1、DNA的提取方法 中德美联 致臻溯源DNA提取方法：n有机(饱和苯酚-氯仿)提取法nChelex-100树脂提取法n磁珠提取法一、饱和苯酚-氯仿抽提法n饱和苯酚-氯仿抽提法提取DNA在研究DNA基因座的多态性中，特别是在提取完整的基因组DNA中应用广泛。加入150ul已配好的洗涤液，盖上离心管盖，在离心管不离开磁力架的情况下，倒置磁力架，将离心管管盖洗净之后涡旋振荡混匀，放回磁力架，磁吸5-10s，先吸弃管盖中的液体再吸弃所有液体（避免管盖上残留）；Chelex-100能有效除去非核酸有机物，主要用于提取全血或血痕、精液或精斑、混合斑、毛发、培养细胞等。1000012000rpm 离心23mi
2、n，弃去上清，收集沉淀。每次提取时使用的样本量不宜过多，否则获得DNA样品的纯度和产率将受影响。将组织于-20以下冷冻。除去液体，室温晾干（或真空抽干），2、氯仿的作用？氯仿：克服酚的缺点；5蛋白酶K(20mg/ml)6饱和酚7氯仿 870及100乙醇DNA 易溶于水，不溶于有机溶剂，而蛋白质在有机溶剂存在时变性沉淀。2.5Chelex-100 2.1、用酚抽提细胞DNA时，有什么作用？使蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用。用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA 联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。Chelex-100树脂提取法加速有机相与液相分层。饱和苯酚-氯仿提
3、取原理及步骤提取原理：提取原理：1、用酚抽提细胞DNA时，有什么作用？使蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用。用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA 联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。使用酚的优点：1.有效变性蛋白质；2.抑制了DNase的降解作用。缺点：1.能溶解10-15%的水，从而溶解一部分poly(A)RNA。2.不能完全抑制RNase的活性。2、氯仿的作用？氯仿：克服酚的缺点；加速有机相与液相分层。最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的迹量酚。（酚易溶于氯仿中）3、用酚-氯仿抽提细胞基因组DNA时，通常要在酚-氯仿中加少许异戊
4、醇，为什么？异戊醇：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。异戊醇可以降低表面张力，从而减少气泡产生。另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。4、用乙醇沉淀DNA时，为什么加入单价的阳离子？用乙醇沉淀DNA时，通常要在溶液中加入单价的阳离子，如NaCl 或 NaAc，Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，而易于聚集沉淀。饱和苯酚-氯仿提取步骤n【实验原理】DNA 易溶于水，不溶于有机溶剂，而蛋白质在有机溶剂存在时变性沉淀。利用核酸和蛋白质对酚和氯仿变性作用的反应性不同分离核酸与蛋白质后，在高盐存在下用乙醇沉淀收集
5、DNA。n【实验试剂】14%枸橼酸钠抗凝剂 20.2%盐水3STE 缓冲液 410%SDS5蛋白酶K(20mg/ml)6饱和酚7氯仿 870及100乙醇9.3mol/L 醋酸钠 10.无菌去离子水11.TE 缓冲液n【实验方法】1.样品处理（1）血液样品 将抗凝血以20003000rpm 离心10min；吸取白细胞层约0.2ml 移入1.5ml Eppendorf管中，加入0.2%盐水1ml，混匀，使红细胞溶解，10000rpm 离心10min，弃去上层血红蛋白溶液，白细胞沉淀于管底。重复此步骤至血红蛋白溶液层为透明，弃上清。沉淀的白细胞中加入1mlSTE，混匀，10000rpm 离心10mi
6、n，吸去上层STE 至剩余总体积约为0.5ml。注意事项：根据血液量调整消化提取体积。n4.沉淀DNA（1）转移上层水溶液到另一Eppendorf 管，加入1/10 体积的3mol/L 醋酸钠和2 倍体积冰冷（-20保存）无水乙醇，混匀，沉淀DNA。10000rpm 离心10min。（2）弃上清，用70冷乙醇洗DNA 沉淀，三次。除去液体，室温晾干（或真空抽干），（3）加适量的TE 液溶解DNA，溶解后的DNA 于4保存。注意事项：沉淀的DNA 凉干时，不宜完全干燥，否则难以溶解。n【实验讨论】有机溶剂法DNA，应用范围广，适合所有生物性检材，对腐败、陈旧、污染检材及指甲、毛发等无核细胞检材更
7、有效；DNA 纯度高，可用于所有的DNA 分析。一、Chelex-100提取法nChelex-100树脂法提取DNA目前在获取部分DNA片段进行PCR分析中应用较广。Chelex-100提取原理及步骤提取原理：提取原理：nChelex-100是由苯乙烯与二乙烯基苯的共聚体组成的一种螯合树脂，它对多价金属离子有高亲和力，其亚氨基二乙酸侧链起着螯合金属离子作用。现已证实Chelex可以防止DNA在煮沸中的降解，并在高温低离子强度下起着催化DNA释放的作用。nChelex-100能有效除去非核酸有机物，主要用于提取全血或血痕、精液或精斑、混合斑、毛发、培养细胞等。但因生物样本来源不同其操作方法有所差
8、异。n【实验试剂】1.5Chelex-100 2.蛋白酶K（20mg/ml）3.无菌去离子水 4.TE 缓冲液n【实验方法】1.样品处理（1）血液样品 取血液15l，加入1.5ml 离心管，加入纯水1ml，剧烈震荡，室温下放置15min。1000012000rpm 离心23min，弃去上清，收集沉淀。必要时用纯水洗涤12 次，直至无色或色素很少。（2）血痕样品 剪取15mm2 血痕检材，置于0.5ml 试管中。加入去离子灭菌水0.20.4ml，剧烈震荡，室温下放置1530min。12000rpm 离心3min，弃去上清，保留沉淀及载体。（3）软组织样品 将组织于-20以下冷冻。用手术刀片刮取1
9、5g 组织.放入1.5ml 离心管中。2.DNA 提取（1）处理后的样品中加入200l 悬浮好的5%Chelex-100 溶液（软组织检材同时还应加入10mg/ml 蛋白酶K 23l），（2）在56水浴中温浴30min 以上，震荡510s。（3）100温浴8min 后，剧烈震荡510s。（4）120000rpm 离心3min，以沉淀Chelex-100 颗粒，上清液可用于PCR 反应。n注意事项：1.Chelex-100 放置后会沉淀，使用前必须混匀。2.Chelex-100 法提取DNA 煮沸非常关键，温度和时间要足够。3.提取的DNA 应在短时间内使用。若放置时间较长，应充分混匀再离心后，
10、取上清液扩增。n【实验讨论】Chelex-100 法提取DNA，提取过程始终在同一个试管内进行，不涉及转移，减少污染机会，同时也降低了检材的损失，是一个十分简单、快速的方法，很适合微量检材的DNA提取；但本法提取的DNA 纯度不高，仅适用于PCR 反应模板制备。三、磁珠提取法n实验原理n磁珠法核酸纯化技术采用了纳米级磁珠微珠，这种磁珠微珠的表面标记了一种官能团，能同核酸发生吸附反应。n硅磁（Magnetic Silica Particle）就是指磁珠微珠表面包裹一层硅材料，来吸附核酸，其纯化原理类型于玻璃奶的纯化方式。离心磁珠是指磁珠微珠表面包裹了一层可发生离心交换的材料（如DEAE，COOH
11、）等，从而达到吸附核酸目的。不同性质的磁珠微珠所对应的纯化原理是不一致。使用磁珠法来纯化核酸的最大优点就是自动化。磁珠在磁场条件下可以发生聚集或分散，从而可彻底摆脱离心等所需的手工操作流程。Omega拥有全面的磁珠法核酸分离试剂盒，基于这种技术的试剂盒，名称前都有Mag-Bind。n n核酸分离与纯化的原则n核酸在细胞中总是与各种蛋白质结合在一起的。核酸的分离主要是指将核酸与蛋白质、多糖、脂肪等生物大分子物质分开。在分离核酸时应遵循以下原则:保证核酸分子一级结构的完整性;排除其他分子污染。1、用酚抽提细胞DNA时，有什么作用？使蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用。将组织于-20以下冷冻
12、。饱和苯酚-氯仿提取步骤注意事项：根据血液量调整消化提取体积。一、饱和苯酚-氯仿抽提法但本法提取的DNA 纯度不高，仅适用于PCR 反应模板制备。离心磁珠是指磁珠微珠表面包裹了一层可发生离心交换的材料（如DEAE，COOH）等，从而达到吸附核酸目的。4ml，剧烈震荡，室温下放置1530min。3、用酚-氯仿抽提细胞基因组DNA时，通常要在酚-氯仿中加少许异戊醇，为什么？异戊醇：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。Chelex-100 法提取DNA，提取过程始终在同一个试管内进行，不涉及转移，减少污染机会，同时也降低了检材的损失，是一个十分简单、快速的方法，很适合微量检材的DNA提取；2、氯仿的
13、作用？氯仿：克服酚的缺点；5ml离心管中，加入150ul裂解液及1.2.提取的DNA 应在短时间内使用。DNA 纯度高，可用于所有的DNA 分析。n斑迹样本（血滤纸或FTA）中DNA的提取：n剪取适量斑迹样本（大小约3mm3mm，血液不宜超过6ul）放入0.5或1.5ml离心管中，加入150ul裂解液及1.5ul 1mol/LDTT（视检材而定），涡旋振荡混匀后，95温浴30min，温浴后旋涡振荡混匀；长期样本和难以裂解样本，将样本尽量剪碎并95温浴45min，如水浸泡不脱色样本。每次提取时使用的样本量不宜过多，否则获得DNA样品的纯度和产率将受影响。这是因为起始样本量大时裂解体系粘度过高将使
14、磁珠不易从溶液中磁吸出来。如需要使用更多的起始样本量，可适当增加裂解液的用量对体系进行稀释）加入150ul已配好的洗涤液，盖上离心管盖，在离心管不离开磁力架的情况下，倒置磁力架，将离心管管盖洗净之后涡旋振荡混匀，放回磁力架，磁吸5-10s，先吸弃管盖中的液体再吸弃所有液体（避免管盖上残留）；重复步骤一次；于磁力架上室温开盖干燥10min（不要超过20min，否则DNA难于溶解，尽量吸弃液体，便于干燥）；加入50-100ul高纯水，旋涡振荡混匀，65温浴5min，旋涡振荡混匀后立即置于磁力架上，磁吸5-10s，吸出溶液至另一个离心管，-20保存备用（溶液一定要趁热吸取，否则冷却会影响提取效率）.
