1、第十章第十章 亲和色谱亲和色谱在众多亲和分离技术中，亲和色谱是应用最多，分离效果最好的技术。第1页，共73页。概述概述p生物分子能够区分结构和性质非常接近的其他分子，选择性地与其中某一种分子相结合，生物分子间的这种特异性相互作用称为亲和作用。p静电作用、氢键等多种作用力对亲和作用具有影响。p生物分子间的亲和识别包括抗体-抗原、酶-底物、激素-受体等亲和作用。第2页，共73页。常见亲合作用体系常见亲合作用体系特异性特异性亲和体系亲和体系高特异性高特异性抗原抗原-单克隆抗体单克隆抗体荷尔蒙受体蛋白荷尔蒙受体蛋白核酸互补碱基链段、核酸结合蛋核酸互补碱基链段、核酸结合蛋白白酶底物、产物、抑制剂酶底物、
2、产物、抑制剂群特异性群特异性免疫球蛋白免疫球蛋白A蛋白、蛋白、G蛋白蛋白酶辅酶酶辅酶凝集素糖、糖蛋白、细胞、细胞凝集素糖、糖蛋白、细胞、细胞表面受体表面受体酶、蛋白质酶、蛋白质-肝素肝素酶、蛋白质酶、蛋白质-活性色素（染料）活性色素（染料）酶、蛋白质酶、蛋白质-过渡金属离子（铜、锌过渡金属离子（铜、锌等）等）酶、蛋白质氨基酸（组氨酸等）酶、蛋白质氨基酸（组氨酸等）第3页，共73页。第4页，共73页。1、离子强度：一般来说，提高离子强度，亲和作用减弱或完成破坏。2、PH：在适当的PH下，亲和结合作用较高，在其它PH下，亲和作用减弱或完成破坏。3、抑制氢键形成的物质：脲和盐酸胍的存在可减弱亲和作用
3、4、温度：提高温度，静电作用、氢键、配位键减弱；但是，疏水性相互作用增强5、液体离子：SCN-、I-、CIO4-的存在，疏水性相互作用减弱6、螯合剂：影响配位键，使亲和作用消失影响亲和作用的因素影响亲和作用的因素第5页，共73页。p利用生物分子之间的专一性识别或特定的相互作用进行分离的技术为亲和分离技术p亲和配基是对生物分子具有专一性识别或特定的相互作用的物质第6页，共73页。7p找与底物专一可逆结合的配基；p将配基通过共价键偶联到基质；p配基与底物吸附；p洗脱目标物。第7页，共73页。8亲和纯化技术亲和纯化技术p亲和层析(Affinity chromatography)p亲和过滤（膜分离）p
4、亲和分配（双水相萃取）p亲和反胶团萃取（反胶团萃取）p亲和沉淀（沉淀）p亲和电泳（电泳）第8页，共73页。第9页，共73页。配基配基p生物特异性配基p拟生物亲和配基p亲和配基必须具备的条件：1、专一性识别或特异性作用必须是可逆的2、结合常数要适当3、稳定性好，可进行化学改性第10页，共73页。p专一性和特异性决定着分离纯化的产品纯度p相互作用的强弱决定着吸附和解吸的难易程度第11页，共73页。亲和配基的分类亲和配基的分类p单专一性的小分子配基p基团专一性的小分子亲和配基p专一性的大分子亲和配基p免疫亲和配基p基团专一性的大分子亲和配基第12页，共73页。亲和配基的选择亲和配基的选择p组合化学肽
5、库选择亲和配基 目标肽反义肽组合合成亲和筛选优选序列p噬菌体展示技术 目标蛋白可结合噬菌体扩增多轮筛选单克隆群体氨基酸序列pSELEX技术 随机序列PCR扩增特异性结合重复筛选第13页，共73页。亲和洗脱亲和洗脱p目标产物的洗脱方法有特异性洗脱和非特异性洗脱。p特异性洗脱剂含有与亲和配基或目标产物具有亲和结合作用的小分子化合物，通过与亲和配基或目标产物的竞争性结合，洗脱目标产物。p非特异性洗脱通过调节洗脱液的pH、离子强度、离子种类或温度等降低目标产物的亲和吸附作用。第14页，共73页。亲和色谱亲和色谱p亲和层析(Affinity Chromatography，AC)是利用生物大分子具有对一类
6、生物大分子特异识别和可逆结合的特性而建立起来的一种分离的色谱方法，也叫做生物亲和或生物特异性亲和色谱。p是亲和分离技术中最具优势的方法第15页，共73页。含配体溶液含配体溶液收集目的蛋收集目的蛋白白 洗下未结合的洗下未结合的蛋白蛋白混合蛋白样混合蛋白样品品平衡平衡液液带有配体的树带有配体的树脂珠（或胶粒）脂珠（或胶粒）第16页，共73页。第17页，共73页。亲和层析的基本特点亲和层析的基本特点1、纯化过程简单、迅速，且分离效率高2、特别适用于分离纯化一些含量低、稳定性差的生物大分子3、纯化倍数大，产物纯度高4、必须针对某一分离对象制备专一的配基及寻求稳定的层析条件5、价格相对较昂贵；6、在洗脱
7、中，交联在层析介质上的配基可能脱落并进入产品中，从而造成不良影响，如抗体、染料等配基。第18页，共73页。基质的选择理想的基质应符合下面的要求：1极低的非特异性吸附。2高度的亲水性。3较好的理化稳定性。4大量的化学基团能被有效地活化，而且容易和配体结合。5适当的多孔性。一般亲和吸附剂采用的基质有纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、交联葡聚糖、琼脂糖、交联琼脂糖、多孔玻璃珠等。亲和色谱介质的制备亲和色谱介质的制备第19页，共73页。配基的选择配基的选择 根据配体对待分离物质的亲和性的不同，可以将其分为两类：特异性配体（specific ligand）和通用性配体（general ligand）。特异性配体一
8、般是指只与单一或很少种类的蛋白质等生物大分子结合的配体。如生物素和亲和素、抗原和抗体、酶和它的抑制剂、激素受体等，它们结合都具有很高的特异性，用这些物质作为配体都属于特异性配体。配体的特异性是保证亲和层析高分辨率的重要因素，但寻找特异性配体一般是比较困难的，尤其对于一些性质不很了解的生物大分子，要找到合适的特异性配体通常需要大量的实验。第20页，共73页。通用性配体一般是指特异性不是很强，能和某一类的蛋白质等生物大分子结合的配体，如各种凝集素（lectine）可以结合各种糖蛋白，核酸可以结合RNA、结合RNA的蛋白质等。通用性配体对生物大分子的专一性虽然不如特异性配体，但通过选择合适的洗脱条件
9、也可以得到很高的分辨率。而且这些配体还具有结构稳定、偶联率高、吸附容量高、易于洗脱、价格便宜等优点，所以在实验中得到了广泛的应用。第21页，共73页。22配基的浓度配基的浓度 p对亲和势比较低的时候（KL10-4mol/L），增加配基浓度有利于吸附。p增加亲和柱的长度来提高吸附率。p配基浓度太高使吸附力太强，洗脱困难。p理想的配基浓度为1-10mol/L。第22页，共73页。23配基偶联的位置配基偶联的位置p配基固定化时，其不参与亲和结合的部位与载体进行偶联。p腺嘌呤N6-氨基接到载体上，对脱氢酶和甘油激酶有吸附力。p磷酸基接到载体上，对甘油醛-3-磷酸脱氢酶有吸附力。第23页，共73页。24
10、配基分子的大小配基分子的大小 p选用大分子配基。p小分子物质作为配基，载体和配基间插入一个“手臂”以消除空间障碍。第24页，共73页。亲和吸附介质的配基亲和吸附介质的配基 （1）酶的抑制剂 一些物质，它们并不引起酶蛋白变性，但能使酶分子上的某些必需基团（主要是指酶活性中心上的一些基团）发生变化，因而引起酶活力下降，甚至丧失，致使酶反应速度降低，能引起这类抑制作用的物质称为酶的抑制剂（inhibitor）。在生物体内蛋白酶的抑制剂可与蛋白酶的活性部位结合，抑制酶的活性，必要时保护生物组织不受蛋白酶的损害。酶的抑制剂在分子大小和形态上分布较广，有天然的生物大分子，也有小分子化合物。第25页，共73
11、页。（2）抗体 利用抗体为配基的亲和层析又称为免疫亲和层析（Immunoaffinity chromatography）。抗体与抗原之间具有高度特异性结合能力，结合常数一般为1071012L/mol。因此，利用免疫亲和层析法，特别是以单抗为配基的免疫亲和层析法是高度纯化蛋白质类生物大分子的有效手段。第26页，共73页。（3）A蛋白 A蛋白（protein A）为分子量约42KD的蛋白质，存在于黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）的细胞壁中，占该细胞壁构成成分约5。A蛋白在确定其为蛋白质之前称A抗原，与动物免疫球蛋白G(immunogloblin G，IgG)具有很强的亲和结
12、合作用，结合部位IgG分子的Fc片断（Y字型IgG分子的主干部分）A蛋白不与抗体（IgG）的抗原结合部位结合，而且任何抗体的Fc片断的结构都非常相似，因此A蛋白可作为各种抗体的亲和配基，但不同抗体的结合常数有所不同。第27页，共73页。（4）凝集素 凝集素(lectin)是与糖特异性结合的蛋白质（酶和抗体除外）的总称，大部分凝集素为多聚体，含有两个以上的糖结合部位，不同的凝集素与糖结合的特异性不同。例如，常用做亲和配基的伴刀豆球蛋白A(concanavalin A，con A)与葡聚糖和甘露糖的亲和结合作用较强，而麦芽糖凝集素（wheat germ agglutinin，WGA）与N-乙酰葡糖
13、胺（N-acetyl-glucosamine）的亲和结合作用较强。第28页，共73页。（5）辅酶和磷酸酰苷 各种脱氢酶和激酶需要在辅酶（coenzyme）的存在下表现其生物催化活性，即脱氢酶和激酶与辅酶之间具有亲和作用。辅酶主要有辅酶（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，nicotinamideadenine dinucleotide，NAD）、辅酶（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，NAD phosophate，NADP）和三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）等。这些辅酶可用做脱氢酶和激酶的亲和配基。此外，磷酸腺苷（adenosine 5-monophosphate，AMP）、二磷酸
14、腺苷（adenosine2，5-diphosphate，ADP）的腺苷部分与上述辅酶的结构类似，与脱氢酶和激酶同样具有亲和结合作用，可用做这些酶的亲和配基。第29页，共73页。（6）过渡金属离子 Cu2+、Ni2+、Zn2+、Co2+等过渡金属离子可与N、S和O等供电原子（electron donor atom）产生配位键，因此可与蛋白质表面的组氨酸（His）的咪唑基、半胱氨酸（Cys）的巯基和色氨酸（Trp）的吲哚基发生亲和结合作用，其中以His的咪唑基的结合作用最强。过渡金属离子与咪唑基的结合强弱顺序是Cu2+Ni2+Zn2+Co2+。第30页，共73页。（7）组氨酸 在各种氨基酸中，组氨
15、酸的性质比较独特：具有弱疏水性、咪唑环为弱电性。因此组氨酸可与蛋白质发生亲和结合作用。虽然这种亲和作用的机理尚不十分清楚，但利用固定化组氨酸吸附蛋白质以及吸附蛋白的洗脱实验结果表明，静电和疏水性相互作用均有可能参与亲和结合。在盐浓度较低和pH约等于目标蛋白质等电点的溶液中，固定化组氨酸的亲和吸附作用最强，随着盐浓度增大，亲和吸附作用降低。因此利用组氨酸为配基可亲和分离等电点相差较大的蛋白质，洗脱则可采用增大盐浓度的梯度洗脱法。第31页，共73页。（8）肝素 肝素（heparin）是存在于哺乳动物的肝、肺、肠等脏器中的酸性多糖类物质，分子量一般为530KD，具有抗凝血作用。肝素与脂蛋白、脂肪酶、
16、甾体受体、限制性核酸内切酶、抗凝血酶、凝血蛋白质等具有亲和作用，可用作这些物质的亲和配基。肝素的亲和结合作用在中性pH和低浓度盐溶液中较强，随着盐浓度的增大结合作用降低第32页，共73页。活化 基质的活化是指通过对基质进行一定的化学处理，使基质表面上的一些化学基团转变为易于和特定配体结合的活性基团。溴化氰活化法 溴化氰活化法是最常用的活化方法之一，活化过程主要是生成亚胺碳酸活性基团，它可以和伯氨(NH2)反应，主要生成异脲衍生物。反应如下：介质活化与耦联介质活化与耦联第33页，共73页。活化耦联过程活化耦联过程20ml、2mol/L碳酸氢钠+20g湿琼脂糖，冰浴4-5min搅拌过程中加入溴化氰
17、，4-510min过滤，冷蒸馏水和缓冲液洗涤加入溶于缓冲液中的配基，搅拌2h，4保存第34页，共73页。这种方法的缺点是溴化氰活化法的基质和配体偶联后生成的异脲衍生物中氨基的pKa10.4，所以通常会带一定的正电荷，从而使基质可能有阴离子离子交换作用，增大了非特异性吸附，影响亲和层析的分辨率。另外溴化氰活化的基质与配体结合不够稳定，尤其是当与小配体结合时，可能会出现配体脱落现象。另外溴化氰有剧毒、易挥发，所以操作不便。第35页，共73页。环氧基活化法 在热的浓碱溶液中，多糖类化合物与环氧氯丙烷作用生成环氧化合物；在碱性条件下，其环氧化合物又能与氨基酸或蛋白质上氨基偶联。第36页，共73页。这种
18、活化方法的优点是活化后不引入电荷基团，而且基质与配体形成的NC、OC 和SC 键都很稳定，所以配体与基质结合紧密，亲和吸附剂使用寿命长，而且便于在亲和层析中使用较强烈的洗脱手段，另外这种处理方法没有溴化氰的毒性。它的缺点是用环氧氯丙烷活化的基质在与配体偶联时需要碱性条件，pH 为9-13，温度为20-40。这样的条件对于一些比较敏感的配体可能不适用。上面两种方法是比较常用的方法。另外还有甲苯磺酰氯法、双功能试剂法。第37页，共73页。亲和配基耦联密度测定亲和配基耦联密度测定 耦联密度决定了介质的吸附容量p分光光度法p量差法分析p水解作用分析p元素分析法第38页，共73页。间臂分子间臂分子p当配
19、基的分子量较小时，将其直接固定在载体上，会由于载体的空间位阻，配基与生物大分子不能发生有效的亲和吸附作用。p如果在配基与载体之间连接间隔臂，可以增大配基与载体之间的距离，使其与生物大分子发生有效的亲和结合。AC ver 99032630Steric considerations&spacer armsSmall ligand(1,000)Risk of steric interference with binding between matrix and target moleculeOften need spacer armbut watch out for adsorption to th
20、e spacer!Spacer arm第39页，共73页。p加入间臂的长度要恰当，太短则效果不明显；太长则容易由疏水性非特异吸附造成弯曲，反而降低吸附效率。p间臂的疏水性也需要考虑，应尽量减小对配基的影响。如间臂和配基疏水性较强，则效果不明显。第40页，共73页。第41页，共73页。常见的亲和色谱常见的亲和色谱p核苷酸及辅酶亲和色谱p固定化金属离子亲和色谱p染料亲和色谱p免疫亲和色谱p基团专一性大分子亲和色谱第42页，共73页。核苷酸及辅酶亲和色谱核苷酸及辅酶亲和色谱p指将核苷酸（或辅酶）作为亲和配基固定在色谱介质上进行亲和色谱的技术，主要利用核苷酸特别是辅酶因子和蛋白质之间的专一性识别达到分
21、离纯化目的第43页，共73页。第44页，共73页。介质制备介质制备p碳二亚胺直接法偶联 溴化氢活化琼脂糖连接氨基己酸加入核苷酸溶液中保存洗涤偶联p间接偶联法 间臂分子和核苷酸活化的介质第45页，共73页。吸附和解吸吸附和解吸p选择合适的缓冲液条件下吸附p一般采用辅酶或盐溶液进行梯度洗脱第46页，共73页。固定化金属离子亲和色谱固定化金属离子亲和色谱p蛋白质上的氨基酸残基，如组氨酸的咪唑基、半胱氨酸的巯基和色氨酸的吲哚基，有利于蛋白质与固定化金属离子结合，从而达到分离的目的。p金属离子如锌和铜。第47页，共73页。48p将活化的介质与金属螯合剂偶联，再用金属离子溶液处理制成金属螯合亲和层析柱。p
22、金属螯合剂：亚氨二醋酸、氨基水杨酸、8-羟基喹啉、羧甲基氨基酸等.第48页，共73页。亲和作用机理亲和作用机理p静电作用p配位键结合p共价键生产p 键第49页，共73页。吸附吸附p采用50mmol/L的金属盐溶液通过色谱柱，直至色谱介质吸附饱和。p平衡缓冲溶液洗去未螯合的金属离子p加入适宜浓度的NaCl和选择合适pH值有利于减少非特异性吸附。第50页，共73页。解吸解吸吸附蛋白质解吸的方法：p改变pH值p竞争性洗脱p采用50-100mmol/L的EDTA洗脱，可将蛋白质和金属离子解吸，洗涤，重新上柱平衡，固定所需的金属离子。第51页，共73页。pH与氯化铵浓度的影响与氯化铵浓度的影响第52页，
23、共73页。固定化亲和离子色谱的应用固定化亲和离子色谱的应用p基因修饰蛋白质的纯化p遗传修饰具亲和尾蛋白色谱分离亲和尾切除色谱分离酶切位点亲和尾大小第53页，共73页。54染料亲和色谱染料亲和色谱p有机染料具有类似于NAD+的结构。p需核苷酸类物质为辅酶的酶，对染料具有一定亲和力。p染料共价偶联到琼脂糖载体上，能制得亲和层析柱。p染料亲和层析已成功的分离纯化了多种酶。第54页，共73页。第55页，共73页。染料亲和色谱介质的制备染料亲和色谱介质的制备p配基性质、染料结构和染料取代度是制备过程中需要考虑的主要因素。以下途径可以实现制备：p采用琼脂糖凝胶，染料连接在-OH上，该过程可在一定条件下直接
24、完成。p染料也可通过活性基团和基质偶联，该方法可引入高密度的染料。第56页，共73页。吸附蛋白质量增多选择亲和作用力较小的染料有利于解吸第57页，共73页。吸附与解吸吸附与解吸p采用磷酸盐缓冲液，在pH6.0-7.0条件下吸附常用解吸方法：p增加盐浓度p改变pH值p采用水溶性高聚物p亲和洗脱p最后对杂蛋白进行变性处理，洗涤、缓冲液平衡再生介质。第58页，共73页。免疫亲和色谱免疫亲和色谱p抗原和抗体的作用具有高度的专一性,并且它们的结合亲和力极强。因此用适当的方法将抗原或抗体结合到吸附剂上,便可有效地分离和纯化免疫物质。p特点：分离效率高，成本高，而且蛋白质亲和配基不稳定，容易降解。第59页，
25、共73页。免疫亲和色谱过程免疫亲和色谱过程目标蛋白质抗体制备上样与洗脱介质制备第60页，共73页。p单抗制备复杂，成本高，但也具有很多优点。第61页，共73页。色谱介质制备：p将抗体通过化学方法结合在色谱介质上p抗体之间交联形成不溶性衍生物第62页，共73页。p单抗问世后,不少生物技术公司在研制适宜于培养杂交瘤细胞的生物反应器及其培养基。这些大规模生产单抗技术的建立和不断完善,将降低免疫亲和色谱吸附剂的价格。p随着新的合成基质和偶联化合物的出现以及对免疫亲和色谱研究的深入,必将使免疫亲和色谱在工业性生产纯化蛋白质的应用上逐渐得到发展。第63页，共73页。解吸解吸p特异性解吸半抗原置换p非特异性
26、解吸调节pH值、加入试剂破坏氢键、引入离子对、加入表面活性剂、冷蒸馏水洗涤。第64页，共73页。应用应用p根据研究报道,用单克隆抗体亲和色谱从人血小板破碎液中纯化血小板第4 因子(PF4)。将单克隆抗体Sz-95-LgG 与溴化氰活化的Spharose 4B 凝胶连接成亲和色谱柱,人血小板破碎液经此亲和色谱柱上样后,经洗脱获得PF4。结果表明,Sz-95-Sepharose 4B 亲和色谱柱的偶联率为72%,每1mL血小板破碎液中可以纯化到PF4 18 g。第65页，共73页。基团专一性大分子亲和色谱基团专一性大分子亲和色谱p指用对某一类结构相近的物质有亲和性的大分子作为亲和配基偶联在色谱介质
27、上进行的色谱技术。p蛋白A亲和色谱p伴刀豆球蛋白A亲和色谱p肝素亲和色谱第66页，共73页。1）分离纯化大分子物质）分离纯化大分子物质如：纯化糖蛋白用凝集素（能可逆性地结合碳水化合物的蛋白质），如：纯化糖蛋白用凝集素（能可逆性地结合碳水化合物的蛋白质），Lectin-Sepharose 4B2)研究酶的结构与功能：研究酶的结构与功能：分离有生物活性与失去生物活性的蛋白质。分离有生物活性与失去生物活性的蛋白质。亲和色谱的应用亲和色谱的应用第67页，共73页。样品样品第68页，共73页。t-PA的纯化的纯化酶的抑制剂为亲和配基酶的抑制剂为亲和配基第69页，共73页。干扰素的纯化干扰素的纯化免疫亲和色谱免疫亲和色谱第70页，共73页。脱氢酶的纯化脱氢酶的纯化色素亲和色谱色素亲和色谱第71页，共73页。淀粉酶抑制剂的纯化淀粉酶抑制剂的纯化固定化金属离子亲和色固定化金属离子亲和色谱谱第72页，共73页。基因重组融合蛋白的纯化基因重组融合蛋白的纯化第73页，共73页。
