1、逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction实验目的实验原理实验过程注意事项实验目的实验原理实验过程注意事项1、了解RT-PCR的原理、反转录酶的特性2、掌握RT-PCR的基本操作过程 RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统等。实验目的实验原理实验过程注意事项rRNA(80-85%)；tRNA(15-20%)；mRNA(1-5%)随机引物法是三种方法中特异性最低的。引物在
2、整个转录本的多个位点退火，产生短的，部分长度的cDNA。这种方法经常用于获取5末端序列及从带有二级结构区域或带有逆转录酶不能复制的终止位点的RNA模板获得cDNA。为了获得最长的cDNA，需要按经验确定每个RNA样品中引物与RNA的比例。随机引物的起始浓度范围为50到250ng每20l反应体系。因为使用随机引物从总RNA合成的cDNA主要是核糖体RNA，所以模板一般选用poly(A)+RNA。Oligo(dT)起始比随机引物特异性高。它同大多数真核细胞mRNA 3端所发现的poly(A)尾杂交。因为poly(A)+RNA大概占总RNA的1%到2，所以与使用随机引物相比，cDNA的数量和复杂度要
3、少得多。因为其较高的特异性，oligo(dT)一般不需要对RNA和引物的比例及poly(A)+选择进行优化。建议每20l反应体系使用0.5g oligo(dT)。oligo(dT)12-18适用于多数RT-PCR。基因特异性引物（GSP）对于逆转录步骤是特异性最好的引物。GSP是反义寡聚核苷，可以特异性地同RNA目的序列杂交，而不象随机引物或oligo(dT)那样同所有RNA退火。用于设计PCR引物的规则同样适用于逆转录反应GSP的设计。GSP可以同与mRNA 3最末端退火的扩增引物序列相同，或GSP可以设计为与反向扩增引物的下游退火。实验目的实验原理实验过程注意事项反转录体系反转录体系第一步
4、：第一步：0.5 ml0.5 ml离心管中离心管中 模板模板RNA 2uLRNA 2uLdNTP 2uLdNTP 2uLoligodT oligodT 2uL2uLDEPCDEPC水补充到水补充到14uL14uL70 5min 4 10min70 5min 4 10min；短暂离心；短暂离心；第二步：第二步：5 5buffer 4uLbuffer 4uL0.1 mol/L0.1 mol/L的的DTT 1uLDTT 1uLRnase InhibitorRnase Inhibitor混匀，离心，混匀，离心，42 42 孵育孵育2-52-5分钟；分钟；逆转录酶逆转录酶M-MLV 1uLM-MLV 1
5、uL42 42 中，水浴中，水浴60 min60 min；95 5min 95 5min 终止反应；终止反应；-20-20 保存备用。保存备用。PCR(Polymerase Chain Reaction)聚合酶链反应It simulates the replication of DNA and makes it happen continuouslyIt simulates the replication of DNA and makes it happen continuously1983.4 Kary Mullis在开车前去北加利福尼亚红树县Redwood country的一条被月光笼罩的
6、山路上构思了PCR 随后卖给了Roche公司 价格：10,000$1993 Nobel prize 历 史 PCR?PCR只是一个简单的不起眼玩艺只是一个简单的不起眼玩艺 凯利穆利斯（Kary Mullis)PCR只是一个概念，所发生的奇迹是：只是一个概念，所发生的奇迹是：PCR概概念变成了可操作的实验系统，变成了一项成熟的念变成了可操作的实验系统，变成了一项成熟的技术，后者又上升成为新的概念。技术，后者又上升成为新的概念。它最大的特点就是能不断推出新形式。它最大的特点就是能不断推出新形式。摘自Making PCR:A Story of Biotechnology by Paul Rabino
7、w什么是什么是PCR?我不认为PCR能够用两种“革命”(政治革命和科学革命)加以说明。它的发明并没有改变基因操作的本质。有了PCR，我们能在更广的范围内更快、更容易地进行基因操作，学术界也完全不用等到某人死去或退休后才能接受PCR。它只不过是一种它只不过是一种新工具。新工具。凯利穆利斯（Kary Mullis)PCR及有关技术的发展历史及有关技术的发展历史1983，Cetus 公司的 K.Mullis在这年底（12月16日第一次成功实验）发明了PCR。九十年代中期九十年代中期PCR临床应用在国内全面展开临床应用在国内全面展开1998年 实时荧光PCR技术开始在中国较广泛的应用于临床检测1999
8、年 西方发达国家尝试将PCR应用于血液筛查PCR发明过程的简单回顾发明过程的简单回顾PCRPCR的基本原理的基本原理 变性、复性、半保留复制变性、复性、半保留复制一生二，二生四，四生万物一生二，二生四，四生万物 PCRPCR三步曲三步曲变性变性 90909797退火退火 45455555延伸延伸 7272左右左右PCRPCR过程过程PCR PCR 循环循环 第一步第一步 加热变性加热变性靶序列靶序列PCR PCR 循环循环-第二步第二步 引物与靶序列退火引物与靶序列退火靶序列靶序列Primer 1Primer 2BiotinBiotin53553533PCR PCR 循环循环 -第三步第三步
9、-引物延伸引物延伸靶序列靶序列Primer 1Primer 2BiotinBiotin53553533Taq DNAPolymerase第第1 1个个 PCR PCR 循环完成后循环完成后 得到两个拷贝的靶序列得到两个拷贝的靶序列靶序列 靶序列BiotinBiotin3030次循环后靶序列扩增的数量次循环后靶序列扩增的数量No.ofNo.Amplicon CyclesCopies of Target122438416532664201,048,576301,073,741,8241 cycle=2 Amplicon2 cycle=4 Amplicon3 cycle=8 Amplicon4 cy
10、cle=16 Amplicon5 cycle=32 Amplicon6 cycle=64 Amplicon7 cycle=128 AmpliconCompare PCR with DNA Replication DNA Replication PCR解链方式 Topoisomerase Heating引 物 RNA primer DNA primer延 伸 DNA polymerase I Taq DNA polymerase反应数 细胞分裂一次 Continuously DNA复制一次 25-30cyclesPCR反应体系的五要素反应体系的五要素：引物引物酶酶dNTP模板模板Mg2+引物决定
11、了引物决定了PCRPCR产物的特异性产物的特异性 一对引物，对应于欲扩增序列的上游及下游一对引物，对应于欲扩增序列的上游及下游 Sense and AntisenseSense and Antisense 长度长度：15153030个核苷酸个核苷酸 引物内、引物间不应有互补序列引物内、引物间不应有互补序列 尽量保障引物与非特异扩增区无同源性尽量保障引物与非特异扩增区无同源性引物的设计应遵循一定的原则引物的设计应遵循一定的原则引物的引物的Tm值：值：引物模板双链体的解链温度。引物模板双链体的解链温度。Tm4（G+C）+2(A+T)决定于引物的长度及碱基的组成。决定于引物的长度及碱基的组成。退火温
12、度退火温度和和TmTm值值是影响模板与引物结合的关键是影响模板与引物结合的关键引物的引物的3端：端：应当尽量没有错配应当尽量没有错配 避免为避免为T，以免发生错配；，以免发生错配；避免用避免用A，防止结合自由能太低，影响延伸效率；，防止结合自由能太低，影响延伸效率；避免用避免用GC多组合。多组合。Taq DNATaq DNA聚合酶聚合酶 来自水生栖热菌来自水生栖热菌 T Thermushermusaqaquaticusuaticus 良好的耐热性良好的耐热性 MgMg2+2+依赖性依赖性 Taq DNATaq DNA聚合酶的一个致命的弱点是它的聚合酶的一个致命的弱点是它的出错率，一般出错率，一
13、般PCRPCR中出错率为中出错率为2 2*10104 4核苷核苷酸酸/每轮循环每轮循环 在在100l PCR100l PCR反应中反应中,1.5-2,1.5-2单位的单位的Taq DNATaq DNA聚合酶就足以进行聚合酶就足以进行3030轮循环轮循环.所用的酶量可根据所用的酶量可根据DNADNA、引物及其它因素的、引物及其它因素的变化进行适当的增减变化进行适当的增减.酶量过多会使产物非酶量过多会使产物非特异性增加特异性增加,过少则使产量降低过少则使产量降低.4种三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)一般反应中每种dNTP的终浓度为20-200mol/L。理论上4 种 dNTP各20mol/L,足以在1
14、00l反应中合成2.6g的DNA。当dNTP终浓度大于50mmol/L时可抑制Taq DNA聚合酶的活性.4种dNTP的浓度应该相等,以减少合成中由于某种dNTP的不足出现的错误掺入。模板 PCRPCR反应必须以反应必须以DNADNA为模板进行扩增为模板进行扩增,模板模板DNADNA可以可以是单链分子是单链分子,也可以是双链分子也可以是双链分子,可以是线状分子可以是线状分子,也可以是环状分子也可以是环状分子(线状分子比环状分子的扩增效线状分子比环状分子的扩增效果稍好果稍好).).就模板就模板DNADNA而言而言,影响影响PCRPCR的主要因素是模板的的主要因素是模板的数量数量和和纯度纯度.一般
15、反应中的模板数量为一般反应中的模板数量为102-105 102-105 个个拷贝拷贝,对于单拷贝基因对于单拷贝基因,这需要这需要0.1g0.1g的人基因组的人基因组.扩增多拷贝序列时扩增多拷贝序列时,用量更少用量更少.灵敏的灵敏的PCRPCR可从一个可从一个细胞细胞,一根头发一根头发,一个孢子或一个精子提取的一个孢子或一个精子提取的DNADNA中中分析目的序列分析目的序列.模板量过多则可能增加非特异性产模板量过多则可能增加非特异性产物物.DNA.DNA中的杂质也会影响中的杂质也会影响PCRPCR的效率。的效率。Mg2+Mg2+Mg2+Mg2+浓度对浓度对Taq DNATaq DNA聚合酶影响很
16、大聚合酶影响很大,它可它可影响酶的活性和真实性影响酶的活性和真实性,影响引物退火影响引物退火和解链温度和解链温度,影响产物的特异性以及引影响产物的特异性以及引物二聚体的形成等。物二聚体的形成等。通常通常Mg2+Mg2+浓度范围为浓度范围为0.5-2mmol/L.0.5-2mmol/L.对于一对于一种新的种新的PCRPCR反应反应,可以用可以用0.1-5mmol/L0.1-5mmol/L的递增的递增浓度的浓度的Mg2+Mg2+进行预备实验进行预备实验,选出最适的选出最适的Mg2+Mg2+浓度。浓度。There are 3 main steps in the replication of DNA1
17、、DNA双链解离为单链双链解离为单链。（。（double strands single strands）2 2、引物的合成。、引物的合成。(primer synthesize)3 3、DNADNA链的延伸。链的延伸。(extention)PCR反应的过程：反应的过程：Also 3 steps in PCR1,Denaturation(变性变性)：通过加热使通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，双螺旋的氢键断裂，DNA双链解离形成单链。双链解离形成单链。+Heating 2，Annealling（退火）：（退火）：当温度突然降低时，引物与其互补的当温度突然降低时，引物与其互补的 模板按碱基配对的原则
18、在局部形成杂交链。模板按碱基配对的原则在局部形成杂交链。3,Extention（延伸）：（延伸）：在在DNA聚合酶的作用下，以引物为起聚合酶的作用下，以引物为起 点，点，DNA链按链按5 3的方向延伸。的方向延伸。+程序设置：94 Xs 55 Xs 72 Xs X个循环（一般在72时酶催化核苷酸的标准速率可达35100个核苷酸/秒）72 5m一般在扩增反应完成后,都需要一步较长时间(10-90min)的延伸反应,以获得尽可能完整的产物,这对以后进行克隆或测序反应尤为重要。PCR反应的程序设计：反应的程序设计：PCR中的注意事项PCR反应中可能出现的问题：假阴性，不出现扩增条带假阳性出现非特异扩
19、增带（一）防止污染试剂小量分装吸头及EP管一次性使用器皿及工作区域要分开，无菌操作（二）设立对照：阳性对照：阳性模板阴性对照：阴性模板试剂对照：除模板外的所有组分 PCR中的注意事项PCR的反应特点1.特异性强2.灵敏度高：PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将pg=10-12级的起始待测模板扩增到微克(g=10-6)水平3.简便、快速：PCR反应一般在24 小时完成扩增反应 4.对标本的纯度要求低：DNA 粗制品可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体液、毛发、细胞、活组织等扩增检测管家基因(house-keeping genes)，是所有细胞中均要表达的一类基因，其产物是对维持细胞基
20、本生命活动所必需的。如微管蛋白基因、糖酵解酶系基因与核糖体蛋白基因等。是指在生物体内所有细胞中都表达，并且为维持细胞基本生命活动所需而时刻都在表达的高度保守的基因。实验目的实验原理实验过程注意事项1.逆转录反应过程，需建立无RNAase环境，以避免RNA的降解。2.成功的逆转录反应决定于高质量的模板RNA。高质量的RNA至少应保证全长并且不含逆转录酶的抑制剂，如EDTA或SDS。此外，RT-PCR所遇到的一个潜在的困难是RNA中沾染的基因组DNA。使用较好的RNA分离方法，如Trizol Reagent，会减少RNA制备物中沾染的基因组DNA。因此在进行PCR反应时应该对每个RNA模板进行一个
21、无逆转录的对照反应，以确定扩增出来的片段是来自基因组DNA还是cDNA。在无逆转录时所得到的PCR产物来源于基因组。3.RT-PCR的起始模板可是总RNA或mRNA，都可以检测到扩增结果。4.在逆转录反应中经常加入RNA酶抑制蛋白以增加cDNA合成的长度和产量。RNA酶抑制蛋白要在第一链合成反应中，在缓冲液和还原剂(如DTT)存在的条件下加入，因为cDNA合成前的过程会使抑制剂变性，从而释放结合的可以降解RNA的RNase。RNA酶抑制蛋白仅防止RNase A，B，C对RNA的降解，并不能防止皮肤上的RNase，因此尽管使用了这些抑制剂，也要小心试验者的手上Rnase对样品的污染。5.较高的保
22、温温度有助于RNA二级结构的打开，增加了反应的产量。对于多数RNA模板，在没有缓冲液或盐的条件下，将RNA和引物在65-70 保温，然后迅速置于冰上冷却，可以消除大多数二级结构，从而使引物可以结合。然而某些模板仍然会存在二级结构，即使热变性后也是如此。对这些困难模板的扩增可以使用经过改良的耐高温逆转录酶，使逆转录反应置于较高温度下进行以改善扩增。而且适当提高逆转录保温温度，可增加RT-PCR的特异性。6.建立反应体系时，加完其它反应物后，才加模板DNA和Taq DNA聚合酶；然后将全部反应物涡旋混匀；上PCR仪前加矿物油封盖或设热盖。7.PCR反应的循环数一般25-30次就足够了，过多的循环数会造成非特异性扩增和时间的浪费。复性温度的计算，一般是在引物的Tm值上下浮动，Tm=2(A+T)+4(G+C)。适当提高复性温度可提高PCR扩增的特异性。
