1、主要内容n发展概述n质谱法分析原理及过程n质谱仪的组成nLC-MS联用技术nLC-MS分析条件的选择和优化n液质联用技术的应用发展概述 Thomson J.J 于1906年发明质谱，到 20世纪 20年代质谱才逐渐被化学家以一种分析手段采用。早期的质谱仪主要用来进行同位素测定和无机元素分析，40年代以后质谱开始广泛应用于有机化合物的结构鉴定，直到 80年代，有机质谱及质谱联用分析技术得到了飞速的发展。相继发明了快原子轰击、电喷雾电离、大气压化学电离和基质辅助激光解吸电离 等软电离技术，能用于分析高极性、难挥发和热不稳定样品，使质谱的应用扩大到生物大分子的领域。质谱分析的原理 质谱仪是一种测量带
2、电粒子质合比的装置，利用带电粒子在电场和磁场中运动（偏转、漂移、震荡）行为进行分离与测量。在离子源中样品分子被电离和解离，得到分子离子和碎片离子，将分子离子和碎片离子引入到一个强的电场中，使之加速，加速电位通常用到6-8kV,此时所有带单位正电荷的离子获得的动能都一样，即 eV=mv2/2 但是，不同质荷比的离子具有不同的速度，利用离子的不同质荷比及其速度差异，质量分析器可将其分离，然后由检测器测量其强度。记录后获得一张以质荷比（m/z）为横坐标，以相对强度为纵坐标的质谱图。质谱分析过程质谱分析过程可以分为四个基本环节：1.通过合适的进样装置将样品引入并进行气化2.气化后的样品引入到离子源进行
3、电离，即离子化过程3.电离后的离子经过适当的加速后进入质量分析器，按不同的质荷比进行分离4.经检测、记录，获得一张谱图上述过程可归纳在图1中。质谱仪的组成 典型的质谱仪一般由进样系统、离子源、分析器、检测器和记录系统等不分组成，此外，还包括真空系统和自动控制数据处理等辅助设备。下图为单聚焦质谱仪的示意图真空系统真空系统 质谱仪的离子源、质量分析器和检测器必须在高真空状态下工作，以减少本底的干扰，避免发生不必要的离子-分子反应。所以质谱反应属于单分子分解反应。利用这个特点，我们用液质联用的软电离方式可以得到化合物的准分子离子，从而得到分子量。由机械真空泵(前极低真空泵)，扩散泵或分子泵(高真空泵
4、)组成真空机组，抽取离子源和分析器部分的真空。只有在足够高的真空下，离子才能从离子源到达接收器，真空度不够则灵敏度低。进样系统进样系统 把分析样品导入离子源的装置，包括：直接进样，GC，LC及接口，加热进样，参考物进样等。离子源离子源 使被分析样品的原子或分子离化为带电粒子(离子)的装置，并对离子进行加速使其进入分析器，根据离子化方式的不同，有机质谱中常用的有如下几种，其中EI，ESI最常用。EI(Electron Impact Ionization):电子轰击电离硬电离。CI(Chemical Ionization):化学电离核心是质子转移。FD(Field Desorption):场解吸目
5、前基本被FAB取代。FAB(Fast Atom Bombardment):快原子轰击或者铯离子(LSIMS,液体二次离子质谱)。ESI(Electrospray Ionization):电喷雾电离属最软的电离方式。适宜极性分子的分析，能分析小分子及大分子(如蛋白质分子多肽等)APCI(Atmospheric Pressure Chemical Ionization):大气压化学电离同上，更适宜做弱极性小分子。APPI(Atmospheric Pressure PhotoSpray Ionization):大气压光喷雾电离同上，更适宜做非极性分子。MALDI(Matrix Assisted La
6、ser Desorption):基体辅助激光解吸电离。通常用于飞行时间质谱和FT-MS，特别适合蛋白质，多肽等大分子其中ESI，APCI，APPI统称大气压电离(API)软电离技术 20世纪 80年代中期出现的两种新的电离技术:电喷雾电离(ESI)和基质辅助激光解吸电离(MALD I)，这两种技术具有高灵敏和高质量检测范围,能在飞摩(10-15)乃至阿摩(10-18)水平检测相对分子量高达几十万的生物大分子。目前，这两种技术广泛用于生物学、生物医学、生物化学等科学领域的研究。1.电喷雾离子化质谱技术(ES I)ESI的工作原理：利用位于一根毛细管和质谱进口间的电势差生成离子，在电场的作用下产生
7、一喷雾形式存在的带电液滴。在迎面吹来的热气流的作用下，液滴表面溶剂蒸发,液滴变小，液滴的电荷密度骤增。当静电排斥力等于液滴的表面张力时，液滴便发生崩解，形成更小的液滴。如此形成的小液滴以类似的方式继续崩解，于是液滴中的溶剂迅速蒸干，产生多电荷正离子，在质谱仪内被分析纪录。电喷雾电离的特征之一是可生成高度带电的离子而不发生破裂，这样可将质荷比降低到各种不同类型的质量分析仪都能检测的程度。电喷雾通常应用于 FT2 MS。Little等利用FT2 MS对一个 50链寡聚糖核苷酸得到了优于10 g/g的质量测定准确度;对一个 100链寡聚核苷酸,质量准确度优于 30 g/g。测定的寡聚物的分子量可用于
8、顺序确证,也可与气相裂解结合来进行序列测定。Chen R等用 FT2I CR2 MS来捕获和检测质量超过108D的单个 DNA离子。ESI的优点是:解决了极性大、热不稳定的蛋白质与多肽分子的离子化和大分子质量、一级结构和共价修饰位点的测定问题,并可用于研究DNA与药物、金属离子、蛋白质和抗原与抗体的相互作用。但是样品中的盐类对样品结果影响很大,而且单个分子带电荷不同可形成多种离子分子峰(重叠峰),所以对混合物的图谱解析比较困难。基质辅助激光解吸电离技术(MALD I)是用小分子有机物作为基质,样品与基质的分子数比例为 1:(100 50000),均匀混合后,在空气中自然干燥后送入离子源内。混合
9、物在真空下受激光辐照,基质吸收激光能量,并转变为基质的电子激发能,瞬间使基质由固态转变为气态,形成基质离子。而中性样品与基质离子、质子及金属阳离子之间的碰撞过程中,发生了样品的离子化,从而产生质子化分子、阳离子化分子或多电荷离子或多聚体离子。常用的是基质辅助激光解吸离子-飞行时间-质谱。目前还有更新的串联飞行时间质谱技术。Cri mmins等用 MALD I-T OF MS分析通过二硫键键合的异二肽,得到了二肽及每个单体肽组分的质量。结论是 MALD I-T OF MS中的碎裂过程与氨基酸胱氨酸水溶液的光引发均裂有相似之处。提供了一种指认蛋白中二硫键的简便方法。此方法还适用于对单核细胞进行直接
10、的化学分析。MALD I的特点是准分子离子峰很强,几乎无碎片离子,因此可直接分析蛋白质酶解后产生的多肽混合物。另一个特点是对样品中杂质的耐受量较大,当用液体色谱分离蛋白质是,往往把盐留在样品中,若这些盐的量在基质的 5%以下,可不影响蛋白质离子的发射,因而往往可省去脱盐的步骤,大大缩短分析时间。2.基质辅助激光解吸电离技术(MALD I)质量分析器质量分析器 是质谱仪中将离子按质荷比分开的部分,离子通过分析器后,按不同质荷比(M/Z)分开,将相同的M/Z离子聚焦在一起,组成质谱。质量分析器的分类：质量分析器的分类：双聚焦扇形磁场-电场串联仪器(sector).四极杆质谱仪(Q).飞行时间质谱仪
11、(TOF).离子阱质谱仪（TRAP）傅里叶变换-离子回旋共振质谱仪(FT-ICRMS).四极+TOF（Q-TOF）串列式多级质谱仪 三重四极（QqQ）(MS/MS)TOF+TOF检测接收器 接收离子束流的装置有：电子倍增器、光电倍增器、微通道板将接收来的电信号放大、处理并给出分析结果及控制质谱仪个部分工作。从几伏低压到几千伏高压。数据及供电系统色谱质谱联用简介 色谱质谱的在线联用将色谱的分离能力与质谱的定性功能结合起来，实现对复杂混合物更准确的定量和定性分析。而且也简化了样品的前处理过程，使样品分析更简便。色谱质谱联用包括气相色谱质谱联用(GC-MS)和液相色谱质谱联用(LC-MS)，液质联用
12、与气质联用互为补充，分析不同性质的化合物。液质联用与气质联用的区别 气质联用仪(GC-MS)是最早商品化的联用仪器，适宜分析小分子、易挥发、热稳定、能气化的化合物；用电子轰击方式（EI）得到的谱图，可与标准谱库对比。液质联用(LC-MS)主要可解决如下几方面的问题：不挥发性化合物分析测定；极性化合物的分析测定；热不稳定化合物的分析测定；大分子量化合物（包括蛋白、多肽、多聚物等）的分析测定；没有商品化的谱库可对比查询，只能自己建库或自己解析谱图。LC-MS联用技术的发展 质谱法可以有效地定性分析化合物,但对于有机混合物的分析就无能为力了。而色谱法对有机化合物是一种有效的分离和分析方法,特别适合进
13、行有机化合物的定量分析,但定性分析比较困难。因此两者的有效结合必将为化学家及生物化学家提供一个进行复杂化合物高效的定性定量工具。色谱与质谱的联用技术主要有气相色谱-质谱法、液相色谱-质谱法 。GC-MS技术已经成为一种成熟的分析方法应用于很多领域。但是在 1000多万种已经登录的有机化合物中大概只有不到20%可以直接采用GC-MS进行分析。事实上在理化物证分析领域内对炸药、染料、塑料等的分析也遇到类似的情况。即使采用高的气化温度、短的停留时间有时还不能奏效。液相色谱液相色谱-质谱仪质谱仪 高效液相液质联用(HPLC/MS)是指高效液相液相色谱与质谱串联的技术。HPLC-MS主要由HPLC仪、接
14、口离子源(HPLC与MS之间的连接装置)、质量分析器、真空系统和计算机数据处理系统组成。混合样品通过液相色谱系统进样，由色谱柱分离，从色谱仪流出的被分离组分依次通过接口进入MS仪的离子源处并被离子化,然后离子被聚焦于质量分析器中，根据质荷比而分离，分离后的离子信号被转变为电信号，传送至计算机数据处理系统，根据MS峰的强度和位置对样品的成分和结构进行分析。目前常用的HPLC-MS联用仪具有两大分类系统，一种是从MS的离子源角度来划分,包括电喷雾离子(ESI)、大气压化学电离(APCI)和基质辅助激光解吸离子化(MALDI)等；另一种是从MS的质量分析器角度来划分，包括四级杆质谱仪(Q-MS)、离
15、子阱质谱仪(IT-MS)、飞行时间质谱仪(TOF-MS)、傅立叶变换质谱仪(FT-MS)。自1968年发表第一篇HPLC和MS在线联用的实验报告至90年代初形成的5种接口类型的商品仪器,经历了30年。LC-MS经历了一个漫长的研究过程,主要是为了解决真空技术和性能优越的接口技术。为解决质谱分析所必须的真空度,LC-MS一般都采用分段、多级抽真空的方法。与GC-MS联用相比,接口问题的解决过程是艰巨的。主要原因来自两方面:一是真空;二是样品性质。也就是说质谱仪的高真空系统不适应 HPLC的流出液体；强极性、难汽化和热不稳定的样品不适应质谱的常规进样和离子化方式。LC-MS在发展的过程中曾出现了很
16、多接口技术,现在在线联用接口汇集成商品化的5种接口为传送带(MB)、流动快原子轰击(CFFAB)、粒子束(PB)、热喷雾(TSP)以及大气压电离(API)。其中API技术尽管不能全部代替其他4种接口,但它的出现使HPLC方法可以对强极性、高熔点、低挥发性和热不稳定性样品进行分析,因此逐渐受到法庭科学工作者的青睐。API技术分为电喷雾电离(ESI)、大气压化学电离(APCI),目前商业化的LC-MS绝大多数使用这两种接口,下面简单介绍这两种接口的特点。1.电喷雾电离(ESI)ESI是高电压加在毛细管喷口上,通过电动喷雾,雾化的液滴经去溶剂化最终成为样品的准分子离子,电喷雾由此而得名。ESI有正离
17、子化和负离子化两种模式可供选择,碱性样品一般选择正离子化模式,酸性样品一般选择负离子化模式。具有离子化效率高、灵敏度高、分析范围广等优点。它可以形成多电荷离子分析大分子如多肽、蛋白质等,也可形成单电荷离子分析较小分子量(1000amu)的极性化合物,如小分子药物及其代谢物,用于农药及化工产品的中间体和杂质的鉴定。2.大气压化学电离(APCI)APCI是样品进入气相后依赖电晕放电发生离子化。被分析物随溶液一起通过不锈钢探针,同时被加热气化,其溶胶进入离子源,借助电晕放电而带电,随后分子、离子之间进行电荷转移(化学反应)使被反应物带电与GC-MS不同的是并不需要反应气。与ESI相比,所要求的液相色
18、谱流动相流速可在0.2ml/min-2ml/min,这样对于选择色谱柱和优化色谱条件十分方便,而要求流动相流速控制在1.0ml/min以下。但是APCI不能形成多电子离子,这使得它的质量分析范围没有ESI广,有些化合物使用两种接口技术均可进行分析,一般极性低的化合物多使用接口APCI,APCI的灵敏度较ESI好。1.接口的选择：ESI适合于中等极性到强极性的化合物分子，特别是那些在溶液中能预先形成离子的化合物和可以获得多个质子的大分子（如蛋白质）APCI不适合可带多个电荷的大分子，其优势在于弱极性或中等极性的小分子的分析。LC-MS分析条件的选择和优化各种接口的应用范围IonSprayAPCI
19、GC/MS电喷雾LC-MS热喷雾和常压化学离子化LC-MS待测物极性几种API接口示意图2.正、负离子模式的选择：选择的一般原则为：正离子模式：正离子模式：适合于碱性样品，可用乙酸或甲酸对样品加以酸化。样品中含有仲氨或叔氨时可优先考虑使用正离子模式。负离子模式：负离子模式：适合于酸性样品，可用氨水或三乙胺对样品进行碱化。样品中含有较多的强伏电性基团，如含氯、含溴和多个羟基时可尝试使用负离子模式。3.流动相的选择 常用的流动相为甲醇、乙腈、水和它们不同比例的混合物以及一些易挥发盐的缓冲液，如甲酸铵、乙酸铵等，还可以加入易挥发酸碱如甲酸、乙酸和氨水等调节pH值。LCMS接口避免进入不挥发的缓冲液，
20、避免含磷和氯的缓冲液，含钠和钾的成分必须lmmol/l。（盐分太高会抑制离子源的信号和堵塞喷雾针及污染仪器）含甲酸（或乙酸）2。含三氟乙酸0.5。含三乙胺l。含醋酸铵10一5 mmol/l。送样前一定要摸好LC条件，能够基本分离，缓冲体系符合MS要求。4.流量和色谱柱的选择 不加热ESI的最佳流速是150ulmin，应用4.6 mm内径LC柱时要求柱后分流，目前大多采用 l2.1 mm内径的微柱，TIS源最高允许lmlmin，建议使用200400ulmin APCI的最佳流速lmlmin，常规的直径4.6mm柱最合适。为了提高分析效率，常采用 100 mm的短柱（此时UV图上并不能获得完全分离
21、，由于质谱定量分析时使用MRM的功能，所以不要求各组分没有完全分离）。这对于大批量定量分析可以节省大量的时间。5.辅助气体流量和温度的选择 雾化气对流出液形成喷雾有影响，干燥气影响喷雾去溶剂效果，碰撞气影响二级质谱的产生。操作中温度的选择和优化主要是指接口的干燥气体而言，一般情况下选择干燥气温度高于分析物的沸点20 左右即可。对热不稳定性化合物，要选用更低的温度以避免显著的分解。选用干燥气温度和流量大小时还要考虑流动相的组成，有机溶剂比例高时可采用适当低的温度和流量小一点的。LC-MS技术的应用 目前飞速发展的质谱联用技术已成为一种常规的应用技术。世界各国的科学技术以日新月异的速度飞速发展,新
22、技术的产生、仪器设备的更新非常快。在国内,质谱联用技术主要用于药动学和代谢研究等药学领域。而国外在过去几十年里,由于接口技术的发展使质谱的应用逐渐扩展到生物大分子、环境卫生等生命科学领域,促进了相关学科的发展。以大气压电离为接口的LC-MS技术已经在药物、化工、临床医学、分子生物学等许多领域中获得广泛的应用。具体应用领域 医药学：药物代谢、药物动力学、杂质分析、天然产物分析 生物化学：肽、蛋白质、寡核苷酸、糖 环境化学：农药和农残分析、有机污染物、土壤/食品/水分析 临床医学：新生儿检查、糖化血红蛋白（糖尿病）、血红蛋白变异、胆酸 食品科学：香料、添加物、包装物、蛋白质、致癌物 法医学：滥用药
23、物、爆炸物、兴奋剂检测 兽医学：兴奋剂、磺胺类药物、抗体 合成化学：有机金属化合物、有机合成物 有机化学：表面活性剂、染料药物代谢研究药物代谢研究 药物代谢与药物动力学研究技术上的最新重大进展是LC-MS-MS的使用，电喷雾（ESI）和大气压化学电离（APCI）以及大气压光电离（APPI）是其主要的离子源，由于具有高灵敏度（ng/mlpg/ml），高选择性（检测特定的碎片离子）、高效率（每天可检测几百个生物样品和对药物结构的广泛适用性，对液态样品和混合样品的分离能力高，可通过二级离子碎片寻找原型药物并推导其结构，LC-ESI-MS-MS已广泛地应用于药物代谢研究中一期生物转化反应和二期结合反应
24、产物的鉴定、复杂生物样品的自动化分析以及代谢物结构阐述等，已在世界上大型制药企业中取代HPLC而占据了主导地位，其测试的样品量占总量的70%以上。天然产物天然药物的研究天然产物天然药物的研究 目前中药开发研究有两条途径。一条途径是从单一植物中提取一种有效成分(单体化合物)或提取物开发成新药。另一途径则是中药复方制剂的开发研究。采用现代多种仪器联用新技术，特别是高效液相色谱/质谱/质谱联用(HPLC-MS/MS)，可对其十几种乃至几十种化学成分进行指纹图谱分离鉴定。再从指纹图谱中选择四、五种指标成分(有效成分或特征成分)进行定量，可以确定出简化的指纹图谱和指标成分，又是最合理的中药复方质量控制的
25、方法，是研究中药复杂体系，尤其是复方的有力工具。国内外很多学者已进行了复方丹参、清开灵、泻心汤、人参或党参制剂等中药中的主要成分的分析。临床诊断和疾病生物标志物的分析临床诊断和疾病生物标志物的分析 欧美等目前已广泛采用HPLC/MS/MS法用于临床诊断以及疾病生物标志物的研究、检测，具有专一性好、灵敏度高、成本低、分析快速，经济效益可观等特点。目前可进行新生儿遗传疾病筛选（PKU、MCAD等四十种左右）、新生儿性激素变异的检测、男女激素的监测、老年痴呆症的早期诊断、抗排异药物的检测、磷酸脂的检测、血红蛋白变异检测、糖化血红蛋白（糖尿病早期检测）、某些心脏病、癌症疾病筛查如乳腺癌等等（Bioma
26、rker法、通过鉴定DNA损伤程度测定）、药物剂量监测、药物相互作用监测、地区性突发性中毒病人的毒物检测等。残留、法医学和环境样品测定残留、法医学和环境样品测定 专家指出，中国入世后，食品工业最大的问题就是安全壁垒，这将给中国的进出口和国内企业带来极大的威胁。美国食品与药品管理局(FDA)、欧盟、日本、韩国等主要贸易国和地区公布了在进口动物源性食品中禁止使用的药物名单，提高了最高限量标准。这就要求中国加强农、畜、水产品中的农药、兽药等残留的控制和检测。同样随着人类对生存环境的倍加关注，要求对环境中各种污染物、有害或有毒物以及法庭科学中毒物、滥用药物等进行更加严格的监控。而配以ESI、APCI和APPI离子化技术的LC/MS/MS以分析速度快、灵敏度高、特异性好等特点广泛应用与残留和毒物分析。目前已成功地进行数百种农药、兽药、抗生素、兴奋剂类残留和毒物、毒素如氯霉素、磺胺类、硝基呋喃类、毒品、多环芳烃等等化合物的检测。
