1、I 清洁验证Cleaning Validation内容介绍内容介绍:1.法规对清洁验证的要求及其背景;2.清洁验证的风险评估3.清洁方法的开发和设计；4.清洁分析方法的验证；5.清洁验证；6.清洁验证审计中经常发现的问题。、法规对清洁验证的要求10 版版 GMP 的要求（的要求（WHO GMP）：）：第七章确认与验证第一百四十三条清洁方法应经过验证,证实其清洁的效果，以有效防止污染和交 叉污染。清洁验证应综合考虑设备使用情 况、所使用的清洁剂和消毒剂、取样方法 和位置以及相应的取样冋收率、残留物的 性质和限度、残留物检验方法的灵敏度等 因素。10 版版 GMP 的要求（的要求（WHO GMP）
2、：）：第五章设备 第二节 设计和安装第七十四条 生产设备不得对药品质量产生任何不利影响。与药品直接接触的 生产设备表面应当平整、光洁、易清洗或 消毒、耐腐蚀，不得与药品发生化学反应、吸附药品或向药品中释放物质。10 版版 GMP 的要求（的要求（WHO GMP）：）：第四节使用和清洁第八十四条 应当按照详细规定的操作 规程清洁生产设备。生产设备清洁的操作规程应当规定具体 而完整的清洁方法、清洁用设备或工具、清 洁剂的名称和配制方法、去除前一批次标识 的方法、保护已清洁设备在使用前免受污染 的方法、已清洁设备最长的保存时限、使用 前检查设备清洁状况的方法，使操作者能以 可重现的、有效的方式对各类
3、设备进行清洁。10 版版 GMP 的要求（的要求（WHO GMP）：）：如需拆装设备，还应当规定设备拆装的顺序 和方法；如需对设备消毒或灭菌，还应当规 定消毒或灭菌的具体方法、消毒剂的名称和 配制方法。必要时，还应当规定设备生产结 束至清洁前所允许的最长间隔时限。第八十五条 已清洁的生产设备应当在清洁、干燥的条件下存放。10 版版 GMP 的要求（的要求（WHO GMP）：）：第九章生产管理第二节防止生产过程中的污染和交叉污染 第一百九十七条生产过程中应当尽可 能采取措施，防止污染和交叉污染，如：（六）采用经过验证或已知有效的清洁和 去污染操作规程进行设备清洁；必要时，应当对与物料直接接触的设
4、备表面的残留 物进行检测；欧盟GMP的要求:36.为确认清洁规程的效力，应进行清洁验证。应根 据所涉及的物料，合理的确认产品残留、清洁剂和微 生物污染的限度标准。这个限度标准应该是可以达到 的，能够证实的。37.应使用经验证、检出灵敏度高的检验方法来检测 残留或污染物。每种分析方法或仪器的检测灵敏度应 足以检测出设定合格限度水平的残留或污染物。38.通常只有接触产品设备表面的清洁规程需要验证。某些场合下，还应考虑不直接接触产品的部分。应验 证设备使用与清洁的间隔时间，以及已清洁设备可保 留的时间，并通过验证确定清洁的间隔时间和清洁方 法。欧盟GMP的要求（续）：39.对于相似产品和相似工艺而言
5、，可从相似产品 及工艺中，选择一个具有代表性产品和工艺进行清 洁验证。可采用“最差条件”的方法进行单独的验 证试验，在验证中应考虑关键因素。40.为证明方法是经过验证的，通常应在3个连续 批上使用该清洁规程，并检验合格。41.清洁验证不应采用“不断测试，直至清洁”的 方式。42.如果实际产品是有毒物质或有害物质，在清洁 验证中，可以例外地采用物化特性相似的无毒无害 物质来模拟。FDA的要求：的要求：在FDA的cGMP 211.67章节中规定了设备清洗验证 的要求。建立书面标准操作程序（SOP），其中必须详细规 定设备各部件的清洗过程。必须建立书面的清洗方法验证通则。清洗方法验证通则应规定执行验
6、证的负责人、批准 验证工作的负责人、验证标准（合格标准）、再验 证的时间。对各生产系统或各设备部件进行清洗验证之前，应 制定专一特定的书面验证计划，其中应规定取样规 程、分析方法（包括分析方法的灵敏度）。FDA的要求（续）：5.按上述验证计划进行验证工作，记录验证 结果。6.做出最终的验证报告，报告应由有关管理 人员批准，并说明该清洗方法是否有效。清洁验证的背景:消胆胺召回事件：即1988年从市场上撤回了消胆胺成品制剂，原因是规 程不当。生产该制剂的原料药受到了农业杀虫剂生产 中少量中间体和降解物质的污染。造成交叉污染的主 要原因使用了回收溶媒。而回收溶媒受到了污染，原 因是对溶媒桶的重复使用
7、缺少监控。贮存杀虫剂产生 的回收溶媒桶又重复地用于贮存该药品生产中的回收 溶媒。而工厂没有对这些溶媒桶进行有效的监控，没 有对其中的溶媒进行有效的检验，也没有对桶的清洗 规程进行验证。被杀虫剂污染的部份化学原料药运到 了另一地点的第二家工厂生产制剂，使该工厂的流化 床干燥器中物料袋受到了杀虫剂的污染，料造成各批 产品受到污染，而该工厂根本就没有生产杀虫剂。清洁验证的背景（续）：FDA历来的检查重点：要求清洗设备的主要目的还是防止污染或混料。由于设 备清洗维护不当或防尘管理不当，FDA检查官曾十分注 意检查卫生状况。过去FDA总是更注意检查青霉素类与 非青霉素类药物之间的交叉污染、药品与甾类物质
8、或激素 之间的交叉污染问题。在过去二十年间，因实际或潜在的 青霉素交叉污染问题已从市场上撤回了大量的药品。有一位幼儿教师，怀抱着一名2小时前注射过青霉素钠 的婴儿，孩子的一泡尿撒在了幼儿教师的手臂上，1分钟 后该名幼儿教师呼吸困难、面色苍白、心慌气短，不一会 就呈现昏迷状态，经医生诊断为青霉素过敏。清洁验证的背景（续）:FDA加强对进口原料供应商的检查：1992年，FDA对一家海外原料药生产厂发出了 进口警告，该工厂使用同一设备生产强力甾体类 物质和非甾体类物质。该工厂是多品种原料药生 产厂。FDA认为交叉污染的可能性很大，对公众 的健康造成了严重威胁。该工厂仅在FDA检查时 开始清洗验证工作
9、，FDA在检查时认为该清洗验 证不当。理由之一是：工厂仅寻找没有前一种物 质存在的证据。但是用TLC法检验洗涤水之后，找到了设备中还残留了前一产品生产过程中的副 反应物质和降解物质的证据。、清洁验证的风险评估清洁验证的风险评估:过程歩驛可能的失败产重性发生的可 能性可诅别性RPN化验化验化验结果台格，但是实际设 答上仍有超过限度拘残留。52550化验结果不合格，但是实际 合格13515取样取样不能把设备上的残留全部取.1=53460取样点不能代表设备的最差 区域。53345清洗清洗清洗SOP不完全n43112清洗SOP没有亍旨导性。44232员工不按照SOP去执行n52110设备设备进风过滤网
10、上有很多筛网=44464鱼长的上料管。44464某料斗有死角。43448、清洁方法的开发和设计清洁方法的分类和特点:在线清洁的特点：1设备、容器、管道能够自动进行清洗；2.对容器采用喷林法清洁，对管道采用压力法 清洁；3.极少的手工操作，重复性高。通常清洁方法分为：手工清洁(Manual Cleaning)在线清洁(Cleaning In Place)清洁的原理1.清洗剂（水、有机溶剂或表面活性剂）采用 扩散或对流的方法到达“脏物”表面；2.清洗剂通“脏物”反应；3反应产物采用扩散或对流的方法离开设备。清洁速率同流速的关系层流其中：其中：V：流速D:特征距离（管子/管道直径）P：流体密度 卜:
11、动态流体粘度N&=-盾子或管道：盾子或管道：如果NRe层流 如果NRe4000-湍流2 0C水中圆形管道湍流所要求的流速和 速度管子直径（英寸）管子直径（英寸）速度（米速度（米/秒）秒）流速（升流速（升/分）分）0.50.30482.7281.00.16155.9101.50.10678.6372.00.0823011.820通常，对于盲管和垂直管路为了清洁干净要求管道 中水的流速要大于湍流所需要的流速1.52米/秒（5英 尺/秒）。容器降落膜的雷诺系数:通常要求在容器内壁达到湍流的雷诺系数为大 于 2,000.喷林球:Courtesy of ESC溶液分布在容器上部的25%-30%区域喷林球
12、的覆盖率检查:喷林球的覆盖率检查（续）:核黄素（维生素B2）覆盖测试检查法:A把核黄素均匀涂布在设备内表面；干燥；按照预定的SOP启动CIP进行清洗；干燥；采用黑光灯检查；A合格标准：无核黄素残留，在黑光灯检查 下无荧光。防止容器底部积水:底部出口大小(英寸)容器排水速率估算(L/M)0.55.01.045.51.5140.92.0268.22.5454.6管道盲管为了有效和可重复的清洗通常要求管路系 统中的分叉口或交接口的L/D2.0仪器形分叉口阀门形分叉口管道盲管（续）清洁剂的选择选择标准：1.清洁剂应能有效溶解残留物，不腐蚀设备,且本身易被清除。2.人用药品注册技术要求国际标准协调会(I
13、CH)在“残留溶剂指南”中将溶剂分为3个 级别，对其使用和残留限度有明确的要求。3.随着环境保护标准的提高，还应要求清洁 剂对环境尽量无害或可被无害化处理。4.满足以上要求的前提下应尽量廉价。清洁剂的选择（续）根据这些标准，对于水溶性残留物，水是首选的清 洁剂。不同批号的清洁剂应当有足够的质量稳定性。因此不宜采用一般家用清洁剂，因其成分复杂、质 量波动较大且供应商不公布详细组份。使用这类清 洁剂后，还会引起新的问题，即如何证明清洁剂的 残留达到了标准？因此，应尽量选择组份简单、成分确切的清洁剂。根据残留物和设备的性质，企业还可自行配制成分 简单效果确切的清洁剂，如一定浓度的酸、碱溶液 等。企业
14、应有足够灵敏的方法检测清洁剂的残留情 况，并有能力回收或对废液进行无害化处理。制定清洁规程：制定SOP是清洁验证的先决条件；通常参照设备的说明书制定详细的规程，规 定每一台设备的清洁程序，保证每个操作人 员都能以可重复的方式对其清洗，并获得相 同的清洁效果。清洁规程的要点：A系统的拆卸；预清洁；清洁剂、浓度、溶液量，水质量；清洁规程的要点（续）:时间、温度和频次、流速、压力;消毒（消毒剂浓度、消毒方法、消毒剂用量）；装配：按说明书、示意图要求装配；干燥：明确干燥的方式和参速；检查：符合预定的标准。清洁方法的开发和设计的要点1.湍流的清洁速率大大大于层流的清洁速率；2.盲管和垂直管道中的清洁液的
15、速率要大于湍 流所需的速率，通常要求大于152米/秒（5 英尺/秒）；3.在设备设计时需要考虑盲管的清洁问题，通 常要求L/D2.0；4.喷林球的覆盖率检查；5.CIP清洗中避免设备底部的积水；6.有效、可靠和反复的清洁要求湍流。清洁分析方法的验证棉签取样方法的验证:通常清洁分析方法验证包括取样方法验证和检 验方法验证。棉签取样方法的验证：取样过程需经过验证，通过回收率试验验证取 样过程的回收率和重现性。通常取样回收率和 检验方法回收率结合进行，总回收率一般（企 业可以根据实际情况确定）不低于70%，多次 取样回收率的相对标准偏差应不大于20%。棉签取样过程的验证实际上是对取样棉签、溶 剂的选
16、择、取样人员操作、残留物转移到取样 棉签、样品溶出（萃取）过程的全面考察。棉签取样方法的验证（续）:验证方法如下：矗諧薔备表臨质相同的板材，如平 在钢板上划出100mm X 100mm的区域；白籀倍限度量的待检测物溶液，定量装入校验 将矗液尽量均匀地涂布在100mmX 100mm的区域内；自然干燥或用电吹风温和地吹干不锈钢板；定的擦拭溶剂润湿擦拭棉签，按下图所 7重复以上规程3次；棉签取样方法的验证（续）:将擦拭棉签分别放入棉签管中，加入预定溶剂5ml,超声；用经验证的检验方法检验，计算回收率和回收率 的 RSD。下图为棉签插试取样方法:第二步淋洗液取样方法的验证：通常淋洗法限度检查不需做回收
17、率验证；定量检查应做 回收率验证，可以利用淋洗溶剂冲洗已知量（在限度附 近）的分析物确定回收率，回收率通常应不低于95%。淋洗的取样方法为根据淋洗水流经设备的线路，选择淋 洗线路相对最下游的一个或几个排水口为取样口。分别 按照微生物检验样品和化学检验样品的取样规程收集清 洁程序最后一步淋洗即将结束时的水样。淋洗法样品可对冲洗液直接检测也可对冲洗液做稀释后 检测；无论直接检测还是稀释检测都应在接到样品后首 先将样品同空白溶剂做视觉检查，确定是否有颜色差异 和异物存在；如果有上述现象发生，可直接判定样品不 合格。取样方法和取样点的确认通常设备的取样清洁验证中如何确定合适取样方法和取 样点是验证方案
18、的关键内容之一，必须由合适的理由来 确认取样点，此取样点应能够代表设备的“最脏点”。（1）取样方法的确认方法分为棉签直接表面擦拭、淋洗液冲洗和安慰剂取样。擦拭取样的优点是能对最难清洁部位直接取样，通过考 察有代表性的最难清洁部位的残留物水平评价整套取样方法和取样点的确认生产设备的清洁状况。通过选择适当的擦拭溶剂、擦拭工具和擦拭方法，可将清洗过程中未溶解的，已“干结”在设备表面或溶解度很小的物质擦拭下 来。检验的结果能直接反映出各取样点的清洁状况。擦拭取样的缺点是很多情况下须拆卸设备后方能接 触到取样部位，对取样工具、溶剂、取样人员的操 作等都有一定的要求，总的来说比较复杂。取样方法和取样点的确
19、认（续）淋洗取样法为大面积取样方法，其优点是取样面 大，对不便拆卸或不宜经常拆卸的设备也能取样。因此其适用于擦拭取样不易接触到的表面，尤其 适用于设备表面平坦、管道多且长的的生产设备。淋洗水样品的缺点是溶解与流体力学原理，当溶 剂不能在设备表面形成湍流进而有效溶解残留物 时，或者残留物不溶于水或“干结”在设备表面 时，淋洗水就难以反映真实的情况。必须由经过培训的人员进行取样，并且必须按照 批准的测试方案进行。执行取样的人员同执行清 洁操作的人员不能为同一人。取样方法和取样点的确认(续)安慰剂取样(Placebo method)方法也称模 拟法取样。设备清洁干燥后，在该设备内进行模拟物料处 理，
20、然后取一部份进行测试。法规部门强力不推荐使用此法，原因如下：无人能确保残留均匀地遗留在设备整个表面;A较大颗粒的残留不能均匀地分散到模拟物料 中。(2)取样点的确认通常不可能擦拭设备的全部表面，因此应该选择 设备的最差区域作为取样点。这些区域应在清洁难 度和残留水平方面代表着对清洁规程最大程度的挑 战，例如料斗的底部、桨拌桨桨叶底部和阀门的周 围。如果进行微生物取样，取样计划应包括微生物的 可能最差区域，例如：较难靠近的地方以及可收集 水的排水区域。微生物和化学取样应在不同区域进 行，测试方案中应包括设备及其取样点的描述或图 表。五、清洁验证清洁验证的定义清洗验证是用书面证据证明批准的清洗规程
21、可以对设 备进行有效的清洗并使清洗后的设备适用于产品的制造 或包装。清洁验证的目的就是证明经过清洁程序清洁后，设备 上的残留物（可见的和不可见的：包括前一产品的残留 物或清洗过程中洗涤剂的残留物）达到了规定的清洁限 度要求，不会对将生产的产品造成交叉污染。由于清洁方法直接影响产品的质量、安全性和有效性，为了确保清洁的有效，以确保后续产品中没有带入超过 接受标准的污染物，避免产品的交叉污染，以致影响患 者的用药安全必须对清洁方法进行验证。清洁验证的范围通常清洁验证包括但不限于以下三个方面:生产结束至开始清洁的最长时间（也称：待 清洁设备保留时间）；已清洁设备用于下次生产前的最长存放时间（也称：洁
22、净保留时间）；连续生产的最长时间。清洗验证的预先要求设备和设施设计：设计是否易于清洗与检查？是否对自动系统进行了验证（eg.在线清洗系统）?清洗规程的管理：清洗规程是否全面、详细、准确并且批准？是否定期对清洗规程进行回顾？相关验证：分析仪器是否经过验证？清洁分析方法是否经过验证？验证方案验证方案由于清洁验证是个复杂的验证过程，在保证清 洁效果和符合法规的前提下通常采用参照物来 简化清洁验证。验证方案的制定必须符合一般 验证方案的共性要求，该清洁验证方案中最关 键的技术问题为如何确定限度，用什么手段能 准确地测定残留量，这包括取样方法和检测方 法的开发和验证。通常清洁验证包括以下内容:（1）设备
23、的评估（2）清洗规程的评估（3）清洁参照物的选择和残留限度的计算设备评估设备评估用来确定哪些设备是多个活性成分共同接触 的，即：共用设备；那些设备是某个产品/活性成分 单独使用的设备，即：专用设备。该设备评估将计算 出共用设备的产品接触面积以计算残留限度的接受标 准。本评估的一个关键点是确定哪些设备是包括在清洁验 证中的，哪些设备是不包括在清洁验证中的。按照设 备接触产品的情况，设备可分为三类：产品接触的设备系指直接接触产品的设备，例 如：溶液罐、储存桶。对于产品接触设备的无效清洁 可能造成产品间的交叉污染。设备评估 非产品接触的设备系指在生产工艺中涉及，但没有和产品直接接触的设备。例如：封闭
24、设备的外 表面。对于非产品接触设备的无效清洁一般不会造成 产品间的交叉污染。非直接或偶然产品接触的设备系指在生产工 艺中涉及，没有和产品直接接触但有可能污染产品的 设备。例如：冷冻干燥仪或盘式干燥仪的内表面、机 械监护装置的内部，还有某些情况下地面、墙面和天 花板。对于非直接产品接触设备的无效清洁有可能造 成产品间的交叉污染。设备评估通常清洁验证包括产品接触的设备，不包括非产 品接触的设备，非直接产品接触的设备是否包括 在内依实际情况而定。一次性单用途设备（如硅 胶管）可不包括在清洁验证中。设备评估设备表面积的确定：应测定每个设备的产品接触面积，以计算残 留限度的接受标准。产品接触面积测定的准
25、确度应具有实际意义,不必绝对地精确。可将复杂设备转化成基本几 何图形以便于计算和测量。测量的原始记录和计算将作为原始数据进行 保存。清洗规程的评估是否包括了所有的设备/清洗操作？A清洗操作是手动还是自动的？A清洗规程是否足够详细以便可以进行持续一致的操作?A是否规定了干燥的方法以及干燥方法是否正确？A标准操作规程是否规定了需要检查与记录的信息？A清洗规程是否包括了状态标识的要求？A是否详细描述了在完成检查后如何确保存储是安全的?标记化合物选择标记化合物选择一般药品都由活性成分和辅料组成。对于接触多 个产品的共用设备，所有这些残留物都是必须清 洁干净的，在清洁验证中不必为所有残留物都制 定限度标
26、准并一一检测，因为这是不切实际且没 有必要的。在一定的意义上，清洁的过程是个溶 解的过程，因此，通常的做法是从各组分中确定 最难清洁（溶解）的物质，以此作为参照物质。通 常，相对与辅料，人们最更关注活性成分的残留,因为它可能直接影响下批产品的质量、疗效和安 全性。标记化合物选择毒性在清洗溶剂中的溶解度清洗问题如：对设备表面材质有一定的附着力包含色料、芳香剂或矫味剂的产品设备的使用率（生产频率高的产品相应的清洗频率 也高）清洗过程中如果使用清洗剂，则其残留物也应视为标记化合物选择产品产品 名名称称毒性毒性溶解性溶解性已知的清已知的清 洗洗 问题问题颜色颜色 香味香味与味与味 道道产量产量A10u
27、g/cm3易溶无无10%B40ug/cm3溶解无无20%C50ug/cm3溶解无无50%D50ug/cm3微溶有有20%清洗限度和接受标准(1)目测洁净，干燥&无嗅限度匐在每个清洗验证的方案中都必须包括该接受限度;廓在每次清洗完成后都必须进行检查并对检查结果 进行记录；廓目测检查时应包括地面、墙面和天花板等；闻应该作为清洗验证接受限度的第一个接受标准；注意：在进行无嗅检查时考虑到产品的安全问题。清洗限度和接受标准清洗限度和接受标准（2）化学残留可接受限度浓度限度：十万分之一（lOppm）在下一产品中的残留物数量级别应不超过十万分之一（lOppm），最高允许十万分之一残留源于食品法 规，食品法规
28、允许某一有害物质作为食物链存在于动 物和家禽中存在的水平。实验室通常配备的仪器如HPLC，紫外一可见分光光 度计、薄层色谱等的灵敏度一般都能达到1 0X10-6 以上，因此该限度标准不难被检验。清洗限度和接受标准清洗限度和接受标准设下批产品的生产批量为B(kg)，因残留物浓度最 高为10X10-6,卩iomg/kg，则残留物总量 最大为BX10X10-6=10B(mg)；单位面积残留 物的限度为残留物总量除以测量的与产品接触的 内表面积，设设备总内表面积为SA(cm2),则表 面残留物限度L为10B/SA(mg/cm2)。千分之一残留限度的计算Li/iooo=MTDa1000Nbx-MDDbx
29、 SbMTDa=清洗前产品最小每日给药剂量中的活性成分含量；Nb=清洗后产品的批量；MDDb=清洗后产品的最大日给药剂量的活性成分含量；Sb=清洗后产品活性成分含量的百分比(w/w)。数据1/1000源于三个因素。首先，一般认为药物的十分之一 处方剂量是无效的；其次是安全因子；再次是耐受因子。清洗限度和接受标准清洗限度和接受标准千分之一残留限度的计算举例产品产品活性活性名称名称成分成分AaBbCc活性成分活性成分含量含量最小日剂量最小日剂量MTD最大日剂量最大日剂量MDD批量批量3%2mg10mg100 kg6%5mg20mg50 kg8%50mg150mg250 kg清洗限度和接受标准清洗限
30、度和接受标准洗后产品清洗前产品ABCAN/A300mg267mgB1500mgN/A667mgC15000mg7500mgN/A清洗限度和接受标准清洗限度和接受标准产品之间公用设备表面积产品名称公用面枳A+B200,000cm2B+C100,000cm2C+A80,000cm2清洗限度和接受标准清洗限度和接受标准按擦拭面积为100cm2，计算每个棉签的残留限度青洗后产品清洗前产品、ABCA目视洁净150ug/100cm2330ug/100cm2B500ug/cm2目视洁净667ug/100cm2C1250ug/100cm2500ug/100cm2目视洁净清洗限度和接受标准清洗限度和接受标准(3
31、)微生物残留可接受标准清洗的微生物验证应该和清洗的化学验证同步进 行。棉签擦拭法：洗出液取样或压痕法采样；淋洗液法：取定量的淋洗液过滤后，取滤膜培养。清洗验证状态的维护的龍及进行器后廬洗规程需要遵循变更控制关于产品、设备及规程的任何变更必须遵循变更控 制流程对变更对验证状态的影响进行评估。-评估清洗验证是否持续地符合企业及法规的标 准（某些更新的要求）-对清洗验证的回顾进行书面记录以确认清洗操 作仍然处于验证的状态-清洗验证回顾的频率由各个企业自主决定（一 般的回顾频率为最多1年）六、GMP检查中经常发现的问题GMP检查中经常发现的问题(1)未清洁设备的保留时间没有验证，且实际设备 清洁后的保
32、留时间大于验证时的保留时间。(2)在清洁验证中未评估所用清洁剂的残留。(3)用户手工清洁的设备没有清洁S0P。(4)在线清洁的SOP中未描述清洁剂的温度、流速 和清洗时间。(5)清洗规程中描述使用70L的0.1M的氢氧化钠溶 液冲洗整个系统但是验证时验证的是使用80L的0.1M的氢氧化钠溶液冲洗整个系统。GMPGMP检查中经常发现的问题检查中经常发现的问题(续续)(6)某产品使用的灌装机的清洗规程无效，清 洁后仍然可见残留和异物颗粒。(7)在清洁验证研究和设备的IQ/OQ中，对喷 淋球覆盖的情况没有进行验证。(8)用于清洁的分析方法没有进行验证。(9)棉签插试方法没有进行验证。(10)棉签插试中取样点的选择没有代表性。谢
