1、第一节 原核生物与真核生物DNA的复制第1页，共41页。DNARNA蛋白质复制转录翻译逆转录RNA复制第2页，共41页。内容提要：DNA的半保留复制与DNA复制有关的物质 DNA的复制过程（大肠杆菌为例）DNA复制的其它方式真核生物中DNA的复制特点第3页，共41页。1、定义：由亲代DNA生成子代DNA时，每个新形成的子代DNA中，一条链来自亲代DNA，而另一条链则是新合成的，这种复制方式称半保留复制。（一）DNA的半保留复制（semi-conservative replication）第4页，共41页。（二）与DNA复制有关的物质1、原料：四种脱氧核苷三磷酸（dATP、dGTP、dCTP、d
2、TTP)2、模板：以DNA的两条链为模板链，合成子代DNA3、引物：DNA的合成需要一段RNA链作为引物4、引物合成酶（引发酶）：此酶以DNA为模板合成一段RNA,这段RNA作为合成DNA的引物（Primer)。实质是以DNA为模板的RNA聚合酶。第5页，共41页。5、DNA聚合酶:以DNA为模板的DNA合成酶以四种脱氧核苷酸三磷酸为底物反应需要有模板的指导反应需要有3-OH存在DNA链的合成方向为5 3 第6页，共41页。性质 聚合酶聚合酶 聚合酶3 5 外切活性+5 3 外切活性+-5 3 聚合活性+中+很低+很高新生链合成-+主要是对主要是对DNADNA损伤的修复；以损伤的修复；以及在及
3、在DNADNA复制时切除复制时切除RNARNA引物引物并填补其留下的空隙。并填补其留下的空隙。修复紫外光修复紫外光引起的引起的DNADNA损损伤伤DNA DNA 复制的主要复制的主要聚合酶，还具有聚合酶，还具有3 3-5 5 外切酶的校对功能，外切酶的校对功能，提高提高DNADNA复制的保真性复制的保真性原核生物中的DNA聚合酶(大肠杆菌）第7页，共41页。定位 细胞核 细胞核 线粒体 细胞核 细胞核3-5外切 -+酶活性功能引物引物 合成合成修复修复作用作用线粒体线粒体DNADNA的复制的复制核核DNADNA的复制的复制？真核生物中的DNA聚合酶第8页，共41页。6、DNA连接酶（1967年
4、发现）：若双链DNA中一条链有切口，一端是3-OH，另一端是5-磷酸基，连接酶可催化这两端形成磷酸二酯键，而使切口连接。但是它不能将两条游离的DNA单链连接起来 DNADNA连接酶连接酶在在DNADNA复制、损伤修复、重组等过程中起重要作用复制、损伤修复、重组等过程中起重要作用3535OHOHP P第9页，共41页。7、DNA 拓扑异构酶(DNA Topisomerase)：拓扑异构酶：使DNA一条链发生断裂和再连接，作用是松解负超螺旋。主要集中在活性转录区，同转录有关。例：大肠杆菌中的蛋白 拓扑异构酶：该酶能暂时性地切断和重新连接双链DNA，作用是将负超螺旋引入DNA分子。同复制有关。例：大
5、肠杆菌中的DNA旋转酶第10页，共41页。7、DNA 解螺旋酶/解链酶（DNA helicase)通过水解ATP获得能量来解开双链DNA。E.coli中的rep蛋白就是解螺旋酶，还有解螺旋酶I、II、III。reprep蛋白沿蛋白沿3 3 5 5移动，而解螺旋酶移动，而解螺旋酶I I、IIII、IIIIII沿沿5 5 3 3移动。移动。第11页，共41页。第12页，共41页。9、单链结合蛋白单链结合蛋白(SSBP-single-strand binding protein)：稳定已被解开的稳定已被解开的DNA单链，阻止复性和保护单链不被核酸酶单链，阻止复性和保护单链不被核酸酶降解。降解。第13
6、页，共41页。（三）DNA的复制过程（大肠杆菌为例）双链的解开双链的解开 RNARNA引物的合成引物的合成 DNADNA链的延伸链的延伸 切除切除RNARNA引物，填补缺口，连接相邻的引物，填补缺口，连接相邻的DNADNA片段片段第14页，共41页。1 1、双链的解开、双链的解开 DNA的复制有特定的起始位点，叫做复制原点。ori(或o）、富含A、T的区段。基本概念：第15页，共41页。从复制原点到终点，组成一个复制单位，叫从复制原点到终点，组成一个复制单位，叫复制子复制子复制时，解链酶等先将DNA的一段双链解开，形成复制点，这个复制点的形状象一个叉子，故称为复制叉第16页，共41页。复制叉复
7、制叉复制叉复制叉第17页，共41页。复制方向和速度：单单起点、起点、双双向等速向等速多多起点、起点、双双向等速向等速第18页，共41页。双链解开、复制起始第19页，共41页。大约20个DnaA蛋白在ATP的作用下与oriC处的4个9bp保守序列相结合第20页，共41页。2 2、RNARNA引物的合成引物的合成DnaB蛋白活化引物合成酶，引发RNA引物的合成。引物长度约为几个至10个核苷酸，第21页，共41页。DNA的半不连续复制（semi-discontinuous replication)DNA复制时其中一条子链的合成是连续的，而另一条子链的合成是不连续的，故称半不连续复制。在DNA复制时，
8、合成方向与复制叉移动的方向一致并连续合成的链为前导链；合成方向与复制叉移动的方向相反，形成许多不连续的片段，最后再连成一条完整的DNA链为滞后链。3 3、DNADNA链的延伸链的延伸第22页，共41页。在DNA复制过程中，前导链能连续合成，而滞后链只能是断续的合成53 的多个短片段，这些不连续的小片段称为冈崎片段。第23页，共41页。第24页，共41页。4 4、切除、切除RNARNA引物，填补缺口，连接相邻的引物，填补缺口，连接相邻的DNADNA片段片段 （复制终止）（复制终止）在DNA聚合酶催化下切除RNA引物；留下的空隙由DNA聚合酶催化合成一段DNA填补上；在DNA连接酶作用下，连接相邻
9、的DNA链第25页，共41页。双链环状、型复制、双向等速第26页，共41页。（五）真核生物中DNA的复制特点1、真核生物每条染色体上有多个复制起点，多复制子2、真核生物染色体在全部复制完之前,各个起始点不再重新开始DNA复制；而在快速生长的原核生物中，复制起点可以连续开始新的复制(多复制叉)。真核生物快速生长时，往往采用更多的复制起点。3、真核生物有多种DNA聚合酶。第27页，共41页。1 复制概况复制概况 a、多个复制子，双向复制、多个复制子，双向复制 b、复制子相对较小、复制子相对较小(13-900kb),复制速度较慢，大复制速度较慢，大 约约 5005000bp/min（3000bp/m
10、in）冈崎片段冈崎片段100200bpc、复制终止通过复制叉的相遇而终止、复制终止通过复制叉的相遇而终止（五）真核生物中DNA的复制第28页，共41页。d.不同的发育时期，真核的复制起始点和复制不同的发育时期，真核的复制起始点和复制子的大小会变化。子的大小会变化。有些复制起点在不同的发育阶段就不再有些复制起点在不同的发育阶段就不再发挥作用。发挥作用。如果蝇受精后复制原点从五千个上升到如果蝇受精后复制原点从五千个上升到五万个。五万个。发育早期，每个复制子长发育早期，每个复制子长7.9Kb，成体时，每个复制子长成体时，每个复制子长40Kb，很多，很多Ori区不再起作用。区不再起作用。第29页，共4
11、1页。真核生物真核生物DNA聚合酶及有关蛋白聚合酶及有关蛋白 表表 真核生物五种真核生物五种DNADNA聚合酶聚合酶DNADNA聚合酶聚合酶位置位置核核核核核核核核线粒体线粒体功能功能引发引发合成合成修复修复修复修复复制复制相对活性相对活性80%80%10-15%10-15%2-15%2-15%分子量分子量300K300K170-230K170-230K250K250K40K40K180-300K180-300K亚基亚基催化核心（催化核心（180K180K）两个引物酶两个引物酶(60,50K)(60,50K)一个未知一个未知催化核心催化核心(125K)(125K)一个未知一个未知(25K)(2
12、5K)催化核心催化核心一个未知一个未知催化催化催化催化3535外切外切-+-+双脱氧双脱氧T T不影响不影响不影响不影响弱弱抑制抑制抑制抑制蚜黄素蚜黄素抑制抑制抑制抑制抑制抑制不影响不影响不影响不影响第30页，共41页。表表 真核复制需要的酶和蛋白真核复制需要的酶和蛋白蛋白蛋白亚基亚基功能功能DNADNA聚合酶聚合酶/引发酶引发酶4 4引物合成引物合成DNADNA聚合酶聚合酶2 2DNADNA合成合成PCNAPCNA1 1延伸（滑动钳作用）延伸（滑动钳作用）复制因子复制因子RF-C 3 3延伸（载体作用）延伸（载体作用）复制因子复制因子RF-A3 3单链结合单链结合拓扑异构酶拓扑异构酶和和 维
13、持维持DNADNA的拓扑结构的拓扑结构第31页，共41页。2 SV40复制复制 双链环状双链环状DNA，具有核小体，全长，具有核小体，全长5243bp2.1 复制起始区：复制起始区：具有具有2个位点个位点 位点位点2包括以下：包括以下：10bp的前期区，的前期区，27bp的的T抗原结合位点，含抗原结合位点，含GAGGC 17bp的的A-T丰富区。丰富区。第32页，共41页。真核生物真核生物DNA复制叉结构示意图复制叉结构示意图 第33页，共41页。3 酵母的自主复制区酵母的自主复制区 ARS(autonomously replicating sequence)序序列，在酵母染色体复制和质粒复制
14、中均列，在酵母染色体复制和质粒复制中均发发挥复制起点的功能。挥复制起点的功能。第34页，共41页。nA、B起主要作用，起主要作用，C区区作用微弱。作用微弱。ARS1分为分为A,B,C三个功能区：三个功能区：A区区：15bp，其中，其中11个保守，称个保守，称ACS：5ATTTAT（T/C）TTTA 3 有有复制起始子复制起始子的功能。的功能。B区区：约：约80bp,含含B1,B2,B3三个区。三个区。B3：ABF1（ARS-binding factor 1）结合区）结合区ABF1第35页，共41页。4 真核生物真核生物DNA末端的复制末端的复制 (1)端粒端粒DNATTGGGG(T2G4)序列
15、高度重复的末端序列高度重复的末端 5 TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGG 3(富含富含 G 链链)3 AACCCC AACCCC AACCCC 5 (富含富含 C 链链)第36页，共41页。（2）端粒酶：）端粒酶：首先在四膜虫中发现首先在四膜虫中发现 端粒酶端粒酶：特殊的反转录酶，由蛋白质和：特殊的反转录酶，由蛋白质和RNA组成。组成。端粒酶端粒酶以自身携带的以自身携带的150bp的的RNA为模板，在随从链模为模板，在随从链模板板DNA的的3OH末端延长末端延长DNA，再以这种延长的，再以这种延长的DNA为为模板，继续合成随从链。模板，继续合成随从链。第37页，共41页。Grei
16、der和和Blackburn(1989)，1）端粒酶与端粒）端粒酶与端粒DNA结合，端粒结合，端粒酶中的酶中的RNA与凸出的与凸出的3引物配引物配对；对；2）以）以RNA为模板，在为模板，在3端上从头合端上从头合成六个成六个Nt；3）合成一个重复单位后，端粒酶向）合成一个重复单位后，端粒酶向DNA模板新合成的模板新合成的3移动，引物再移动，引物再和模板配对，就这样循环往复，周和模板配对，就这样循环往复，周而复始。而复始。4）最后延伸的）最后延伸的3端再回折，以端再回折，以GG配配对的方式形成发夹结构，产生端对的方式形成发夹结构，产生端粒。粒。结合 5 3dGTP TTGGGGTTGGGGTTG
17、GGGTTG DNA 模板和DNA AACCCCAACCCC AACCCCAAC 引物配对3 5 3 5 聚合5 3 dGTP 以RNA为模板在 TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGG DNA引物3端 AACCCCAACCCC AACCCCAAC 直接加核苷酸 3 5 3 5 延伸 5 3 延着RNA模板 TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTG DNA3延伸 AACCCCAACCCC AACCCCAAC3 5 3 5 移位 酶向引物的新 3端移动5 3 TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTG AACCCCAACCCC AACCCCAAC 3 5 3 5 图
18、11-67 端粒酶复制机制模型(仿Greider and Blackburn:Nature1989,337:331-337)（3）补齐过程补齐过程第38页，共41页。5 TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGG 3 AACCCC GGGGTTGGGG图 11-68 端粒3延伸，末端回折形成发夹结构第39页，共41页。研究表明研究表明：人体细胞通过监测失去的端粒的重复数而：人体细胞通过监测失去的端粒的重复数而计数细胞分裂次数，当端粒长度下降到计数细胞分裂次数，当端粒长度下降到某一临界值某一临界值时，细胞终止分裂衰老、死亡时，细胞终止分裂衰老、死亡 多细胞有机体中多细胞有机体中端粒酶活性受到抑制端粒酶活性受到抑制，导致细胞分，导致细胞分裂过程中染色体逐渐缩短，当端粒缩短到一定程度裂过程中染色体逐渐缩短，当端粒缩短到一定程度时，细胞开始衰老并最终死亡。时，细胞开始衰老并最终死亡。第40页，共41页。科学家们对多莉的染色体做了仔细的研究，发现其染色体末端，即端粒，比同龄的普通绵羊短。科学家认为，端粒是决定细胞老化的主要因素，端粒越短的细胞越接近死亡。研究端粒丢失的速率，预测人类的寿命。研究端粒酶与肿瘤的关系。“多莉多莉”的衰老的衰老 第41页，共41页。
