1、第六章第六章 酶的分子修饰酶的分子修饰v 酶的化学修饰酶的化学修饰v2.2.酶的分子定向进化酶的分子定向进化.什么是酶分子修饰？通过各种方法使酶分子的结构发生某些通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的改变，从而改变酶的某些特性和功能的技术过程称为技术过程称为酶分子修饰酶分子修饰。.第一节第一节 酶的化学修饰酶的化学修饰v广义：广义：凡涉及共价部分或部分共价的形成凡涉及共价部分或部分共价的形成或破坏的转变。或破坏的转变。v狭义：狭义：较温和的条件下，以可控的方式是较温和的条件下，以可控的方式是一种蛋白质同某些化学试剂起特异反应，一种蛋白质同某些化学试剂起特异反应，从
2、而引起单个氨基酸或其功能基团发生共从而引起单个氨基酸或其功能基团发生共价的化学改变。价的化学改变。.酶的化学修饰的功能酶的化学修饰的功能 1 1）催化机理的研究）催化机理的研究 通过对特定基团侧链通过对特定基团侧链的化学修饰，可比较方便的获得有关必需的化学修饰，可比较方便的获得有关必需基团的性质，配合以保护手段还可以了解基团的性质，配合以保护手段还可以了解活性部位的信息。活性部位的信息。2 2）有目的对目标基团进行基团改造或保护，）有目的对目标基团进行基团改造或保护，可有目的的改变酶的活性。可有目的的改变酶的活性。3 3）改变酶的生理生化性质，如稳定性、最适）改变酶的生理生化性质，如稳定性、最
3、适pHpH、抗原性、实现特定目的的研究或应用、抗原性、实现特定目的的研究或应用目的。目的。.一、酶化学修饰方法及修饰剂一、酶化学修饰方法及修饰剂v修饰剂的要求修饰剂的要求v反应条件的选择反应条件的选择v酶修饰方法酶修饰方法v酶学性质酶学性质.1、影响酶化学修饰的主要因素、影响酶化学修饰的主要因素（1 1）影响酶蛋白功能基团反应性的因素）影响酶蛋白功能基团反应性的因素微区的极性微区的极性蛋白质中酚基和羧基相互作用中，羧基蛋白质中酚基和羧基相互作用中，羧基pKapKa低于正常值，而酚基的低于正常值，而酚基的pKapKa高于正常值。高于正常值。静电效应静电效应位阻效应位阻效应.2 2、修饰剂的反应性
4、、修饰剂的反应性v选择吸附选择吸附v静电相互作用静电相互作用v位阻因素位阻因素v催化因素催化因素.二、二、修饰反应专一性的控制修饰反应专一性的控制（1 1）试剂的选择）试剂的选择 实验目的不同，对专一性实验目的不同，对专一性的要求也不同。的要求也不同。（2 2）反应条件的选择：）反应条件的选择：v不造成蛋白质的不可逆变性。不造成蛋白质的不可逆变性。v有利于专一性修饰蛋白质有利于专一性修饰蛋白质.（3）反应的专一性）反应的专一性利用蛋白质分子中某些基团的特殊性利用蛋白质分子中某些基团的特殊性 选择不同的反应选择不同的反应pH pH 利用某些产物的不稳定性利用某些产物的不稳定性亲和标记亲和标记 差
5、别标记差别标记利用蛋白质状态的差异利用蛋白质状态的差异.三、修饰程度和修饰部位的测定三、修饰程度和修饰部位的测定（1 1）光谱法）光谱法（2 2）化学修饰数据的分析）化学修饰数据的分析化学修饰的时间进程分析化学修饰的时间进程分析确定必要基团的性质和数目确定必要基团的性质和数目.设计酶化学反应时应注意设计酶化学反应时应注意v 酶性质的了解酶性质的了解v 酶活性部位情况酶活性部位情况 酶催化活性主要依赖于酶的活性中心。因此，酶催化活性主要依赖于酶的活性中心。因此，对酶活性中心的组成，例如：酶蛋白中哪些氨对酶活性中心的组成，例如：酶蛋白中哪些氨基酸残基或其侧链基团参与了酶的活性中基酸残基或其侧链基团
6、参与了酶的活性中心是否需要辅因子，为何种辅因子等情况，心是否需要辅因子，为何种辅因子等情况，需要了解，此外，还需要了解酶的分子大小、需要了解，此外，还需要了解酶的分子大小、形状、寡聚酶的亚基组成等。形状、寡聚酶的亚基组成等。.v酶的稳定条件、酶反应最适条件酶的稳定条件、酶反应最适条件 酶的稳定性酶的稳定性 被修饰酶对热、对酸碱的稳定性，被修饰酶对热、对酸碱的稳定性，作用温度及作用温度及pHpH范围以及最适温度、最适范围以及最适温度、最适pHpH的情况，的情况，酶蛋白解离时的电学性质，酶蛋白水解部位，抑酶蛋白解离时的电学性质，酶蛋白水解部位，抑制剂的性质等应有所了解。制剂的性质等应有所了解。v酶
7、分子侧链基团的化学性质及反应活泼性酶分子侧链基团的化学性质及反应活泼性 酶侧链基团的性质及反应性酶侧链基团的性质及反应性 选择性修饰试剂选择性修饰试剂必须要与多肽链中某必须要与多肽链中某种特定的氨基酸残基侧链种特定的氨基酸残基侧链基团发生化学反应，并形成紧密共价结合。酶分基团发生化学反应，并形成紧密共价结合。酶分子中经常被修饰的氨基酸残基侧链基团有：巯基、子中经常被修饰的氨基酸残基侧链基团有：巯基、氨基、羧基、咪唑基、羟基、酚基、胍基、吲哚氨基、羧基、咪唑基、羟基、酚基、胍基、吲哚基、硫醚基及二硫键等。基、硫醚基及二硫键等。.v反应体系中酶与修饰剂的分子比例。反应体系中酶与修饰剂的分子比例。v
8、反应体系的溶剂性质，盐浓度和反应体系的溶剂性质，盐浓度和pHpH条件。条件。v反应温度及时间。反应温度及时间。不造成蛋白的不可逆变性有利于专一性修饰要求3 反应条件的选择反应条件的选择.二、二、酶分子侧链基团的化学修饰酶分子侧链基团的化学修饰 酶分子侧链基团的修饰是通过选择性的试酶分子侧链基团的修饰是通过选择性的试剂或亲和标记试剂与酶分子侧链上特定的剂或亲和标记试剂与酶分子侧链上特定的功能基团发生化学反应而实现的。功能基团发生化学反应而实现的。.1、几种重要的修饰反应、几种重要的修饰反应（1 1）酰化及其相关反应）酰化及其相关反应v试剂特点试剂特点：含有酰基结构，：含有酰基结构，C C上带有部
9、分正上带有部分正电荷。电荷。v这类试剂作用于侧链基团上的亲核基团，这类试剂作用于侧链基团上的亲核基团，使之酰基化，使之酰基化，酰基接到亲核原子酰基接到亲核原子上。上。v可作用基团可作用基团包括：包括：氨基，作用后形成酰胺；巯基：作用后形氨基，作用后形成酰胺；巯基：作用后形成巯酯；醇羟基（丝氨酸、苏氨酸）：作成巯酯；醇羟基（丝氨酸、苏氨酸）：作用后形成酯；酚羟基（酪氨酸）：作用后用后形成酯；酚羟基（酪氨酸）：作用后形成酚酯。形成酚酯。.酰基化反应中的酰基化反应中的X X既可以是卤素，也可以是既可以是卤素，也可以是某些吸电基团，如咪唑基。某些吸电基团，如咪唑基。.（2）烷基化反应）烷基化反应v试剂
10、特点：烷基上带有活泼卤素，由于卤试剂特点：烷基上带有活泼卤素，由于卤素原子的电负性，使烷基带有部分素原子的电负性，使烷基带有部分正电荷正电荷。v该类试剂作用于侧链基团的亲核基团，使该类试剂作用于侧链基团的亲核基团，使之烷基化，烷基连接在之烷基化，烷基连接在亲核原子亲核原子上。上。v可作用基团包括：可作用基团包括：氨基氨基（赖氨酸、精氨（赖氨酸、精氨酸），酸），巯基巯基（半胱氨酸）、（半胱氨酸）、羧基羧基（天冬氨（天冬氨酸、谷氨酸），酸、谷氨酸），甲硫基甲硫基（甲硫氨酸），（甲硫氨酸），咪咪唑基唑基（组氨酸）（组氨酸）.v试剂特点：试剂特点：具有氧化性或还原性具有氧化性或还原性v这类试剂作用于侧
11、链基团，这类试剂作用于侧链基团，可被氧化的基可被氧化的基团团包括巯基，甲硫基，吲哚基（色氨酸）、包括巯基，甲硫基，吲哚基（色氨酸）、咪唑基、二硫键等。咪唑基、二硫键等。v而被还原的基团主要是二硫键。而被还原的基团主要是二硫键。（3 3）氧化和还原反应）氧化和还原反应.连四硫酸盐氧化巯基，连四硫酸盐氧化巯基，DTTDTT还原逆回，可用还原逆回，可用于保护巯基。于保护巯基。.（4）芳香环取代反应）芳香环取代反应试剂：卤（碘）化、硝化试剂。试剂：卤（碘）化、硝化试剂。该类试剂作用于酪氨酸的该类试剂作用于酪氨酸的OH邻位。邻位。.2 2、特定氨基酸残基侧链基团的化学修饰、特定氨基酸残基侧链基团的化学修
12、饰v通过通过选择性的选择性的试剂或者试剂或者亲核亲核试剂与酶上特试剂与酶上特定的侧链基团进行化学修饰是酶分子化学定的侧链基团进行化学修饰是酶分子化学研究的重要方法，也是改造酶的性质和功研究的重要方法，也是改造酶的性质和功能的重要手段。能的重要手段。v2020种氨基酸的侧链基团中只有极性氨基酸种氨基酸的侧链基团中只有极性氨基酸的侧链容易被修饰，它们一般具有的侧链容易被修饰，它们一般具有亲核性亲核性。v从酶动力学的角度，酶必需基团的化学修从酶动力学的角度，酶必需基团的化学修饰的过程是不可逆抑制（激活）过程。饰的过程是不可逆抑制（激活）过程。.（1 1）巯基的化学修饰）巯基的化学修饰v巯基具有很强的
13、亲核性，采用巯基化学修巯基具有很强的亲核性，采用巯基化学修饰剂与酶蛋白侧链上的巯基结合，使巯基饰剂与酶蛋白侧链上的巯基结合，使巯基发生改变，从而改变酶的空间构象、特性发生改变，从而改变酶的空间构象、特性和功能。和功能。v巯基修饰可以分为以下几种：巯基修饰可以分为以下几种：二硫键交换、二硫键交换、重金属化合物作用、烷基化、酰基化重金属化合物作用、烷基化、酰基化。.二硫键交换E-SH+R-S-S-R-E-S-S-R+R-SHE-SH+E-S-S-R-E-S-S-E+R-SH 与与-SH进行二硫键交换后，进行二硫键交换后，-SH被修饰，试被修饰，试剂的另一半以单体放出。剂的另一半以单体放出。二硫键交
14、换产生的单体在一定波长下有很大二硫键交换产生的单体在一定波长下有很大的光吸收，可用分光光度计进行连续监测。的光吸收，可用分光光度计进行连续监测。.二硫键交换常用试剂二硫键交换常用试剂vDTNB 5,5-DTNB 5,5-二硫二硫-2-2-硝基苯甲酸硝基苯甲酸vN-N-乙基马来酰肼乙基马来酰肼.（2）氨基的化学修饰）氨基的化学修饰 氨基具有很高的亲核性，可用多种酰基化氨基具有很高的亲核性，可用多种酰基化或者烷基化试剂进行修饰。或者烷基化试剂进行修饰。烷基化烷基化.酰基化酰基化乙酸酐乙酸酐丹磺酰氯（丹磺酰氯（DNS）.还原烷基化还原烷基化一个常用的特异性修饰赖氨酸氨基的试剂一个常用的特异性修饰赖氨
15、酸氨基的试剂磷酸吡哆醛磷酸吡哆醛.（3）羧基的化学修饰）羧基的化学修饰 修饰羧基的反应专一性差，一般选用合适的修饰羧基的反应专一性差，一般选用合适的R R和和RR的水溶性碳化二亚胺修饰天冬氨酸的水溶性碳化二亚胺修饰天冬氨酸和谷氨酸，属烷基化反应。和谷氨酸，属烷基化反应。水溶性碳化二亚胺水溶性碳化二亚胺.酯化酯化氟硼化三甲基金羊盐（氟硼化三甲基金羊盐（CHCH3 3)3 3OBFOBF4 4.（4）咪唑基的化学修饰）咪唑基的化学修饰v通过对咪唑基上氮原子酰基化或烷基化修通过对咪唑基上氮原子酰基化或烷基化修饰组氨酸咪唑基。饰组氨酸咪唑基。v焦炭酸二乙酯（焦炭酸二乙酯（DPC）是最常用的试剂。）是最
16、常用的试剂。.碘代乙酸碘代乙酸也可以对咪唑基上的碳进行亲核取代也可以对咪唑基上的碳进行亲核取代.（5）胍基的化学修饰）胍基的化学修饰二酮二酮 环乙二酮环乙二酮苯酰甲醛苯酰甲醛v该反应本质上是羰基对氨基酰基化。该反应本质上是羰基对氨基酰基化。v该反应一般可逆，需加硼酸盐使产物与之该反应一般可逆，需加硼酸盐使产物与之反应而稳定下来。但苯酰甲醛时反应不可反应而稳定下来。但苯酰甲醛时反应不可逆，不需加硼酸盐。逆，不需加硼酸盐。.（6）二硫键的化学修饰）二硫键的化学修饰氧化：过甲酸氧化：过甲酸还原：巯基乙醇还原：巯基乙醇.DTT DTT 二硫苏糖醇二硫苏糖醇 DTT DTT是目前最常用的是目前最常用的二
17、硫键修饰剂和巯基保二硫键修饰剂和巯基保护剂护剂。.三、酶的亲和修饰三、酶的亲和修饰 亲和标记是最有意义的一种亲和标记是最有意义的一种化学修饰化学修饰，这，这是因为它可以是很是因为它可以是很专一性专一性的作用于酶的活的作用于酶的活性部位。亲和标记是性部位。亲和标记是分步反应分步反应，修饰剂先，修饰剂先可逆的可逆的结合在酶的活性部位，再结合在酶的活性部位，再不可逆的不可逆的修饰该部位特定基团，一般是必需基团，修饰该部位特定基团，一般是必需基团，而造成不可逆失活，亲和标记修饰剂一般而造成不可逆失活，亲和标记修饰剂一般是是底物类似物底物类似物，和底物含有共同的结合于，和底物含有共同的结合于酶的基团，亲
18、和标记的作用符合酶的基团，亲和标记的作用符合饱和动力饱和动力学学特征，可以把亲和标记过程看作是一次特征，可以把亲和标记过程看作是一次自杀性酶反应自杀性酶反应。.v亲和试剂亲和试剂一般是具有化学反应性的蛋白质一般是具有化学反应性的蛋白质分子的底物或配体的类似物。分子的底物或配体的类似物。v亲和标记试剂在酶上有特定的结合部位，亲和标记试剂在酶上有特定的结合部位，其解离常数也易于测定，可以提供酶的结其解离常数也易于测定，可以提供酶的结构信息，是理论研究中一类常用的修饰剂。构信息，是理论研究中一类常用的修饰剂。v亲和标记试剂一般在较低浓度下有效修饰亲和标记试剂一般在较低浓度下有效修饰酶，改变酶的活性，
19、特别是专一性较强，酶，改变酶的活性，特别是专一性较强，是药物等的优良候选者，有广泛的应用价是药物等的优良候选者，有广泛的应用价值。值。.1 1、光亲和标记、光亲和标记 特点：具有光反应基团。特点：具有光反应基团。这种试剂先与酶这种试剂先与酶活性部位在暗条件下发生特异性结合，然活性部位在暗条件下发生特异性结合，然后被光照激活后，产生一个非常活泼的功后被光照激活后，产生一个非常活泼的功能基团，其能与他们附近的几乎所有基团能基团，其能与他们附近的几乎所有基团反应，形成一个共价的标记物。反应，形成一个共价的标记物。.2、专一性的不可逆抑制剂、专一性的不可逆抑制剂 亲和试剂可以专一性地标记于酶的活性部亲
20、和试剂可以专一性地标记于酶的活性部位，使酶不可逆失活，因此，位，使酶不可逆失活，因此，称为专一性称为专一性的不可逆抑制。的不可逆抑制。.（1 1）KsKs型抑制剂：型抑制剂：根据底物的结构设计，具根据底物的结构设计，具有和底物的结构相似的结合基团，同时也有和底物的结构相似的结合基团，同时也可以和酶的活性部位发生特异性结合，并可以和酶的活性部位发生特异性结合，并且能够对活性部位侧链基团进行修饰，导且能够对活性部位侧链基团进行修饰，导致酶不可逆失活。致酶不可逆失活。（2 2）KcatKcat型抑制剂：型抑制剂：根据酶催化过程设计，根据酶催化过程设计，它具有酶的底物性质，还有一个潜在的反它具有酶的底
21、物性质，还有一个潜在的反应基团在酶的催化活化后不可逆抑制酶的应基团在酶的催化活化后不可逆抑制酶的活性部位，因此也称为活性部位，因此也称为“自杀性抑制剂自杀性抑制剂”。.四、有机大分子对酶的化学修饰四、有机大分子对酶的化学修饰 利用水溶性大分子与酶结合，使酶的空间利用水溶性大分子与酶结合，使酶的空间结构发生某些精细的改变，从而改变酶的结构发生某些精细的改变，从而改变酶的特性与功能的方法称为特性与功能的方法称为大分子结合修饰法，大分子结合修饰法，简称为大分子结合法。简称为大分子结合法。.1、聚乙二醇、聚乙二醇 聚乙二醇是线性分子具有良好的生物相容性和聚乙二醇是线性分子具有良好的生物相容性和水溶性，
22、在体内水溶性，在体内无毒性、无残留、无免疫原性无毒性、无残留、无免疫原性，并可消除酶的抗原性，使其末端活化后可以与并可消除酶的抗原性，使其末端活化后可以与酶产生交联，因而，它被酶产生交联，因而，它被广泛用于广泛用于酶的修饰。酶的修饰。.天然天然SODSOD：半衰期：半衰期6min6min右旋糖酐修饰后：半衰期右旋糖酐修饰后：半衰期7h7hPEGPEG修饰：半衰期修饰：半衰期35h35h.过程：过程：v活化活化：修饰剂中含有的基团需要经过活化，然后：修饰剂中含有的基团需要经过活化，然后才可以与酶分子的某侧链基团进行反应。才可以与酶分子的某侧链基团进行反应。v修饰：修饰：将带有活化基团的大分子修饰
23、剂与经过分将带有活化基团的大分子修饰剂与经过分离纯化的酶液，以一定的比例混合，在一定的温离纯化的酶液，以一定的比例混合，在一定的温度、度、pHpH值等条件下反应一段时间，使修饰剂的活值等条件下反应一段时间，使修饰剂的活化基团与酶分子的某侧链基团以共价键结合，对化基团与酶分子的某侧链基团以共价键结合，对酶分子进行修饰。酶分子进行修饰。v分离：分离：需要通过凝胶层析等方法进行分离，将具需要通过凝胶层析等方法进行分离，将具有不同修饰度的酶分子分开，从中获得具有较好有不同修饰度的酶分子分开，从中获得具有较好修饰效果的修饰酶修饰效果的修饰酶.（1）三氯均嗪法）三氯均嗪法v三氯均嗪环上的氯原子很活泼，容易
24、产生三氯均嗪环上的氯原子很活泼，容易产生亲核取代反应。亲核取代反应。v当环上的一个氯原子被取代后，能够稳定当环上的一个氯原子被取代后，能够稳定其他的碳其他的碳-氯键（第一个氯原子在氯键（第一个氯原子在44就能就能反应，第二个氯原子在反应，第二个氯原子在25 25 反应，第三个反应，第三个氯原子在氯原子在8080反应）。反应）。.（2）叠氮法）叠氮法 将将PEGPEG链端羟基转化成叠氮基，然后与酶链端羟基转化成叠氮基，然后与酶反应。反应。v PEGPEG甲氧甲酰甲酯制备：甲氧甲酰甲酯制备：PEGPEG与氯醋酸酐及与氯醋酸酐及重氮甲烷发生反应生成重氮甲烷发生反应生成PEGPEG甲氧甲酰甲酯。甲氧甲
25、酰甲酯。v PEGPEG酰肼的制备：反应产物与肼反应生成酰肼的制备：反应产物与肼反应生成相应的酰肼化合物。相应的酰肼化合物。PEGPEG羧甲基叠氮化物制备：羧甲基叠氮化物制备：PEGPEG酰肼化合物酰肼化合物经亚硝酸作用生成活化经亚硝酸作用生成活化PEGPEG。.（3）琥珀酸酐法）琥珀酸酐法二溴琥珀酸作为二溴琥珀酸作为PEGPEG的活化剂。的活化剂。v PEGPEG活化反应活化反应 修饰反应修饰反应.（4）重氮法）重氮法 将修饰剂上有关基团转变为重氮基团，然将修饰剂上有关基团转变为重氮基团，然后在弱碱条件下与酶分子上的酚基、咪唑后在弱碱条件下与酶分子上的酚基、咪唑基等反应，生成修饰酶。基等反应
26、，生成修饰酶。v PEGPEG活化反应活化反应v 修饰反应修饰反应.2、右旋糖酐及右旋糖酐酯、右旋糖酐及右旋糖酐酯 右旋糖酐属于菌多糖，是由右旋糖酐属于菌多糖，是由-葡萄糖通过葡萄糖通过-1,6-1,6糖苷键形成的高分子糖，具有较好糖苷键形成的高分子糖，具有较好的水溶性和生物相容性，可用作代血浆。的水溶性和生物相容性，可用作代血浆。（1）溴化氢法）溴化氢法（2）高碘酸氧化法）高碘酸氧化法.3、糖肽、糖肽v糖肽一般是通过纤维蛋白酶或蛋白水解酶糖肽一般是通过纤维蛋白酶或蛋白水解酶降解人纤维蛋白或降解人纤维蛋白或-球蛋白而得。球蛋白而得。v糖肽结构上有氨基，经活化后能与酶分子糖肽结构上有氨基，经活化
27、后能与酶分子上氨基反应而产生共价结合。上氨基反应而产生共价结合。（1 1）异氰酸法）异氰酸法（2 2）戊二醛法）戊二醛法.4 4、具有生物活性的大分子物质、具有生物活性的大分子物质 肝素是一种含硫酸酯的黏多糖，由氨基葡肝素是一种含硫酸酯的黏多糖，由氨基葡萄糖和两种糖醛酸组成，平均分子量萄糖和两种糖醛酸组成，平均分子量20002000左右。肝素共价交联酶后可增加酶的稳定左右。肝素共价交联酶后可增加酶的稳定性，同时由于肝素在生物体内还具有抗凝性，同时由于肝素在生物体内还具有抗凝血、抗血栓、降血脂等活性。血、抗血栓、降血脂等活性。v羧二亚胺法羧二亚胺法v溴化氢法溴化氢法v三均嗪法三均嗪法.5、蛋白质
28、类及其他、蛋白质类及其他 血浆蛋白是血浆中的天然成分，它们和其血浆蛋白是血浆中的天然成分，它们和其他蛋白（包括酶类）的复合物在血液中可他蛋白（包括酶类）的复合物在血液中可能被视为能被视为“自体蛋白自体蛋白”而被接受。而被接受。.6、酶的化学交联、酶的化学交联 交联剂交联剂是具有两个反应活性部位的双功能是具有两个反应活性部位的双功能基团，可以在相隔较近的两个氨基酸残基基团，可以在相隔较近的两个氨基酸残基之间，或酶与其他分子之间发生交联反应。之间，或酶与其他分子之间发生交联反应。v同型双功能试剂同型双功能试剂v异性双功能试剂异性双功能试剂v可被光活化试剂可被光活化试剂.五、修饰酶的性质及特点五、修
29、饰酶的性质及特点1 1、热稳定性、热稳定性热稳定性增加热稳定性增加v修饰剂与酶多点交联，固定了酶的分子构修饰剂与酶多点交联，固定了酶的分子构象，增强了酶的热稳定性象，增强了酶的热稳定性。v增强酶天然构象的稳定性减少了酶热失活。增强酶天然构象的稳定性减少了酶热失活。但但PEGPEG修饰后热稳定性修饰后热稳定性没有明显提高没有明显提高，原因：，原因：PEGPEG与酶是单点交联，相对难以产生固定的酶分子结与酶是单点交联，相对难以产生固定的酶分子结构。构。.2、抗原性、抗原性 部分可消除。比较公认的是部分可消除。比较公认的是PEGPEG和人血清白和人血清白蛋白在消除酶的抗原性上效果比较明显。蛋白在消除
30、酶的抗原性上效果比较明显。3 3、最适、最适pHpH值值 部分酶经化学修饰后，酶的最适部分酶经化学修饰后，酶的最适pHpH发生了发生了变化，这种变化在应用研究上有时具有重变化，这种变化在应用研究上有时具有重要意义。修饰酶最适要意义。修饰酶最适pHpH更接近于生理环境，更接近于生理环境，在临床应用上有较大意义。在临床应用上有较大意义。.4 4、酶学性质的变化、酶学性质的变化 绝大多数酶经过修饰后，最大反应速度没绝大多数酶经过修饰后，最大反应速度没有改变，但有些酶在修饰后，米氏常数会有改变，但有些酶在修饰后，米氏常数会增大。增大。5 5、对组织的分布能力变化、对组织的分布能力变化 对组织的分布能力
31、有所改变，能在血液中对组织的分布能力有所改变，能在血液中被靶器官选择性地吸收。被靶器官选择性地吸收。.第二节第二节 酶的分子定向进化酶的分子定向进化 蛋白质工程：蛋白质工程：利用基因工程手段对酶的蛋白质分子利用基因工程手段对酶的蛋白质分子改造，以期获得性质和功能更加完善的蛋白质分子。改造，以期获得性质和功能更加完善的蛋白质分子。v酶分子的合理设计酶分子的合理设计(rational design)(rational design)：利用各种利用各种生物化学、晶体学、光谱学等方法对天然酶或其突生物化学、晶体学、光谱学等方法对天然酶或其突变体进行研究，从而获得变体进行研究，从而获得酶分子特征、空间结
32、构、酶分子特征、空间结构、结构和功能之间关系以及氨基酸残基功能结构和功能之间关系以及氨基酸残基功能等方面的等方面的信息，以此为依据对酶分子进行改造。如：化学突信息，以此为依据对酶分子进行改造。如：化学突变、定点突变等变、定点突变等v酶分子的非合理设计：酶分子的非合理设计：不需要准确的酶分子结构信不需要准确的酶分子结构信息而通过随机突变、基因重组、定向筛选等方法进息而通过随机突变、基因重组、定向筛选等方法进行改造。如行改造。如:定向进化、杂合进化。定向进化、杂合进化。.定向进化示意图定向进化示意图随机突变随机突变+定向选择目标突变体定向选择目标突变体细菌细菌诱发突变的诱发突变的因素因素5050
33、0 0C C培养培养突变体库突变体库选择压力选择压力（温度）（温度）温度耐受型突温度耐受型突变体变体最适生长温度为最适生长温度为37370 0C C最适生长温度提高了！最适生长温度提高了！.自然进化自然进化是在整个有机体是在整个有机体繁殖和存活的过程中自发繁殖和存活的过程中自发出现的一个非常缓慢的过出现的一个非常缓慢的过程。自然选择使进化向有程。自然选择使进化向有利于生物适应生存环境的利于生物适应生存环境的方向发展。环境的多样性方向发展。环境的多样性和适应方式的多样性决定和适应方式的多样性决定了进化方向的多样性。了进化方向的多样性。我们可以在实验室中我们可以在实验室中模仿自然进化的关键步模仿自
34、然进化的关键步骤骤突变、重组和筛选突变、重组和筛选,在较短时间内完成漫长的在较短时间内完成漫长的自然进化过程自然进化过程,有效地改有效地改造蛋白质造蛋白质,使之适于人类使之适于人类的需要。的需要。.酶具有进化潜力的原因：酶具有进化潜力的原因：v生物体环境与实际运用环境不同生物体环境与实际运用环境不同v希望具有更高的活性和稳定性希望具有更高的活性和稳定性v非生物体内涉及的蛋白性质非生物体内涉及的蛋白性质.PCRPCR的基本原理的基本原理DNA模板DNA引物dNTPTaqDNA聚合酶1234522557294时间（min）温度（）适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增
35、100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍.PCRPCR的基本原理的基本原理vPCR反应条件vPCR过程vPCR的特点1234522557294时间（min）温度（）适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性子链延伸DNA加倍DNA变性形成2条单链模板DNA95.PCRPCR的基本原理的基本原理vPCR反应条件vPCR过程vPCR的特点9550引物1引物2DNA引物.PCRPCR的基本原理的基本原理vPCR反应条件vPCR过程vPCR的特点50引物1引物2DNA引物72Taq酶T
36、aq酶.PCRPCR的基本原理的基本原理vPCR反应条件vPCR过程vPCR的特点72第1轮结束95第2轮开始.PCRPCR的基本原理的基本原理vPCR反应条件vPCR过程vPCR的特点955072TaqTaqTaqTaq.PCRPCR的基本原理的基本原理vPCR反应条件vPCR过程vPCR的特点72第2轮结束.vPCR反应条件vPCR过程vPCR的特点重复30轮后230=1,073,741,824模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增 第5轮扩增第6轮扩增理想拷贝数=2n n 循环次数实际拷贝数=(1+x)n X 平均效率,约为0.85 n 循环次数.二、二、定向进化的策略定向进
37、化的策略1 1、以易错、以易错PCRPCR技术为代表的无性进化技术为代表的无性进化 易错易错PCR(error pronePCR)PCR(error pronePCR)是指在扩增目的是指在扩增目的基因的同时引入碱基错配基因的同时引入碱基错配,导致目的基因随导致目的基因随机突变。然而机突变。然而,经一次突变的基因很难获得经一次突变的基因很难获得满意的结果，由此发展出连续易错满意的结果，由此发展出连续易错PCRPCR策略。策略。即将一次即将一次PCRPCR扩增得到的有用突变基因作为扩增得到的有用突变基因作为下一次下一次PCRPCR扩增的模板，连续反复地进行随扩增的模板，连续反复地进行随机诱变机诱变
38、,使每一次获得的小突变累积而产生使每一次获得的小突变累积而产生重要的有益突变。遗传变化只发生在单一重要的有益突变。遗传变化只发生在单一分子内部，故属于无性进化。分子内部，故属于无性进化。.化学诱变剂介导的随机诱变化学诱变剂介导的随机诱变 体外随机诱变也可在体外随机诱变也可在6565下直接用羟胺处下直接用羟胺处理带有目的基因片段的质粒，然后用限制理带有目的基因片段的质粒，然后用限制性内切酶切下突变了的基因片段，再克隆性内切酶切下突变了的基因片段，再克隆到表达载体中进行功能的筛选。到表达载体中进行功能的筛选。.由致突变菌株产生随机突变由致突变菌株产生随机突变 美国美国StrategenStrate
39、gen公司构建了一株公司构建了一株DNADNA修复途修复途径缺陷的大肠杆菌突变株径缺陷的大肠杆菌突变株XL1 RED,XL1 RED,它体内它体内的的DNADNA突变率比野生型高五千倍。将带有要突变率比野生型高五千倍。将带有要突变基因的质粒转化到突变基因的质粒转化到XL1 REDXL1 RED菌株内复制菌株内复制过夜过夜,在此过程中会产生随机突变。每两千在此过程中会产生随机突变。每两千个碱基中通常约有一个碱基置换。将带有个碱基中通常约有一个碱基置换。将带有突变过的基因的质粒转化到表达系统中进突变过的基因的质粒转化到表达系统中进行筛选。行筛选。.2 2、以、以DNADNA改组技术为代表的有性进化
40、改组技术为代表的有性进化（1 1）DNADNA改组改组 1994 1994年年,Stemmer,Stemmer等首先使用等首先使用DNADNA改组完成体外重改组完成体外重组。组。DNADNA改组是将一群密切相关的序列改组是将一群密切相关的序列(如多种同如多种同源而有差异的基因或一组突变基因文库源而有差异的基因或一组突变基因文库)在在DNaseIDNaseI的作用下随机酶切成小片段的作用下随机酶切成小片段,这些小片段之间有部这些小片段之间有部分的碱基序列重叠分的碱基序列重叠,它们通过自身引导它们通过自身引导PCRPCR延伸延伸,并并重新组装成全长的基因重新组装成全长的基因,这一过程被称为这一过程
41、被称为再组装再组装PCRPCR。该过程所产生的相关序列间的交换归因于模。该过程所产生的相关序列间的交换归因于模板的转换。板的转换。DNADNA改组过程中也可能引入新的点突变。改组过程中也可能引入新的点突变。因此因此,仅仅DNADNA改组就可以有效地从单一基因序列开改组就可以有效地从单一基因序列开始进行蛋白质的定向进化。始进行蛋白质的定向进化。.DNA shuffling.体体外外定定向向进进化化.改组具有以下有用的特征改组具有以下有用的特征:v它可以利用现存的有利突变它可以利用现存的有利突变,快速积累不同的有利快速积累不同的有利突变。突变。v重组可伴随点突变同时发生。重组可伴随点突变同时发生。
42、v可以删除个体中的有害突变和中性突变。可以删除个体中的有害突变和中性突变。.（2）体外随机引导重组）体外随机引导重组v19981998年年,Arnold,Arnold提出了一种有效的新方法提出了一种有效的新方法随机随机引导重组引导重组(RPR)(RPR)。vRPRRPR的原理是的原理是:用随机序列的引物来产生互补于模用随机序列的引物来产生互补于模板序列不同部分的大量的板序列不同部分的大量的DNADNA小片段。由于碱基的小片段。由于碱基的错误掺入和错误引导错误掺入和错误引导,这些这些DNADNA的小片段中也因之的小片段中也因之而含有少量的点突变。而含有少量的点突变。DNADNA小片段之间可以相互
43、同小片段之间可以相互同源引导和重组。在源引导和重组。在DNADNA聚合酶作用下聚合酶作用下,经反复的热经反复的热循环可重新组装成全长的基因循环可重新组装成全长的基因,克隆到表达载体上克隆到表达载体上,随后筛选。随后筛选。.与与DNADNA改组相比，改组相比，RPRRPR技术具有以下优点技术具有以下优点:vRPRRPR可直接利用单链可直接利用单链DNADNA或或NANA作模板，所需作模板，所需亲代亲代DNADNA比比DNADNA改组所需的量少改组所需的量少10201020倍。倍。vDNADNA改组利用改组利用DNaseIDNaseI随机切割双链随机切割双链DNADNA模板模板,在在DNADNA片
44、段重新组装成全长序列之前片段重新组装成全长序列之前,DNaseI,DNaseI必须必须去除干净。一般说来去除干净。一般说来,RPR,RPR技术使基因的重新组技术使基因的重新组装更容易。装更容易。v合成的随机引物长度一致并缺乏序列的偏向性合成的随机引物长度一致并缺乏序列的偏向性,保证了点突变和交换在全长的后代基因中的随保证了点突变和交换在全长的后代基因中的随机性。机性。v随机引导的随机引导的DNADNA合成不受合成不受DNADNA模板长度的影响模板长度的影响,这这给小肽的改造提供了机会。给小肽的改造提供了机会。.（3）交错延伸技术）交错延伸技术 1998 1998年，年，ArnoldArnold
45、等人又建立了一种新的体外重等人又建立了一种新的体外重组方法组方法交错延伸技术交错延伸技术:用用PCRPCR同时扩增多个拟重同时扩增多个拟重组的模板序列时组的模板序列时,在热循环中大大缩短退火与聚合在热循环中大大缩短退火与聚合酶催化延伸的时间。在每一循环中酶催化延伸的时间。在每一循环中,不断延长的片不断延长的片段根据序列的互补性与不同模板退火段根据序列的互补性与不同模板退火,并进一步延并进一步延伸。反复重复直到全长序列形成。由于模板的转伸。反复重复直到全长序列形成。由于模板的转换换,大多数多核苷酸含有不同亲本的序列信息。该大多数多核苷酸含有不同亲本的序列信息。该技术已成功地重组了由易错技术已成功
46、地重组了由易错PCRPCR产生的产生的5 5个热稳定个热稳定的枯草杆菌蛋白酶的突变体的枯草杆菌蛋白酶的突变体,得到了热稳定性进得到了热稳定性进一步提高的重组酶。一步提高的重组酶。.（4）SCRATCH技术技术v SCRATCHSCRATCH技术是将技术是将DNADNA改组技术与增加片段化杂合酶法改组技术与增加片段化杂合酶法（ITCHYITCHY）相结合的技术。）相结合的技术。vStefanStefan等用等用E.coliE.coli的甘氨酰胺核苷酸甲醛转移酶的甘氨酰胺核苷酸甲醛转移酶基因和人甘氨酰胺核苷酸甲醛转移酶基因分别构基因和人甘氨酰胺核苷酸甲醛转移酶基因分别构建建pDIM GPXpDIM
47、 GPX质粒，接着采用能增加断点的核苷酸质粒，接着采用能增加断点的核苷酸类似物的方法进行类似物的方法进行PCRPCR扩增，构建其文库，然后转扩增，构建其文库，然后转化到化到E.coli E.coli DH5DH5进行进行PCRPCR扩增和改组，再转化到扩增和改组，再转化到营养缺陷型营养缺陷型E.coli E.coli TX680FTX680F进行活性杂合子筛选，进行活性杂合子筛选，并对其并对其DNADNA序列进行分析，序列进行分析，v 主要特点：主要特点：不依赖基因序列的同源性而产生多个不依赖基因序列的同源性而产生多个DNADNA杂交杂交位点。位点。.（5 5）临时模板随机嵌合生长）临时模板随
48、机嵌合生长 RACHITT RACHITT技术是与技术是与DNA shufflingDNA shuffling概念上明概念上明显不同的、改进的基因家族重组技术显不同的、改进的基因家族重组技术.它不它不包括热循环、链转移或交错延伸反应包括热循环、链转移或交错延伸反应,而是而是将随机切割的基因片段杂交到一个临时将随机切割的基因片段杂交到一个临时DNADNA模板上进行排序、修剪、空隙填补和连接模板上进行排序、修剪、空隙填补和连接.其中的悬垂切割步骤使短片段其中的悬垂切割步骤使短片段(比比DNaseDNase消消化片段还短化片段还短)得以重组得以重组,明显提高了重组频明显提高了重组频率；如果在片段重组
49、前后采用错误倾向率；如果在片段重组前后采用错误倾向PCRPCR还可引入额外点突变。还可引入额外点突变。.CoCo CoCo等首次报道此法改造二苯并噻吩单加等首次报道此法改造二苯并噻吩单加氧酶氧酶,产生的嵌合文库平均每个基因含产生的嵌合文库平均每个基因含1414个个交叉交叉,重组水平比重组水平比DNA shufflingDNA shuffling类方法类方法(1(14 4个交叉个交叉)高出几倍；并且可在短至高出几倍；并且可在短至5bp5bp的序列同一区内产生交叉。这种高频率、的序列同一区内产生交叉。这种高频率、高密度的交叉水平是高密度的交叉水平是DNA shufflingDNA shufflin
50、g所难以所难以达到的。达到的。.（6 6）酵母增强组合文库）酵母增强组合文库 CLERY CLERY是一个真核基因家族是一个真核基因家族shufflingshuffling策略策略.其原理是其原理是将体外将体外DNA shufflingDNA shuffling程序与接下程序与接下来的酵母体内重组缔合起来来的酵母体内重组缔合起来,构建高丰度低构建高丰度低亲本水平的重组文库亲本水平的重组文库:直接以含目的基因的直接以含目的基因的质粒作为体外质粒作为体外shufflingshuffling的模板的模板;shufflingshuffling后基因产物与线性化的酵母表达后基因产物与线性化的酵母表达载体
