防腐剂的测定防腐剂的测定食品中食品中苯甲酸、山梨酸及其盐苯甲酸、
5、山梨酸及其盐的测定的测定食品中食品中对羟基苯甲酸酯对羟基苯甲酸酯的测定的测定食品中食品中丙酸钠、丙酸钙丙酸钠、丙酸钙的测定的测定食品中食品中脱氢乙酸脱氢乙酸的测定的测定禁用防腐剂禁用防腐剂的检验的检验抗氧化剂的测抗氧化剂的测定定食品中食品中BHA和和BHT的测定的测定油脂中油脂中PG的测定的测定甜味剂的测定甜味剂的测定食品中的食品中的糖精钠糖精钠的分析的分析食品中食品中环已基氨基磺酸钠环已基氨基磺酸钠的测定的测定食品中食品中天门冬酰苯丙氨酸甲酯天门冬酰苯丙氨酸甲酯的测定的测定漂白剂的测定漂白剂的测定食品中食品中亚硫酸盐亚硫酸盐的测定的测定食品中食品中过氧化苯甲酰过氧化苯甲酰的测定的测定 食品中
6、发色剂食品中发色剂亚硝酸盐与硝酸盐亚硝酸盐与硝酸盐含量的分析含量的分析食品中着色剂的测定食品中着色剂的测定8/16/20228第二节 甜味剂的测定一、主要甜味剂的性质 甜味剂是赋予食品甜味的添加剂，可分为天然甜味剂和人工合成甜味剂。天然甜味剂中包括蔗糖、果糖、葡萄糖、麦芽糖等天然糖类和糖的衍生物（如木糖醇、麦芽糖醇等）以及其它天然甜味物（如甜菊糖甙、甘草酸、某些蛋白质等）。人工合成甜味剂主要是一些具有甜味的化学物质，其甜度一般比蔗糖高数十倍仍至数百倍，但不具有任何营养价值。我国批准并广泛使用的主要有糖精钠、环已基氨基磺酯钠（甜蜜素）、天门冬酰氨酸甲酯（甜味素）等。8/16/20229 糖精化学
7、名称为邻-磺酰苯甲酰亚胺其分子式为C7H5O3NS，白色结晶或白色晶状粉末，难溶于水，溶于乙醚、乙醇、氯仿等有机试剂，化学性质不稳定，遇热易分解。糖精钠为糖精的钠盐，是含有两个水分子的无色或白色结晶，无臭，稍有苦味，在空气中风化失去结晶水后成粉末状。溶于水，不溶于乙醚、乙醇、氯仿等有机试剂，化学性质较为稳定。8/16/202210 糖精对人体无营养价值，一般认为糖精钠在体内不被利用，大部分由尿排出。有试验表明，过量摄入糖精钠可导致实验动物肿瘤发生率增大。国际上对糖精钠的利用普遍采取限制态度。美国允许使用在软饮料0.072g/L；冷饮0.150g/L；糖果2.12.6g/kg；烘焙食品0.012
8、g/kg。FAO/WHO规定糖精的ADI为2.5mg/kg体重，在膳食治疗中为10mg/kg体重。8/16/202211 甜蜜素化学名称为环已基氨基磺酸钠，分子式为C6H12NaO3S，结构式为：甜蜜素纯品为白色结晶粉末，甜度为蔗糖的40-70倍，易溶水，微溶于乙醇，不溶于三氯甲烷、乙醚。摄入体内后，40%由尿排出，其余的由粪便排出。主要供糖尿病患者使用，使用浓度不超过0.4%，FAO/WHO规定ADI为11mg/kg体重。8/16/202212NHSO3Na二 食品中甜味剂的允许量标准 8/16/2022138/16/202214食品中的糖精钠的分析 糖 精 钠 的 测 定 方 法 较 多，
9、国 家 标 准GB/T5009.28-1996中规定了高效液相色谱法、薄层色谱法及离子选择电极法测定食品中糖精钠的标准方法。另外气相色谱法、比色法、紫外吸收分光光度法、荧光法等方法也常用于测定糖精钠。应用气相色谱法测定时，样品提取液中的糖精钠需要通过甲基化或三甲基硅烷化处理，然后才能进行气相色谱分离测定。比色法测定糖精钠是应用糖精钠与苯酚-硫酸在175下反应，生成酚磺肽，在碱性条件下生成红色产物的原理进行测定。8/16/202215（一）高效液相色谱法1 原理 样品加温除去二氧化碳和乙醇，调pH至近中性，过滤后进高效液相色谱仪经反相色谱分离后，根据保留时间和峰面积进行定性和定量分析。2 试剂
10、（）甲醇：经滤膜（0.5m）过滤 （）氨水（）：氨水加等体积的水混合 （）乙酸铵溶液（0.02mol/L)：称取1.54g乙酸，加水至1000mL溶解，经滤膜（0.45m）过滤 （）糖精钠标准储备溶液（1.0mg/mL）：准确称取0.0851g经120烘干小时后的糖精钠，加水溶解定容至1000mL。（）糖精钠标准使用溶液（0.1mg/mL）：吸取糖精钠标准储备液10.0mL放入100mL容量瓶中，加水至刻度，经滤膜（0.45m）过滤。8/16/202216仪器高效液相色谱仪，紫外检测器分析步骤（）样品处理汽水：称取5.0010.00g样品，放入小烧杯中，微温搅拌除去二氧化碳，用氨水(1+1)调
11、pH约为。加水定容至适当体积，经滤膜（0.45m）过滤。果汁类：称取5.0010.00g样品，放入小烧杯中，用氨水(1+1)调pH约为。加水定容至适 当 体 积，离 心 沉 淀，上 清 液 经 滤 膜（0.45m）过滤。配制酒类：称取10.00g样品，放入小烧杯中，水浴加热除去乙醇，用氨水(1+1)调pH约为。加水定容至适当体积，经滤膜（0.45m）过滤。8/16/202217称样称样加热加热调调pH过滤过滤（）高效液相色谱条件色谱柱：YWG-C18 4.6mm250mm 10m不锈钢柱。流动相：甲醇：乙酸铵溶液(0.02mol/L)(5+95)。流速：1mL/min 检测器：紫外检测器，波长
12、230nm，灵敏度0.2AUFS（）测定取样品处理液和标准使用液各10L（或相同体积）注入高效液相色谱仪进行分离测定，根据峰保留时间定性，峰面积定量。8/16/202218（）计算 式中:1样品中糖精钠含量，g/kg；m1进样体积中糖精钠的质量，mg；V1样品稀释液总体积，mL；V2进样体积，mL；m2样品质量，g。结果表达：报告算术平均数的三位小数。允许相对相差小于10%.8/16/2022191000100012211VVmmX（二）薄层色谱法 原理在酸性条件下，食品中的糖精钠用乙醚提取、浓缩、薄层色谱分离，显色后与标准比较，进行定性和半定量分析。试剂(1)乙醚：不含过氧化物。(2)无水硫
13、酸钠(3)无水乙醇及95%乙醇 (4)聚酰胺粉：200目(5)盐酸（1+1）：取100mL盐酸加水稀释至200mL。(6)展开剂：正丁醇氨水无水乙醇(7+1+2)，异丙酮氨水无水乙醇(7+1+2)(7)显色剂：溴甲酚紫溶液(0.4g/L)称取0.04g溴甲酚紫，用95%乙醇溶解，加氢氧化钠溶液(4g/L)1.1mL调节pH为，定容至100mL。8/16/202220(8)硫酸铜溶液(100g/L)(9)氢氧化钠溶液(40g/L)。(10)糖精钠标准溶液：准确称取0.0851g经120烘干小时后的糖精钠，加乙醇溶解，移入100mL容量瓶中，加95%乙醇稀 释 至 刻 度。此 溶 液 每 毫 升
14、相 当 于 1 m g 糖 精 钠（C6H4CONNaSO22H2O）。3 仪器(1)玻璃纸：生物制品透析袋或不含增白剂的市售玻璃纸。(2)玻璃喷雾器 (3)微量注射器(4)紫外灯：波长253.7nm(5)薄层板：10cm20cm 或20cm20cm(6)展开槽8/16/2022214 分析步骤(1)样品提取饮料、冰棍、汽水：取10mL均匀试样（如样品中含有二氧化碳，先加热除去，如样品中含有酒精，加4%氢氧化钠溶液使其呈碱性，在沸水浴中加热除去）置于100mL分液漏斗中，加2mL盐酸(1+1)，用30,20,20mL乙醚提取次，合并提取液，用5mL盐酸酸化的水洗涤一次，弃去水层，乙醚层通过无水
15、硫酸钠脱水后，挥干乙醚，加2.0mL乙醇溶解残留物，密塞保存，备用。酱油、果汁、果酱等：称取20.0g磨碎的均匀试样，置于100ml容量瓶中，加水至约60ml，加20ml硫酸铜溶液（100g/L），混匀，再加4.4ml氢氧化钠溶液（40/L），加水至刻度，混匀，静置30min，过滤，取50ml滤液置于250ml分液漏斗中，以下按自“加2ml盐酸（1+1）”操作。8/16/202222 固体果汁粉等：称取20.0g磨碎的均匀试样，置于200ml容量瓶中，加100ml水，加温使之溶解、放冷，以下按自“加20ml硫酸铜溶液（100g/L）”操作。糕点、饼干等蛋白质、脂肪、淀粉含量高的样品：称取25.
16、0g均匀试样，置于透析用玻璃纸中，放入大小适当的烧杯中，加50ml氢氧化钠溶液（0.8g/L）调成糊状，将玻璃纸口扎紧，放入盛有200ml氢氧化钠溶液（0.8g/L）的烧杯中，盖上表面皿，透析过夜。量取125ml透析液（相当于12.5g样品），加约0.4ml盐酸（1+1）使成中性，加20ml硫酸铜溶液（100g/L），混匀，再加4.4ml氢氧化钠溶液（40g/L），混匀，静置30min，过滤。取120ml（相当于10g样品），置于250ml分液漏斗中，以下按自“加2ml盐酸（1+1）”操作。8/16/202223 （2）薄层板的制备 称取1.6g聚酰胺粉，加0.4g可溶性淀 粉，加 约 7.0
17、 m L 水，研 磨 3 5 m i n，立 即 涂 成0.250.30mm厚的10cm20cm的薄层板，室温干燥后，在80下干燥1h。置于干燥器中保存。（3）点样 在薄层板下端2cm处，用微量注射器点10mL和20mL的样液二个点，同时点3.0,5.0,7.0,10.0mL糖精钠标准溶液，各点间距1.5cm。（4）展开与显色 将点好的薄层析放入盛有展开剂的展开槽中，展开剂液层约0.5cm，并预先已达到饱和状态。展开至10cm，取出薄层板，挥干，喷显色剂，斑点显黄色，根据样品点和标准定性，根据斑点颜色深浅进行半定量。8/16/2022245 计算 式中：X2样品中糖精钠的含量，g/kg或g/L
18、；m3测定用样液中糖精钠的质量，mg；V4点板样液质量（体积），g或ml；V3样品提取液残留物加入乙醇的体积，mL;M4样品质量，g8/16/2022251000100034432VVmmX(三)离子选择电极测定法1.原理 糖精选择电极是以季铵盐所制薄膜为感应膜的电极，它和作为参比电极的饱和甘汞电极配合使用以测定食品中糖精钠的含量。当测定温度、溶液总离子强度和溶液接界电位电位条件一致时，测得的电位遵守能斯特方程式电位差随溶液中糖精钠离子的活度（或浓度）改变而变化。被测溶液中糖精钠含量在0.021mg/ml范围内。电极电位值与糖精离子浓度负对数成直线关系。8/16/202226样品提取样品提取转
19、移蒸干转移蒸干溶解溶解测电位测电位比较定量比较定量2.试剂（1）乙醚：使用前用盐酸（6mol/L）饱和。（2）无水硫酸钠（3）盐酸（6mol/L）（4）氢氧化钠溶液：0.06mol/L、0.02mol/L、40g/L（5）硫酸铜溶液（100g/L）（6）磷酸二氢钠c(NaH2PO42H2O)=1mol/L溶液（7）磷酸氢二钠c(Na2HPO412H2O)=1mol/L溶液（8）总离子强度调节缓冲液：87.7ml磷酸二氢钠溶液（1mol/L）和12.3ml 磷酸氢二钠溶液（1mol/L）混合。（9）糖精钠标准溶液：准确称取0.0851g经120烘干小时后的糖精钠结晶，移入100mL容量瓶中，加水
20、稀释至刻度。此溶液每毫升相当于1mg糖精钠。8/16/202227 3 仪器 精密级酸度计或离子活度计或其它精密级电位仪，准确至1mV。糖精选择电极。217型甘汞电极：具双盐桥式甘汞电极，下面的盐桥内装入含1%琼脂的氯化钾溶液（3mol/L）。磁力搅拌器 透析用玻璃纸。8/16/2022284.测定步骤样品提取 提取方法同前法测定 标准曲线的绘制：准确吸取0，0.5，1.0，2.5，5.0，10.0mL糖精钠标准溶液(相当于0，0.5，1.0，2.5，5.0，10.0mg糖精钠)，分别置于50ml容量瓶中，各加5mL总离子强度调节缓冲液，加水至刻度，摇匀。将糖精选择电极和甘汞电极分别与测量仪器
21、的负端和正端相连接，将电极插入盛有水的烧杯中，按其仪器的使用说明书调节至使用状态，在搅拌下用水洗至电极起始电位(例如某些电极起始电位达-320mV)。取出电极用滤纸吸干。将上述标准系列溶液按低浓度到高浓度逐个测定，得其在搅拌时的平衡电位值(-mV)。在半对数纸上以毫升(毫克)为纵坐标；电位值(-mV)为横坐标绘制标准曲线。8/16/202229样品的测定：准确吸取20mL乙醚提取液置于50mL烧杯中，挥发至干残渣，加5mL总离子强度调节缓冲液。小心转动，振摇烧杯使残渣溶解，将烧杯内容物全部定量转移入50mL容量瓶中，原烧杯用少量水多次漂洗后，并入容量瓶中，最后加水至刻度摇匀。依法测定其电位值(
22、-mV),，查标准曲线求得测定液中糖精钠毫克数。计算 m5 1000 X3=m6(V6/V5)1000式中：X：样品中糖精钠的含量，gkg或g/L；m5测定液中糖精钠的质量，mg6 V5乙醚提取液的体积，m山 V6分取乙醚提取液的体积，mL；m6样品的质量或体积，g或mL。8/16/202230食品中环已基氨基磺酸钠的测定 GB13112-91规定了气相色谱法、比色法、薄层色谱法测定食品中环已基氨基磺酸钠的测定方法。其中气相色谱法及比色法适用于饮料、凉果等食品中环已基氨基磺酸钠的测定，薄层层析法适用于饮料、果汁、果酱、糕点中环已基氨基磺酸钠的测定。（一）气相色谱法 本方法适用于饮料、凉果等食品
23、中环已基氨基磺酸钠的测定。1 原理 在硫酸介质中环己基氨基磺酸钠与亚硝酸反应，生成环己醇亚硝酸酯，利用气相色谱法进行定性和定量。8/16/202231试样制备试样制备提取提取反应反应GC分析分析比较定量比较定量标准系列标准系列GC分析分析2 试剂（1）正己烷 （2）氯化钠。（3）层析硅胶(或海砂)。（4）50gL亚硝酸钠溶液。（5）100gL硫酸溶液。（6）环己基氨基磺酸钠标准溶液：精确称取1.0000g环己基氨基磺酸钠，加水溶解并定容至100mL，此溶液每毫升含环己基氨基磺酸钠10mg。8/16/202232 3 仪器（1）气相色谱仪附氢火焰离子化检测器。（2）旋涡混合器。（3）离心机。（4
24、）微量注射器。4 分析步骤（1）试料制备 液体试样：称取20.0g试样于100mL带塞比色管，置冰浴中。固体试样：称取2.0g已剪碎的试样于研钵中，加少许层析硅胶(或海砂)研磨至呈干粉状，经漏斗倒入100mL容量瓶中，加水冲洗研钵，并将洗液一并转移至容量瓶中，加水至刻度，不时摇动，1h后过滤，即得试料，准确吸取20mL于100mL带塞比色管，置冰浴中。8/16/202233（2）色谱条件 色谱柱：长2m，内径3mm，U形不锈钢柱。固定相：Chromosorb W AW DMCS 80100目，涂以10SE30。测定条件 柱温：80；汽化温度：150；检测温度：150。（3）测定 标准曲线的制备
25、：准确吸取1.00mL环己基氨基磺酸钠标准溶液于100mL带塞比色管中，加水20mL，置冰浴中，加入5mL 50g/L亚硝酸钠溶液，5mL 100g/L硫酸溶液，摇匀，在冰浴中放置30min，并经常摇动，然后准确加入10mL正己烷，5g氯化钠，摇匀后置旋涡混合器上振动1min(或振摇80次)，待静止分层后吸出己烷层于10mL带塞离心管中进行离心分离，每毫升己烷提取液相当1mg环己基氨基磺酸钠，将标准提取液进样l5L于气相色谱仪中，根据响应值绘制标准曲线。8/16/202234样品管按自“加入5mL 50g/L亚硝酸钠溶液”起依法操作，然后将试料同样进样l5mL，测得响应值，从标准线图中查出相应
26、含量。5计算式中：X样品中环己基氨基磺酸钠的含量，gkg；m样品质量，g；V进样体积，L；10正己烷加入量，mL，A测定用试料中环己基氨基磺酸钠的含量，g。两次平行测定相对允许误差绝对值10，平行测定结果用算术平均值表示，保留二位小数。8/16/202235X=A101000mV1000=10Am V （一）比色法 本方法适用于饮料、凉果等样品中环已基氨基磺酸钠的测定。1 原理 在硫酸介质中环己基氨基磺酸钠与亚硝酸钠反应，生成环己醇亚硝酸酯，与磺胺重氮化后再与盐酸萘乙二胺偶合生成红色染料，在550nm波长测其吸光度，与标准比较定量。2 试剂（1）三氯甲烷。（2）甲醇。（3）透析剂：称取05g二
27、氯化汞和125g氯化钠于烧杯中，以001mol儿盐酸溶液定容至100mL。（4）10gL亚硝酸钠溶液。（5）100g/L硫酸溶液。8/16/202236（6）100g/L尿素溶液(临用时新配或冰箱保存)。（7）100g/L盐酸溶液（8）10g/L磺胺溶液：称取1g磺胺溶于10盐酸溶液中，最后定容至100mL（9）1g/L盐酸萘乙二胺溶液（10）环己基氨基磺酸钠标准溶液：精确称取0.1000g环己基氨基磺酸钠，加水溶解最后定容至100mL,此溶液每毫升含环己基氨基磺酸钠1mg。临用时将环己基氨基磺酸钠标准溶液稀释10倍。此液每毫升含环己基氨基磺酸钠0.1mg。3 仪器（1）分光光度计。（2）旋涡
28、混合器。（3）离心机。（4）透析纸。8/16/2022374 分析步骤（1）试样处理 同气相色谱法。（2）提取液体试料：称取10.0g试料于透析纸中，加10mL透析剂，将透析纸口扎紧，放入盛有100mL水的200mL广口瓶内，加盖，透析2024h得透析液。固体试料：准确吸取10.0mL经上述处理后的试料提取液于透析纸中，以下操作按项下进行。8/16/202238（3）测定取2支50mI带塞比色管，分别加入10mL透析液和10mL标准液，于03冰浴中，加入1mL l0g/L亚硝酸钠溶液，1mL 100g/L硫酸溶液，摇匀后放入冰水中不时摇动，放置1h，取出后加15mL三氯甲烷，置旋涡混合器上振动
29、1min，静置后吸去上层液，再加15mL水，振动1min，静止后吸去上层液，加10mL l00g/L尿素溶液，2mL l00g/L盐酸溶液，再振动5min，静置后吸去上层液，加15mL水，振动lmin，静置后吸去上层液，分别准确吸出5mL三氯甲烷于2支25mL比色管中。另取一支25mL比色管加入5mL三氯甲烷作参比管。于各管中加入15mL甲醇，1mL 10gL磺胺，置冰水中15min，取出回复常温后加入1mL 1g/L盐酸萘乙二胺溶液，加甲醇至刻度，在1530下放置2030min，用1cm比色杯于波长550nm处测定吸光度，测得吸光度A及As。另取2支50mL带塞比色管，分别加入10mL水和1
30、0mL透析液，除不加10gL亚硝酸钠外，其他按项下进行，测得吸光度As0及A0。8/16/2022395计算 C A-A0 100+10 1 1000 X=m As-As0 V 1000 1000 式中：X样品中环己基氨基磺酸钠的含量，gkg；m样品质量，g；V透析液用量，mL；C标准管浓度，gmL；As标准液吸光度；As0水的吸光度；A试料透析液吸光度；A0不加亚硝酸钠的试料透析液吸光度。两次平行测定相对允许误差绝对值10，平行测定结果用算术平均值表示，保留二位小数。8/16/202240食品中天门冬酰苯丙氨酸甲酯的测定 目前无测定食品中天门冬酰苯丙氨酸甲酯的标准方法。但有高效液相色谱法测定
31、饮料中天门冬酰苯丙氨酸甲酯的报导。1原理 样品经加温除去二氧化碳，经微孔滤膜过滤后直接注入高效液相色谱仪，经反相色谱分离后，根据保留时间和蜂面积进行定性定量。2试剂(1)甲醇。(2)氢氧化铵。(3)天门冬酰苯丙氨酸甲酯。(4)天门冬酰苯丙氨酸甲酯标准溶液：称取天门冬酰苯丙氨酸甲酯0.0250g，用移动相溶解并稀释至50mL，混匀后，通过0.45m微孔滤膜脱气。8/16/2022413仪器岛津LC-4A高效液相色谱仪紫外检测器、超声波清洗器等。4操作方法 (1)样品处理：饮料先微温赶气，然后经过0.45m的微孔滤膜过滤。(2)样品测定 a色谱条件：流动相：甲醇200mL+水250mL+氨(1+9
32、9)0.7mL+硫酸(1+4)l mL，调混合液pH为44.5，使用前通过0.45m微孔滤膜脱气或超声脱气。流速：1mLmin，色谱柱：EorbaxC18，4.6mm250mm，粒度为10m。检测器：214nm；灵敏度：0.08AUFS。柱温：408/16/202242b制备标准曲线：分别进天门冬酰苯丙氨酸甲酯标准液2,4,10,20L(即相当于天门冬酰苯丙氨酸甲酯1,2,5,10g)，每个浓度连续测定3次，取其峰面积平均值。以峰面积为纵坐标、天门冬酰苯丙氨酸甲酯量(g)为横坐标作曲线。c样品进样20L，与标准同样条件进行测定，测得样品中天门冬酰苯丙氨酸甲酯的峰面积，然后从标准曲线上查得测定液
33、中所含天门冬酰苯丙氨酸甲酯的量。5计算 A10001000 X=V10001000 式中：X每升饮料中含有天门冬酰苯丙氨酸甲酯量,g/L；A由标准曲线查得的测定液中相当于天门冬酰-苯丙氨酸甲酯量，g；V测定时进样的体积，L。8/16/202243第三节 防腐剂的测定 防腐剂是能防止由微生物作用引起食品腐败变质、延长食品保存期的一种食品添加剂，它还有防止食物中毒的作用。在GB2760中允许使用的防腐剂适用范围一般只限于蛋白质含量较低有食品。我国允许使用的防腐剂品种分为无机防腐剂和有机防腐剂两类，有机防腐剂主要有苯甲酸（及其钠盐）、山梨酸（及其钾盐）、对羟基苯甲酸丙酯、乳酸及醋酸、脱氢乙酸和乙酸衍
34、生物、丙酸、2-（4-噻唑）-苯并咪唑（TBZ）、低级脂肪酸甘油酯、氨基酸、维生素等，无机防腐剂主要有硝酸盐和亚硝酸盐、亚硫酸及其盐类、游离氯与次氯酸盐、二氧化碳等。8/16/202244 允许使用的防腐剂中使用其钠盐或钾盐的主要原因一般是为了提高其溶解度。这些防腐剂的毒性都较低，苯甲酸、山梨酸等由于代谢过程参与体内现有的代谢渠道，因此毒性很低。有些防腐剂还有其它用途，如亚硫酸及其盐类常用作漂白剂；硝酸盐与亚硝酸盐主要用作肉类制品腌制时的发色剂，国外使用山梨酸、山梨酸钾代替发色剂亚硝酸盐，既防止肉毒梭菌芽孢的发育又降低亚硝酸盐的含量。8/16/202245一、主要防腐剂的性质与毒性 苯甲酸及其
35、钠盐（Benzoic acid&sodium salt）是我国及其世界各国最普遍使用的防腐剂之一。具有成本低廉、供应充足、毒性较低的优点。在酸性（pH4）食品中作用效果较好。苯甲酸为白色叶状或针状结晶，溶点122.4，化学性质较为稳定。微带安息香及苯甲醛气味，无臭味，在空气中微有挥发性，水溶液呈酸性，由于其在在水中溶解度较低，实际生产中多用其钠盐。苯甲酸钠使用量超过0.1%时可尝出其味道。苯甲酸对大白鼠LD50为2700mg/kg（经口服）。以1%浓度加入饲料中饲喂大鼠，对生长、生殖无不良影响。人体每日体内可合成0.7-1.7克苯甲酸，并与甘氨酸结合转为马尿酸，由体内排出。WHO规定人体每日允
36、许摄入量（ADI,acceptable daily intake）为5mg/kg体重。8/16/202246山梨酸及其钾盐（Sorbic acid&sorbate potassium）也是世界各国最普遍使用的防腐剂。山梨酸（结构式为CH3CH=CHCH=CHCOOH）的化学名称为已二烯-（2，4）-酸，是一种不饱和脂肪酸，为无色针状结晶或白色结晶粉末，无臭味，稍有刺激性，溶于水及乙醇等有机试剂，对光、热稳定。钾盐为白色或淡黄色鳞片状结晶，易溶于水、乙醇，空气中吸湿易氧化分解。山梨酸在机体可正常参加代谢，最后分解成二氧化碳和水，几乎无毒，因此山梨酸和山梨酸钾是迄今为止毒性最低的防腐剂。毒理学试验
37、表明，山梨酸对大白鼠LD50为7400-10500mg/kg（经口服）。以5%浓度加入饲料中饲喂大鼠，对生长、生殖、存活率、消化等无不良影响。WHO建议人体每日允许摄入量为25mg/kg体重。8/16/202247对羟基苯酸酯类（ethye P-hy-droxybenzoate）包括其乙酯、丙酯和丁酯，以及对羟基苯甲酸异丁酯、异丙酯。对羟基苯甲酸乙酯（又名尼泊金乙酯，分子式为C9H10O3）的结构式为：纯品为无色或白色结晶粉末，无臭或有轻微的特殊香气，味微苦，灼麻。对光、热稳定，无吸湿性，微溶于水，溶于乙醇等溶剂。对羟基苯甲酸丙酯（又名尼泊金丙酯，分子式为C10H12O3）纯品性质与对羟基苯甲
38、酸乙酯相似。对羟基苯甲酸酯类的抗菌作用比苯甲酸和山梨酸强，对细菌特别是革兰氏阴性菌效果较差，但比苯甲酸效果好，适用的pH范围为4-8。其作用主要在于抑制微生物细胞的呼吸酶系和电子传递酶系的活性，以及破坏微生物的细胞膜结构。其ADI为10mg/kg。8/16/202248HOCOOC2H5丙酸（CH3CH2COOH）及丙酸盐（CH3CH2COONa）也是酸型防腐剂，其对霉菌、好气芽胞产生菌、革兰氏阴性菌有效。对酵母无效，特别是对使面包生成丝状粘质的细菌有效，其毒性极低，可认为是食品的正常成分，是各国广泛用于面包、糕点及发酵制品的防霉防腐剂。在防霉的同时也可防止产生黄曲霉毒素。另外，因毒性较高等原
39、因，我国禁止使用甲醛、硼酸、硼砂、水杨酸、-萘酚等防腐剂。8/16/202249二、食品防腐剂使用量标准（一）我国食品防腐剂使用量标准（GB2760-1996）8/16/202250名称使用范围最大使用量（g/kg)备注苯甲酸、苯甲酸钠酱油、醋、果汁（味）型饮料、果酱（不包含罐头）1.0苯甲酸和苯甲酸钠同时使用时，以苯甲酸计，不得超过最大允许使用量；以苯甲酸计，塑料桶装浓缩果蔬汁不得超过2g/kg葡萄酒、果子酒、琼脂软糖0.8碳酸饮料0.2低盐酱菜、酱类、蜜饯0.5食品工业用塑料桶装浓缩果蔬汁2.0山梨酸、山梨酸钾酱油、食醋、果酱、氢化植物油、软糖、鱼干制品、即食豆制食品、糕点、馅、面包、蛋糕
40、、月饼、即食海蜇、乳酸菌饮料1.0以山梨酸计，食品工业用塑料桶装浓缩果蔬汁不得超过2g/kg；山梨酸和山梨酸钾同时使用时，以山梨酸计，不得超过最大允许使用量低盐酱菜、酱类、蜜饯、果汁（味）型饮料、果冻、胶原蛋白肠衣0.5葡萄酒、果酒0.6果、蔬保鲜、碳酸饮料0.2肉、鱼、蛋、禽制品0.075食品工业用塑料桶装浓缩果蔬汁2.08/16/202251名称使用范围最 大 使用量（g/kg)备注对羟基苯甲酸乙酯对羟基苯甲酸丙酯酱油、酱料、果汁（味）型饮料、果酱（不包含罐头）0.25以对羟基苯甲酸计对于糕点馅，为单一或混合总量食醋0.10糕点0.5果蔬保鲜0.012碳酸饮料、蛋黄馅0.20丙酸钙面包、醋
41、、酱油、糕点、豆制食品2.5以丙酸计。生面制品指切面、馄钝皮生面湿制品0.25丙酸钠糕点2.5应 用 时 使 用3%5%的水溶液，加工前必须洗净杨梅罐头加工50对羟基苯甲酸乙酯酱油0.25 醋0.10 脱氢乙酸腐乳、酱菜、原汁桔浆0.30（二）WHO允许摄入防腐剂的ADI值 8/16/202252名称ADI，mg/kg体重苯甲酸山梨酸对羟基苯甲酸乙酯对羟基苯甲酸丙酯丙酸钙、丙酸钠05025010010不作规定食品中苯甲酸、山梨酸及其盐的测定 苯甲酸、山梨酸及其盐的分析方法主要有。GB/T5009.29-1996规定的方法主要是采用气相色谱法、薄层色谱法、高效液相色谱法。滴定法用于测定山梨酸、苯
42、甲酸及其盐时，采用酸碱中和滴定原理，样品中加入氯化钠饱和溶液，在酸性条件下用乙醚提取，回收乙醚后用中性乙醇溶解，然后用碱标准溶液滴定；样品中山梨酸、苯甲酸经分离、提取、纯化后，也可利用其化学结构特性采用紫外吸收光谱法进行测定。8/16/202253（一）气相色谱分析法 本方法适用于果汁、果酱、酱油、醋中苯甲酸（钠）、山梨酸（钾）的测定，方法简便、快速，是目前应用较多的方法。1 原理 样品经盐酸酸化，以乙醚提取并浓缩，用石油醚：乙醚混合溶液定容，通过附氢火焰离子化检测器的气相色谱仪进行分离测定，与标准系列比较进行定量。2 试剂 （1）乙醚：不含过氧化物 （2）石油醚：沸程30-60 （3）盐酸
43、（4）无水硫酸钠 （5）盐酸（1+1）（6）氯化钠酸性溶液（40g/L）（7）山梨酸、苯甲酸混合标准溶液：准确称取山梨酸、苯甲酸各0.2000g置于100mL容量瓶中，用石油醚-乙醚（3+1）混合溶剂溶解后并稀释刻度。此溶液每毫升相当于2.0mL山梨酸和苯甲酸。（8）山梨酸、苯甲酸标准使用液：吸取适量的山梨酸、苯甲酸标准溶液，以石油醚-乙醚（3+1）混合溶剂稀释至每毫升相当于50,100,150,200,250mg山梨酸或苯甲酸。8/16/202254 3 仪器 气相色谱仪附氢火焰离子化检测器 4 分析步骤 （1）样品提取 称取2.50g预先混合均匀的样品，置于25mL带塞量筒中，加0.5mL
44、盐酸（1+1）酸化，用15mL,10mL乙醚提取两次，每次振摇1min，将上层乙醚提取液吸入另一带塞量筒中。合并乙醚提取液用3mL氯化钠酸性溶液洗涤两次，静止15min，用滴管将乙醚层通过无水硫酸钠滤入25mL容量瓶中。加乙醚至刻度，混匀。准确吸取5mL乙醚提取液于5mL带塞试管中，置40水浴上挥干，加入2mL 石油醚-乙醚（3+1）混合溶剂溶解残渣打，备用。8/16/202255 （2）色谱参考条件 色谱柱：3mm2m 玻璃柱，内填充5%DEGS+1%磷酸/Chromosorb W,AW,DMCS,60目。检测器：氢火焰离子化检测器 温度：柱温 170；进样品温度 230；检测器温度 230
45、 气体流速：载气（氮气）50mL/min,氢气 0.9kg/cm2，空气 1.3kg/cm2（气体比例按各仪器型号不同选择各自的最佳比例条件）（3）测定 进样2L标准系列中各浓度标准使用液于气相色谱仪中，测定各浓度山梨酸、苯甲酸的峰高，以浓度为横坐标，相应的峰高为纵坐标，绘制标准曲线。同时进样2L样品溶液。测得峰高与标准曲线比较定量。8/16/2022568/16/2022575 计算 式中：X1 样品中山梨酸或苯甲酸的含量，g/kg；m1 测定用样品液中山梨酸或苯甲酸的质量，g；V1 加入石油醚-乙醚（3+1）混合溶剂的体积，mL V2 测定时进样的体积，mL m2 样品的质量，g；5 测定
46、时吸取乙醚提取液的体积，mL 25 样品乙醚提取液的总体积，mL 由测得苯甲酸的量乘以1.18，即为样品中苯甲酸钠的含量。测定结果取算术平均值的二位有效数字，允许相对相差10%8/16/202258（二）高效液相色谱法 1 原理 样品加温除去二氧化碳和乙醇，调节pH至中性，过滤后进高效液相色谱仪，经反相色谱分离后，根据保留时间和峰面积进行定性和定量分析。2 试剂 本方法中所用试剂，除另有规定外，均为分析试剂，水为蒸馏水或同等纯度水，溶液为水溶液。（1）甲醇：经滤膜（FH0.5m）过滤 （2）稀氨水（1+1）：氨水加水等体积混合。（3）乙酸铵溶液（0.02mol/L）：称取1.54g乙酸铵，加水
47、至1000mL，溶解，经滤膜（HA0.45m）过滤。（4）碳酸氢钠溶液（20g/L）：称取2g碳酸氢钠（优级纯），加水至100mL，振摇溶解。8/16/202259（5）苯甲酸标准贮备液：准确称取0.1000g苯甲酸，加碳酸氢钠溶液5mL，加热溶解，移入100mL容量瓶中，加水定容至100mL，此溶液每毫升含苯甲酸1mg。（6）山梨酸标准贮备液：准确称取0.1000g山梨酸，加碳酸氢钠溶液5mL，加热溶解，移入100mL容量瓶中，加水定容至100mL，此溶液每毫升含山梨酸1mg。（7）苯甲酸、山梨酸混合标准使用液：取苯甲酸、山梨酸标准贮备液各10.0mL，放入100mL容量瓶中，加水至刻度。此
48、溶液每毫升含苯甲酸、山梨酸各0.1mg。经滤膜（HA0.45m）过滤后备用（同时测定糖精钠时可加糖精钠标准液）。3 仪器 高效液相色谱仪（带紫外检测器）8/16/2022604 分析步骤 （1）样品处理 汽水：称取5.0010.0g样品，放入小烧杯中，微温搅拌除去二氧化碳，用氨水（1+1）调pH至7左右。加水定容至1-20mL,经滤膜（HA0.45m）过滤。果汁类：称取5.00-10.0g样品，用氨水（1+1）调pH至约7，加水定容光焕发至适当体积，离心沉淀，上清液经滤膜（HA0.45m）过滤。配制酒类：称取10.0g样品，放入小烧杯内，水浴加热除去乙醇，用氨水（1+1）调pH至约7，加水定容
49、光焕发至适当体积，上清液经滤膜（HA0.45m）过滤。8/16/202261（2）高效液相色谱参考条件：流动相：甲醇：0.02mol/l乙酸铵溶液（5：95）或磷酸氢二钾和磷二氢钾各30克以水溶解并定容到1000mL，流速1mL/min 色谱柱：4.6mm25cm不锈钢柱，10m的YWG-C18固定相 紫外检测器：230nm 进样量：10L （3）测定 分别进标准溶液和样品溶液，绘制色谱图，根据保留时间定性，应用外标法根据峰面积大小定量。8/16/2022625 计算 式中：X1样品中山梨酸或苯甲酸的含量，g/kg；m1进样体积中山梨酸或苯甲酸的质量，mg；V1样品稀释液总体积，mL V2测定
50、时进样的体积，mL m2样品的质量，g；8/16/202263食品中对羟基苯甲酸酯的测定对羟基苯甲酸酯的测定可采用紫外分光光度法、比色法、气相色谱法等。紫外吸收法是根据对羟基苯甲酸酯在250nm左右有最大吸收的特点，将样品中的对羟基苯甲酸酯类物质提取、分离后，在紫外吸收分光光度计上测定其特征吸收曲线及最大吸收峰（250nm左右）处的吸光度，与标准比较定量。比色法则是利用对羟基苯甲酸酯类与硝酸汞作用发生颜色反应的特性，将样品中的待测物质经提取、净化后，显色、比色分析。8/16/202264食品中丙酯钠、丙酸钙的测定8/16/202265食品中脱氢乙酸的测定8/16/202266禁用防腐剂的检验（
