1、授课人：XX XX XX学院 XX 专业【全套课件全套课件】第一编第一编 概概 述述第二编第二编 纯化方法纯化方法第三编第三编 鉴定方法鉴定方法 第一编第一编 概概 述述第一章第一章 生命大分子物质的制备生命大分子物质的制备第一节第一节 材料的选择与处理材料的选择与处理第二节第二节 确定测定方法确定测定方法第三节第三节 细胞的破碎细胞的破碎第四节第四节 抽提抽提第五节第五节 浓缩浓缩第六节第六节 纯化方案的设计与评价纯化方案的设计与评价第七节第七节 有效成分纯度和性质的分析有效成分纯度和性质的分析第八节第八节 应用实例应用实例一、材料的选择一、材料的选择二、材料的处理二、材料的处理一、材料的选
2、择一、材料的选择有效成分：指欲纯化的某种单一的生命有效成分：指欲纯化的某种单一的生命 大分子物质。有效成分具有含量少和稳定大分子物质。有效成分具有含量少和稳定性差的特性。性差的特性。材料选择原则材料选择原则(1)含量多、稳定性好；含量多、稳定性好；(2)来源丰富、保持新鲜；来源丰富、保持新鲜；(3)工艺简单、有利用价值。工艺简单、有利用价值。二、材料的处理二、材料的处理 1 1、动物脏器：、动物脏器：(1)(1)冰冻：短时间零下冰冻：短时间零下1010冰库或零下冰库或零下70 70 低温冰箱（数月）贮存；低温冰箱（数月）贮存；(2)(2)脱脂：人工剥离；有机溶剂；快冷快热；脱脂：人工剥离；有机
3、溶剂；快冷快热；脂肪分离器；脂肪分离器；(3)(3)干燥：丙酮中脱水；沸水中蒸煮烘干干燥：丙酮中脱水；沸水中蒸煮烘干。2 2、植物组织：、植物组织：(1)(1)叶片：水洗净或在叶片：水洗净或在1010小时内置零下小时内置零下4 4 到零下到零下30 30 冰箱贮藏备用冰箱贮藏备用;(2)(2)种子：泡胀或粉碎。种子：泡胀或粉碎。3 3、微生物：、微生物：(1)(1)胞内活性分子：离心法收集上清液，低温胞内活性分子：离心法收集上清液，低温下短时间贮存下短时间贮存;(2)(2)胞外活性分子：经破细胞膜处理后提取，胞外活性分子：经破细胞膜处理后提取，制成冻干粉。制成冻干粉。一、一、目的和要求目的和要
4、求二、二、常用的测定方法常用的测定方法确定的方法简单、灵敏、需时少、专一性确定的方法简单、灵敏、需时少、专一性二、常用的测定方法二、常用的测定方法 1.1.光谱法光谱法(1)(1)吸收光谱法吸收光谱法（absorption spectrophotometry)absorption spectrophotometry)直接测定法：将待测物配制成一定浓度的溶液直接测定法：将待测物配制成一定浓度的溶液 移至分光光度计，读取吸光度。移至分光光度计，读取吸光度。吸光度与待测物吸光度与待测物 浓度成正比浓度成正比。例如：总蛋白含量的测定。例如：总蛋白含量的测定。比色法（间接法）：将待测物与相关试剂或酶的比
5、色法（间接法）：将待测物与相关试剂或酶的 底物作用后，移至分光光度计，读取吸光度。例如：底物作用后，移至分光光度计，读取吸光度。例如：酶活性的测定。酶活性的测定。(2)(2)荧光光谱法荧光光谱法(fluo-spectrophotometry)fluo-spectrophotometry)激发光激发待测物质发射发射光，读取激发光激发待测物质发射发射光，读取 荧光强度。荧光强度。荧光强度与待测物质浓度成正荧光强度与待测物质浓度成正 比比。荧光光谱法的精确性、重复性和灵敏。荧光光谱法的精确性、重复性和灵敏 度比吸收光谱法好。度比吸收光谱法好。例如：乙醇中蒽的测定例如：乙醇中蒽的测定。(3)(3)浊度
6、法浊度法 极稀的悬浮液采用此法，测定悬浮液在极稀的悬浮液采用此法，测定悬浮液在不被吸收的波长不被吸收的波长下表现的消光值。下表现的消光值。2.2.电化学法电化学法 有些反应可放出质子氢，可用有些反应可放出质子氢，可用PHPH计或计或NaOHNaOH滴定等方法追踪变化计算出待测物的滴定等方法追踪变化计算出待测物的含量。含量。3.3.生物活性检测法生物活性检测法 细胞或动物摄入待测物质后，待测物质细胞或动物摄入待测物质后，待测物质摄入量与细胞或动物的生理指标变化有相摄入量与细胞或动物的生理指标变化有相关性，以此检测待测物质含量。关性，以此检测待测物质含量。4.4.免疫分析法免疫分析法 利用抗原与抗
7、体的特异性反应，并结合利用抗原与抗体的特异性反应，并结合生物标记，可对待测物质进行定量定性分生物标记，可对待测物质进行定量定性分析。析。5.5.生物传感器生物传感器 用生物传感器中的敏感膜与待测物质反用生物传感器中的敏感膜与待测物质反应，可通过显示器反映有效成分的含量。应，可通过显示器反映有效成分的含量。/nmlogloglogmax2max1第三节第三节 细胞的破碎细胞的破碎1.1.物理方法物理方法 2.2.化学处理化学处理 3.3.生物方法生物方法 1.1.物理方法物理方法（1 1）研磨法：研钵，匀浆器）研磨法：研钵，匀浆器（2 2）捣碎法：捣碎器）捣碎法：捣碎器（3 3）超声波法：）超声
8、波法：超声仪超声仪（4 4）压榨法）压榨法:挤压挤压（5 5）冻融法：低温冷冻迅速取出）冻融法：低温冷冻迅速取出2.2.化学处理化学处理（1 1）脂溶性溶剂：丙酮；氯仿；甲苯）脂溶性溶剂：丙酮；氯仿；甲苯（2 2）表面活性剂：十二烷甲基黄酸钠；十）表面活性剂：十二烷甲基黄酸钠；十 二烷基硫酸钠二烷基硫酸钠3.3.生物方法生物方法 （1 1）溶胀）溶胀（2 2）自溶）自溶（3 3）生物酶降解：溶菌酶；蛋白水解酶）生物酶降解：溶菌酶；蛋白水解酶K K第四节第四节 抽提抽提一一.抽提的含义抽提的含义二二.抽提有效成分的影响因子抽提有效成分的影响因子 一、抽提的含义一、抽提的含义 用适当的溶剂和方法，
9、从原料中把用适当的溶剂和方法，从原料中把有效成分分离出来的过程。有效成分分离出来的过程。用缓冲液，用缓冲液，稀酸，稀碱或有机溶剂（丙酮，乙醇）稀酸，稀碱或有机溶剂（丙酮，乙醇）等抽提，有时还可以用蒸馏水抽提。等抽提，有时还可以用蒸馏水抽提。二二.抽提有效成分的影响因子抽提有效成分的影响因子1.PH1.PH值值2.2.溶剂的极性和离子强度溶剂的极性和离子强度3.3.水解酶水解酶4.4.温度：选择合适的抽提温度温度：选择合适的抽提温度5.5.搅拌：温和搅拌可增加溶解度搅拌：温和搅拌可增加溶解度 6.6.氧化氧化7.7.金属离子金属离子8.8.抽提液与抽提物的比例抽提液与抽提物的比例:1:5:1:5
10、 1.PH1.PH值值 对蛋白质或酶等具有等电点的两性电对蛋白质或酶等具有等电点的两性电解质物质，选择抽提液的解质物质，选择抽提液的PHPH值在偏离等电值在偏离等电点。点。2.2.溶剂的极性和离子强度溶剂的极性和离子强度有些蛋白质或酶在极性大、离子强度大的溶液有些蛋白质或酶在极性大、离子强度大的溶液中稳定，有些则相反中稳定，有些则相反加入蔗糖、甘油、加入蔗糖、甘油、DMSODMSO降低溶液极性降低溶液极性加入加入KCLKCL、NaCLNaCL、NH4CLNH4CL升高溶液离子强度升高溶液离子强度3.3.水解酶水解酶 为防止酶与欲抽提的蛋白质或核酸发生为防止酶与欲抽提的蛋白质或核酸发生反应，采取
11、以下措施：反应，采取以下措施：(1)(1)加入加入PMSFPMSF等酶抑制剂；等酶抑制剂；(2)(2)调节抽提液的极性、离子强度和调节抽提液的极性、离子强度和PHPH值。值。6.6.氧化氧化一般蛋白质或酶含有必需集团巯基，若抽提液一般蛋白质或酶含有必需集团巯基，若抽提液 中存在氧化剂或氧分子时，会使巯基形成分子内或中存在氧化剂或氧分子时，会使巯基形成分子内或分子间二硫键，导致蛋白质变性。为此，常加入分子间二硫键，导致蛋白质变性。为此，常加入2-2-巯基乙醇、半胱氨酸还原剂。巯基乙醇、半胱氨酸还原剂。植物组织和微生物细胞中含酚类物质，在多酚氧化植物组织和微生物细胞中含酚类物质，在多酚氧化酶作用下
12、，可变为有色的醌类物质。加入苯基硫脲，酶作用下，可变为有色的醌类物质。加入苯基硫脲，可抑制这一反应。可抑制这一反应。7.7.金属离子金属离子 蛋白质的巯基还能与源于缓冲液金属离子铅、蛋白质的巯基还能与源于缓冲液金属离子铅、铁、铜作用，产生沉淀。解决办法：铁、铜作用，产生沉淀。解决办法：无离子水配制缓冲液无离子水配制缓冲液 加入加入1-31-3mM EDTAmM EDTA一一.沉淀法沉淀法二二.吸附法吸附法三三.超过滤法超过滤法四四.透析法透析法五五.减压蒸馏法减压蒸馏法六六.冰冻干燥法冰冻干燥法 一一.沉淀法沉淀法 抽提液中加入适量的中性盐如硫酸氨或抽提液中加入适量的中性盐如硫酸氨或有机溶剂有
13、机溶剂,使有效成分沉淀，离心除去不使有效成分沉淀，离心除去不溶物，获得上清透析或层析柱去盐。溶物，获得上清透析或层析柱去盐。二二.吸附法吸附法 干葡聚糖凝胶干葡聚糖凝胶G25G25或吸水棒加入抽提液，或吸水棒加入抽提液，两者比例一比五，能缩小抽提液体积三两者比例一比五，能缩小抽提液体积三倍左右倍左右.三三.超过滤法超过滤法 在空气或氮气压力下，使小分子物质通在空气或氮气压力下，使小分子物质通过半透膜而大分子物质留在膜内的过半透膜而大分子物质留在膜内的装置。装置。四四.透析法透析法（1 1）把装透析液的透析袋埋在吸水力强的）把装透析液的透析袋埋在吸水力强的 聚乙二醇聚乙二醇PEGPEG或甘油中；
14、或甘油中；（2 2）真空透析。）真空透析。五五.减压蒸馏法减压蒸馏法 简易减压蒸馏装置（降低沸点）简易减压蒸馏装置（降低沸点）.六六.冰冻干燥法冰冻干燥法 冰冻的抽提液在真空状态下，可由固体冰冻的抽提液在真空状态下，可由固体直接变为气体。直接变为气体。第六节第六节 纯化方案的设计与评价纯化方案的设计与评价一一.纯化方案的设计纯化方案的设计二二.纯化方案的评价纯化方案的评价一一.纯化方案的设计纯化方案的设计纯化的总原则：考虑抽提液中有效成分与纯化的总原则：考虑抽提液中有效成分与杂质的理化性质差异，几种方法组成一个杂质的理化性质差异，几种方法组成一个科学合理的纯化方案科学合理的纯化方案切忌：一种方
15、法重复使用切忌：一种方法重复使用二二.纯化方案的评价纯化方案的评价 考察比活力、纯化倍数和收得率考察比活力、纯化倍数和收得率第二编第二编 纯化方法纯化方法第二章第二章 沉淀法沉淀法第三章第三章 吸附层析吸附层析第四章第四章 疏水层析疏水层析第五章第五章 离子交换层析离子交换层析第六章第六章 凝胶过滤凝胶过滤第七章第七章 亲和层析亲和层析第八章第八章 聚焦层析聚焦层析第九章第九章 高效液相色谱高效液相色谱第十章第十章 固定化的酶与微生物固定化的酶与微生物第二章第二章 沉淀法沉淀法第一节第一节 基本原理与沉淀类型基本原理与沉淀类型第二节第二节 应用实例应用实例第一节第一节 基本原理与沉淀类型基本原
16、理与沉淀类型一、基本原理一、基本原理二、制备蛋白质二、制备蛋白质三、制备核酸三、制备核酸一、基本原理一、基本原理 根据各种物质结构不同，改变溶质的性质，根据各种物质结构不同，改变溶质的性质，致使抽提液有效成分溶解度变化。致使抽提液有效成分溶解度变化。二、制备蛋白质二、制备蛋白质1.1.盐析法盐析法2.2.有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法3.3.蛋白质沉淀法蛋白质沉淀法4.4.聚乙二醇沉淀法聚乙二醇沉淀法5.5.选择性沉淀法选择性沉淀法6.6.结晶沉淀法结晶沉淀法1.1.盐析法盐析法(1)(1)盐分级沉淀盐分级沉淀(2)(2)盐析曲线制作盐析曲线制作(3)(3)盐析的影响因子盐析的影响因子(4)(4
17、)脱盐脱盐(1)(1)盐分级沉淀盐分级沉淀 盐的选择：常选用硫酸铵盐的选择：常选用硫酸铵 硫酸铵盐析硫酸铵盐析 A.A.固体法：逐步加入固体硫酸铵，当加到一定固体法：逐步加入固体硫酸铵，当加到一定 的饱和度时，蛋白质便可沉淀出来。的饱和度时，蛋白质便可沉淀出来。B.B.饱和溶液法：逐步加入预先调好饱和溶液法：逐步加入预先调好pHpH值的饱和硫酸铵，值的饱和硫酸铵，蛋白质便可沉淀出来。蛋白质便可沉淀出来。C.C.透析法：透析袋放入一定浓度的大体积溶液中，通过透析法：透析袋放入一定浓度的大体积溶液中，通过 透析作用来改变蛋白质溶液中的盐浓度，沉淀蛋白质透析作用来改变蛋白质溶液中的盐浓度，沉淀蛋白质
18、。(2)(2)盐析曲线制作盐析曲线制作 硫酸铵饱和度硫酸铵饱和度%VS VS 蛋白质沉淀蛋白质沉淀%(3)(3)盐析的影响因子盐析的影响因子 盐析常数盐析常数 盐分级范围的差异性盐分级范围的差异性 PHPH和盐浓度和盐浓度 蛋白质的纯度和浓度蛋白质的纯度和浓度 其它其它盐析常数盐析常数 lgS=beta-Ks X MlgS=beta-Ks X M 其中，其中，S S表示蛋白质的溶解度，表示蛋白质的溶解度，M M表示溶液中盐表示溶液中盐的浓度。的浓度。盐析常数盐析常数KsKs值大，意味着蛋白溶解度减低速度值大，意味着蛋白溶解度减低速度随着盐浓度增加而快速降低。随着盐浓度增加而快速降低。盐分级范围
19、的差异性盐分级范围的差异性 当分离两种以上蛋白质时，若每一种蛋当分离两种以上蛋白质时，若每一种蛋 白质的的白质的的KsKs值都大，而且盐析范围差异明显，值都大，而且盐析范围差异明显，则分离效果好。则分离效果好。蛋白质的纯度和浓度蛋白质的纯度和浓度 一般控制样品液蛋白质浓度在一般控制样品液蛋白质浓度在0.2%-2%0.2%-2%为宜。为宜。其它其它有时需在溶液中加有时需在溶液中加1 1mMmM的的EDTAEDTA盐，除金属离子盐，除金属离子硫酸铵沉淀时间控制好，一般在硫酸铵沉淀时间控制好，一般在2 2h h左右左右(4)(4)脱盐：凝胶过滤法和透析法脱盐：凝胶过滤法和透析法 透析法注意事项透析法
20、注意事项 透析带处理：用蒸馏水洗净，检查无漏洞透析带处理：用蒸馏水洗净，检查无漏洞 透析液选择：一般为低离子强度中性缓冲液透析液选择：一般为低离子强度中性缓冲液 掌握透析时间：搅拌，样品液与透析液体积掌握透析时间：搅拌，样品液与透析液体积 比为比为1 1：1010，3 3h.h.2.2.有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法基本原理：与盐溶液一样具有脱水作用；有机溶基本原理：与盐溶液一样具有脱水作用；有机溶剂介电常数比水小，使溶剂极性减小剂介电常数比水小，使溶剂极性减小注意事项注意事项 (1)低温下操作低温下操作 防止有机溶剂的放热使蛋白变性防止有机溶剂的放热使蛋白变性 (2)中性盐作用中性盐作用 增加
21、蛋白质溶解度，防变性增加蛋白质溶解度，防变性 (3)多价阳离子作用多价阳离子作用 结合蛋白质，致其溶解度降低结合蛋白质，致其溶解度降低3.3.蛋白质沉淀法蛋白质沉淀法盐沉淀法和有机溶剂沉淀法可以沉淀很多蛋盐沉淀法和有机溶剂沉淀法可以沉淀很多蛋白质，但是蛋白质沉淀法则仅对一类或一种白质，但是蛋白质沉淀法则仅对一类或一种蛋白质起作用。蛋白质起作用。常用碱性蛋白质、凝集素和重金属离子。常用碱性蛋白质、凝集素和重金属离子。4.4.聚乙二醇沉淀法聚乙二醇沉淀法 聚乙二醇和右旋糖酐硫酸钠等水溶性非聚乙二醇和右旋糖酐硫酸钠等水溶性非离子型聚合物可使蛋白质发生沉淀作用。离子型聚合物可使蛋白质发生沉淀作用。5.
22、5.选择性沉淀法选择性沉淀法 根据各种蛋白质在不同物理化学因子作根据各种蛋白质在不同物理化学因子作用下稳定性不同的热点，用选择性沉淀法，用下稳定性不同的热点，用选择性沉淀法，即可使杂蛋白变性沉淀，而欲分离的有效成即可使杂蛋白变性沉淀，而欲分离的有效成分则存在于溶液中，从而达到纯化有效成分分则存在于溶液中，从而达到纯化有效成分的目的。的目的。6.6.结晶沉淀法结晶沉淀法蛋白质沉淀可分为晶体沉淀和无定形沉淀两类蛋白质沉淀可分为晶体沉淀和无定形沉淀两类 ，前者分子排列有规则，后者分子排列无规则，前者分子排列有规则，后者分子排列无规则在提纯阶段，当某一蛋白质浓度达到在提纯阶段，当某一蛋白质浓度达到5%
23、-30%5%-30%水平时，只要条件合适，就能产生一一定形状水平时，只要条件合适，就能产生一一定形状的晶体的晶体三、制备核酸三、制备核酸1.1.DNA/RNPDNA/RNP复合物的解聚复合物的解聚2.2.多糖等杂质的消除多糖等杂质的消除3.3.核酸沉淀核酸沉淀1.1.DNA/RNPDNA/RNP复合物的解聚复合物的解聚 通常使通常使DNA/RNPDNA/RNP复合物有效解聚的办法，主要复合物有效解聚的办法，主要是采用加入去污剂、有机溶剂和蛋白水解酶等是采用加入去污剂、有机溶剂和蛋白水解酶等试剂加以实现。试剂加以实现。(1)(1)去污剂去污剂:SDSSDS、DOCDOC、NP40NP40、Tri
24、ton X-100Triton X-100(2)(2)有机溶剂有机溶剂:苯酚、氯仿（注意事项苯酚、氯仿（注意事项P34P34）(3)(3)蛋白水解酶：溶菌酶、蛋白酶蛋白水解酶：溶菌酶、蛋白酶E/KE/K2.2.多糖等杂质的消除多糖等杂质的消除(1)(1)多糖多糖(2)(2)DNADNA与与RNARNA的分离的分离(1)(1)多糖多糖动物材料分离多糖，处理前饥饿动物材料分离多糖，处理前饥饿1212h h植物材料分离多糖，处理前暗室培养数天植物材料分离多糖，处理前暗室培养数天核酸分离液中多糖，使用选择性沉淀剂核酸分离液中多糖，使用选择性沉淀剂(2)(2)DNADNA与与RNARNA的分离的分离 盐
25、析：盐析：NaCLNaCL分离分离DNADNA和和RNARNA 酶水解法：提取酶水解法：提取DNADNA时，可用时，可用RNase;RNase;反之，可反之，可 用用DNaseDNase 在核酸溶液中加入某些有机溶剂和非离子型在核酸溶液中加入某些有机溶剂和非离子型聚合物等试剂时，核酸会被有效沉淀出来。聚合物等试剂时，核酸会被有效沉淀出来。(1)(1)有机溶剂：乙醇有机溶剂：乙醇-盐溶液、乙丙醇盐溶液、乙丙醇(2)(2)聚乙二醇聚乙二醇(3)(3)CTABCTAB3.3.核酸沉淀核酸沉淀一、皮磷酸二酯酶的纯化一、皮磷酸二酯酶的纯化二、细菌染色体二、细菌染色体DNADNA的制备的制备1.1.制备丙
26、酮粉制备丙酮粉2.2.第一次硫酸铵分级第一次硫酸铵分级3.3.第二次硫酸铵分级第二次硫酸铵分级4.4.丙酮分级分离丙酮分级分离 吸附层析又称色层法或色谱法。按流动相分吸附层析又称色层法或色谱法。按流动相分类，有液相层析和气相层析；按固定相床的形式类，有液相层析和气相层析；按固定相床的形式分类，柱层析、薄层层析、薄膜层析等。按原理分类，柱层析、薄层层析、薄膜层析等。按原理不同可分为：不同可分为：第一节第一节 吸附柱层析吸附柱层析 第二节第二节 薄层层析薄层层析 第三节第三节 聚酰胺薄层层系聚酰胺薄层层系一、常用术语一、常用术语二、基本原理二、基本原理三、吸附剂三、吸附剂四、洗脱剂四、洗脱剂五、层
27、析柱的制备与层析操作五、层析柱的制备与层析操作六、应用与实例六、应用与实例1.1.固定相固定相 2.2.流动相流动相 3.3.层析层析 4.4.操作容量操作容量 5.5.床体积（床体积（Vt Vt）6.6.洗脱体积（洗脱体积（VeVe）7.7.外水体积外水体积 （VoVo）8.8.内水体积（内水体积（ViVi）9.9.基质体积基质体积 （VgVg）10.10.膨胀度膨胀度11.11.分配系数和迁移率分配系数和迁移率 固定相是由层析基质组成的物质，包括固固定相是由层析基质组成的物质，包括固体物质（吸附剂、离子交换剂）和液体物质体物质（吸附剂、离子交换剂）和液体物质（固定在纤维素或硅胶上的溶液）。
28、这些物质（固定在纤维素或硅胶上的溶液）。这些物质与相关的化合物进行可逆性的吸附、溶解和交与相关的化合物进行可逆性的吸附、溶解和交换作用。换作用。在层析过程中推动固定相上的物质向一定在层析过程中推动固定相上的物质向一定方向移动的液体或气体称为流动相。又称洗方向移动的液体或气体称为流动相。又称洗脱剂或洗涤剂，在薄层层析中称展层剂。脱剂或洗涤剂，在薄层层析中称展层剂。以基质为固定相，以液体或气体为流动以基质为固定相，以液体或气体为流动相，有效成分和杂志在这两个相中连续多次相，有效成分和杂志在这两个相中连续多次地进行分配、吸附或交换作用，最终结果是地进行分配、吸附或交换作用，最终结果是使混合物得到分离
29、。使混合物得到分离。在特定条件下，某种成分与基质反在特定条件下，某种成分与基质反应达到平衡时，存在于基质上的饱和容应达到平衡时，存在于基质上的饱和容量，一般以每克（或毫升）基质结合某量，一般以每克（或毫升）基质结合某种成分的毫摩尔数或毫克数来表示。数种成分的毫摩尔数或毫克数来表示。数值大，结合力强；数值小，结合力弱。值大，结合力强；数值小，结合力弱。膨胀后的基质在层析柱中所占有的体积（膨胀后的基质在层析柱中所占有的体积（Vt Vt）：）：Vt=Vo+Vi+Vg Vt=Vo+Vi+Vg 某一成分从柱顶部到底部的洗脱液中出某一成分从柱顶部到底部的洗脱液中出现浓度达到最大时的流动相体积。现浓度达到最
30、大时的流动相体积。外水体积指基质颗粒之间体积的总和。外水体积指基质颗粒之间体积的总和。内水体积是指基质颗粒内部体积的总和。内水体积是指基质颗粒内部体积的总和。基质体积是指基质自身所具有的体积。基质体积是指基质自身所具有的体积。Vo Vo、ViVi、VgVg都是随着床体积和基质性质都是随着床体积和基质性质变化而变化的。变化而变化的。每克溶胀基质所具有的床体积。一般每克溶胀基质所具有的床体积。一般亲水性基质的膨胀度比疏水性的大。亲水性基质的膨胀度比疏水性的大。分配系数：一组分在固定相与流动相中含分配系数：一组分在固定相与流动相中含量的比值（量的比值（K K）。）。迁移率：一组分在相同时间内，在固定
31、相迁移率：一组分在相同时间内，在固定相移动的距离与流动相移动距离之比。移动的距离与流动相移动距离之比。K K值大，说明该组分与固定相结合力大，迁值大，说明该组分与固定相结合力大，迁移率小；反之则结合力小，迁移率大。移率小；反之则结合力小，迁移率大。在吸附层析法中，使用的固定相基质是颗粒状在吸附层析法中，使用的固定相基质是颗粒状的吸附剂。在吸附剂的表面存在着许多随机分布的吸附剂。在吸附剂的表面存在着许多随机分布的吸附位点，这些位点通过范德瓦尔力和静电引的吸附位点，这些位点通过范德瓦尔力和静电引力与蛋白质和核酸等生物大分子结合。结合力大力与蛋白质和核酸等生物大分子结合。结合力大小与生物分子结构和和
32、吸附剂的性质有密切关系。小与生物分子结构和和吸附剂的性质有密切关系。1.1.吸附剂的选择吸附剂的选择2.2.吸附剂的性质吸附剂的性质应具备：表面积大、颗粒均匀、吸附选择性好、应具备：表面积大、颗粒均匀、吸附选择性好、稳定性强、成本低。稳定性强、成本低。极性强的吸附剂易吸附极性强的物质，非极性吸极性强的吸附剂易吸附极性强的物质，非极性吸附剂易吸附非极性物质。但是为了解吸附，对于附剂易吸附非极性物质。但是为了解吸附，对于极性大的分离物，应选择极性小的吸附剂。极性大的分离物，应选择极性小的吸附剂。使用前预处理：过筛除去大颗粒，悬浮除使用前预处理：过筛除去大颗粒，悬浮除去细小颗粒，酸、碱浸泡，接着沸水
33、煮，清去细小颗粒，酸、碱浸泡，接着沸水煮，清水洗，末了用有机溶剂处理。水洗，末了用有机溶剂处理。羟基磷灰石羟基磷灰石和和硅胶硅胶吸附剂的性质。吸附剂的性质。羟基磷灰石（羟基磷灰石（HAHA）：吸附容量高，稳定性好，）：吸附容量高，稳定性好，主要用于制备及纯化蛋白质、酶、核酸、病毒、和主要用于制备及纯化蛋白质、酶、核酸、病毒、和其他生命物质。其他生命物质。HA HA为干粉，使用前先在蒸馏水中浸泡。为干粉，使用前先在蒸馏水中浸泡。HA HA悬浮液需要用旋涡振荡器混合。悬浮液需要用旋涡振荡器混合。忌用柠檬酸缓冲液和忌用柠檬酸缓冲液和Ph5.5Ph5.5的缓冲液。的缓冲液。细颗粒操作容量比粗的大，分辨
34、率也比粗的好，细颗粒操作容量比粗的大，分辨率也比粗的好，但用细颗粒层析时，宜采用直径较大的柱子。但用细颗粒层析时，宜采用直径较大的柱子。性质性质 A.A.含水量含水量 B.B.粒度粒度活化活化活性测定活性测定符合条件符合条件：纯度较高；纯度较高；稳定性好；稳定性好；能较完全洗脱下所分离的成分能较完全洗脱下所分离的成分粘度小；粘度小；易和所需要的成分分开。易和所需要的成分分开。1.1.层析柱层析柱2.2.吸附剂的用量吸附剂的用量3.3.装柱和平衡装柱和平衡4.4.上样和洗脱上样和洗脱5.5.吸附剂的再生吸附剂的再生 一般柱的直径与长度之比为一般柱的直径与长度之比为1 1：10-110-1：404
35、0。采用极细颗粒吸附剂装柱时，宜用比例采用极细颗粒吸附剂装柱时，宜用比例大的层析柱，反之采用比例小的层析柱。大的层析柱，反之采用比例小的层析柱。这样有利于节省时间和提高分辨率。这样有利于节省时间和提高分辨率。操作容量高时，吸附剂用量少。一般操作容量高时，吸附剂用量少。一般吸附剂用量为被分离样品的吸附剂用量为被分离样品的30-5030-50倍。若倍。若样品成分难分开，应加大吸附剂用量。样品成分难分开，应加大吸附剂用量。装柱方法有干装法和湿装法。装柱方法有干装法和湿装法。干装法不宜将气泡排尽。干装法不宜将气泡排尽。湿装法先加适量溶剂到柱内，排走空气，然湿装法先加适量溶剂到柱内，排走空气，然后把浸泡
36、好的吸附剂搅匀，随即将此悬浮液后把浸泡好的吸附剂搅匀，随即将此悬浮液连续倾入柱中，待其自然沉降至柱高的连续倾入柱中，待其自然沉降至柱高的1/4-1/4-1/31/3时打开柱下端开口，让溶剂慢慢流出，使时打开柱下端开口，让溶剂慢慢流出，使柱上端悬浮液徐徐下降至需要的高度。柱上端悬浮液徐徐下降至需要的高度。平衡液流至固定相表面时，关闭下端螺旋夹；平衡液流至固定相表面时，关闭下端螺旋夹；加样后，打开螺旋夹；加样后，打开螺旋夹；样品液向固定相移动；样品液向固定相移动；样品液流至固定相表面时，关闭下端螺旋夹；样品液流至固定相表面时，关闭下端螺旋夹；用洗涤液冲洗柱壁后，打开螺旋夹；用洗涤液冲洗柱壁后，打开
37、螺旋夹；洗涤液流至固定相表面时，关闭下端螺旋夹；洗涤液流至固定相表面时，关闭下端螺旋夹；在柱上加缓冲液，并与储液瓶连通，打开螺旋夹后在柱上加缓冲液，并与储液瓶连通，打开螺旋夹后进行洗涤。进行洗涤。用过的吸附剂经过适当处理恢复其原有性能。用过的吸附剂经过适当处理恢复其原有性能。1.1.应用应用2.2.实例实例（1 1）纯化生命物质）纯化生命物质（2 2）分离蛋白质的亚基）分离蛋白质的亚基（3 3）浓缩溶液）浓缩溶液（1 1）用）用HAHA层析柱分离胞质型多角体病毒双链层析柱分离胞质型多角体病毒双链RNARNA（2 2）用硅胶层析柱分离纯化红曲色素）用硅胶层析柱分离纯化红曲色素（3 3）用硅胶层析
38、柱分离银杏黄酮类物质）用硅胶层析柱分离银杏黄酮类物质 薄层层析是以涂布于玻板或涤纶片等载体上基质为固薄层层析是以涂布于玻板或涤纶片等载体上基质为固定相，以液体为流动相的一种层析方法。定相，以液体为流动相的一种层析方法。优点：优点：1.1.展层时间短展层时间短 2.2.设备简单、操作方便，既适用于分析，也适用于制备设备简单、操作方便，既适用于分析，也适用于制备 3.3.温度变化和溶剂饱和程度对温度变化和溶剂饱和程度对RfRf值影响较小值影响较小 4.4.可使用腐蚀性显色剂可使用腐蚀性显色剂 5.5.灵敏度高灵敏度高 主要应用于鉴定小分子物质和制备少量物主要应用于鉴定小分子物质和制备少量物品，有时
39、也用于鉴定某些大分子物质的纯度。品，有时也用于鉴定某些大分子物质的纯度。一一 主要操作过程主要操作过程 二、应用实例二、应用实例1.1.薄板制备薄板制备2.2.点样点样3.3.展层展层4.4.显色显色玻板玻板制板：制板：a.a.玻棒涂布法玻棒涂布法 b.b.有机玻璃尺涂布法有机玻璃尺涂布法c.c.半机械涂布法半机械涂布法 活化活化活性测定活性测定点样量不宜太多，否则会降低点样量不宜太多，否则会降低RfRf值；值；原点直径要小于原点直径要小于2mm2mm；薄层板在空气中放置时间要尽量短。薄层板在空气中放置时间要尽量短。把点好样的薄层板放入预先饱和的展层装置把点好样的薄层板放入预先饱和的展层装置中
40、，让点样一端浸入展层剂中，其深度约为中，让点样一端浸入展层剂中，其深度约为0.5cm0.5cm，切忌样品点浸入展层剂中。当展层剂上升到离玻切忌样品点浸入展层剂中。当展层剂上升到离玻璃板的另一端璃板的另一端0.5-1.0cm0.5-1.0cm时，停止展层，取出玻璃时，停止展层，取出玻璃板并立即画出展层剂的前缘，迅速吹干。板并立即画出展层剂的前缘，迅速吹干。注意：选择适当的展层剂；注意：选择适当的展层剂；使用适当的展层装置。使用适当的展层装置。薄层可采用喷雾显色，展层谱可在紫外薄层可采用喷雾显色，展层谱可在紫外光下检测。光下检测。1.1.用薄层法纯化和鉴定淀粉中单半乳糖苷用薄层法纯化和鉴定淀粉中单
41、半乳糖苷甘油二酯和双半乳糖苷甘油二酯；甘油二酯和双半乳糖苷甘油二酯；2.2.用薄层法检测环境中残留的有机磷药物。用薄层法检测环境中残留的有机磷药物。一、基本原理一、基本原理二、应用实例二、应用实例 聚酰胺对极性物质的吸附作用是由于它能和被聚酰胺对极性物质的吸附作用是由于它能和被分离物之间形成氢键。氢键的强弱决定了被分离物分离物之间形成氢键。氢键的强弱决定了被分离物与聚酰胺薄膜之间吸附能力的大小。层析时，展层与聚酰胺薄膜之间吸附能力的大小。层析时，展层剂与被分离物在聚酰胺膜表面竞争形成氢键。因此剂与被分离物在聚酰胺膜表面竞争形成氢键。因此选择适当的展层剂使分离物在聚酰胺膜表面发生吸选择适当的展层
42、剂使分离物在聚酰胺膜表面发生吸附、解吸附、再吸附和再解吸附的连续过程，就能附、解吸附、再吸附和再解吸附的连续过程，就能达到分离的目的。达到分离的目的。1.用用DNS-氨基酸的聚酰胺薄膜层析鉴定肽氨基酸的聚酰胺薄膜层析鉴定肽N末端；末端；2.用用DABTH-氨基酸的薄层层析分析蛋白质序列。氨基酸的薄层层析分析蛋白质序列。基本原理：疏水层析也称疏水作用层析，它是基本原理：疏水层析也称疏水作用层析，它是根据有效成分和固定相之间相互作用的疏水力差根据有效成分和固定相之间相互作用的疏水力差异性大小，进而设法将有效成分分离出来。异性大小，进而设法将有效成分分离出来。第一节第一节 基本原理基本原理第二节第二
43、节 操作与应用操作与应用一、疏水作用一、疏水作用二、吸附剂二、吸附剂结合作用：结合作用：1.1.蛋白质表面的一些疏水补丁蛋白质表面的一些疏水补丁2.2.令蛋白质变形，暴露其疏水性残基令蛋白质变形，暴露其疏水性残基3.3.疏水层析的特性所致疏水层析的特性所致 疏水层析过程中，所使用的固定相一般是疏水层析过程中，所使用的固定相一般是由基质和配体两部分构成。由基质和配体两部分构成。1.亲水性吸附剂：基质主要是交联琼脂糖，亲水性吸附剂：基质主要是交联琼脂糖，配体是苯基或辛基化合物。配体是苯基或辛基化合物。2.非亲水性吸附剂：基质有硅胶和树脂，配非亲水性吸附剂：基质有硅胶和树脂，配体为苯基、辛基和烷基等
44、。体为苯基、辛基和烷基等。一、层析柱的制备一、层析柱的制备二、加样与洗脱二、加样与洗脱三、应用实例三、应用实例1.1.层析柱规格：层析柱规格：h:dh:d3 3；2.2.固定相：苯基固定相：苯基-Sepharose CL-4B-Sepharose CL-4B吸附剂吸附剂适合分离纯化与芳香族化合物具有亲和力适合分离纯化与芳香族化合物具有亲和力的物质，而辛基的物质，而辛基-Sepharose CL-4B-Sepharose CL-4B则适用则适用于分离纯化亲脂性较强的物质；于分离纯化亲脂性较强的物质；3.3.装柱。装柱。加样前，在样品溶液中加适量盐类，混匀，加样前，在样品溶液中加适量盐类，混匀，放
45、置片刻即可上柱。当把样品溶液徐徐加入固放置片刻即可上柱。当把样品溶液徐徐加入固定相后，先用平衡缓冲液洗涤，再用降低盐浓定相后，先用平衡缓冲液洗涤，再用降低盐浓度的平衡缓冲液洗涤，同时用部分收集器分段度的平衡缓冲液洗涤，同时用部分收集器分段收集洗脱下来的溶液，并对其进行检测。收集洗脱下来的溶液，并对其进行检测。1.纯化鸡胗钙调蛋白纯化鸡胗钙调蛋白2.纯化苯丙氨酸裂解酶纯化苯丙氨酸裂解酶 离子交换层析是常用的层析方法一，它是在以离离子交换层析是常用的层析方法一，它是在以离子交换剂为固定相，以液体为流动相的系统中进行的。子交换剂为固定相，以液体为流动相的系统中进行的。第一节第一节 基本原理基本原理
46、第二节第二节 离子交换剂的分类及性质离子交换剂的分类及性质 第三节第三节 离子交换剂与缓冲液的选择离子交换剂与缓冲液的选择 第四节第四节 操作操作 第五节第五节 应用应用离子交换剂是由基质、电荷集团和反离子构成离子交换剂是由基质、电荷集团和反离子构成的，它与水溶液中离子或离子化合物的反应主的，它与水溶液中离子或离子化合物的反应主要以离子交换方式进行，或者借助离子交换剂要以离子交换方式进行，或者借助离子交换剂上电荷集团对溶液中离子或离子化合物的吸附上电荷集团对溶液中离子或离子化合物的吸附作用进行。作用进行。反应通式反应通式：离子交换剂与各种水合离子的结合力是与离子离子交换剂与各种水合离子的结合力
47、是与离子的电荷量成正比，与水合离子半径平方成反比。的电荷量成正比，与水合离子半径平方成反比。RA+BRA+BRB+ARB+A各种阴阳离子结合力大小的排列顺序：各种阴阳离子结合力大小的排列顺序：一价阳离子：一价阳离子：LiLi+NaNa+KK+RbRb+CsCs+二价阳离子：二价阳离子：MgMg2+2+CaCa2+2+SrSr2+2+BaBa2+2+一价阴离子：一价阴离子：F F-ClCl-BrBr-II-不同价阳离子：不同价阳离子：NaNa+CaCa2+2+AlAl3+3+TiTi4+4+上述排列只适用于稀溶液中；对于呈两性离子上述排列只适用于稀溶液中；对于呈两性离子 的蛋白质、酶类、多肽和核
48、苷酸等物质与离子的蛋白质、酶类、多肽和核苷酸等物质与离子 交换剂的结合力，主要取决于它们的物理化学交换剂的结合力，主要取决于它们的物理化学 性质和在特定性质和在特定pHpH条件下呈现的离子状态。条件下呈现的离子状态。常用的离子交换剂应满足下列要求：常用的离子交换剂应满足下列要求：有高度的不溶性；有高度的不溶性；有疏松的多空结构和巨大的表面积，使有疏松的多空结构和巨大的表面积，使交换离子能在交换剂中进行自由扩散和交换；交换离子能在交换剂中进行自由扩散和交换；有较多的交换集团；有较多的交换集团；有稳定的物理化学性质有稳定的物理化学性质。一、分类一、分类二、性质二、性质1.1.疏水性离子交换剂：疏水
49、性离子交换剂中的基疏水性离子交换剂：疏水性离子交换剂中的基质是一种人工合成的、与水结合力较小的树脂质是一种人工合成的、与水结合力较小的树脂物质。分为物质。分为阳离子交换剂阳离子交换剂和和阴离子交换剂阴离子交换剂。主。主要应用于分离无机离子、有机酸、核苷、核苷要应用于分离无机离子、有机酸、核苷、核苷酸和氨基酸等小分子物质。酸和氨基酸等小分子物质。2.2.亲水性离子交换剂：它是一类天然的或人工合亲水性离子交换剂：它是一类天然的或人工合成的、与水结合力较大的物质。常用的有纤维成的、与水结合力较大的物质。常用的有纤维素、交联纤维素、交联葡聚糖和交联琼脂糖等。素、交联纤维素、交联葡聚糖和交联琼脂糖等。阳
50、离子交换剂电荷集团带负电，反离子带正电。阳离子交换剂电荷集团带负电，反离子带正电。根据电荷集团的强弱，又可将其分为强酸型根据电荷集团的强弱，又可将其分为强酸型（即带磺酸基）、中强酸型（即带磷酸集团和（即带磺酸基）、中强酸型（即带磷酸集团和亚磷酸集团）、弱酸型（即带羧基和酚基）。亚磷酸集团）、弱酸型（即带羧基和酚基）。阴离子交换剂是在树脂中分别引入季胺、阴离子交换剂是在树脂中分别引入季胺、叔胺、仲胺和伯胺集团后构成的。叔胺、仲胺和伯胺集团后构成的。（1）当引入季胺和叔胺集团时，分别为强）当引入季胺和叔胺集团时，分别为强阴性和中强阴性离子交换剂，阴性和中强阴性离子交换剂，（2）当引入仲胺和伯胺集团
