1、蛋白质总结蛋白质总结 氨基酸氨基酸 蛋白质的共价结构和三维结构蛋白质的共价结构和三维结构 蛋白质结构与功能的关系蛋白质结构与功能的关系 蛋白质的分离、纯化和表征蛋白质的分离、纯化和表征 重要实验重要实验生工生工081班班蛋白质的结构与相关功能 1.肌红蛋白 2.红蛋白 3.免疫球蛋白 4.辅基血红素（可与氧、一氧化碳、氢离子结合）5.蛋白质结构与功能的关系：取决于以一级结构为基础的蛋白质的空间构象 a.一级结构与功能的关系 一级结构的变异与分子病（镰刀状细胞贫血病）一级结构与生物进化（细胞色素）b.空间结构与生物功能 蛋白质的变构现象（血红蛋白）6.血红蛋白与肌红蛋白的比较胶原蛋白（胶原）胶原
2、蛋白类型：、。属结构糖蛋白。每股肽链为左手螺旋，多由GlyGly-Pro-Y-Pro-Y序列重复而成，含三种不常见的氨基酸（5羟赖氨酸、4羟脯氨酸和3羟脯氨酸）肌球蛋白（掌握结构掌握结构）由两条相同的重链和两对不同的轻链组成。头部有ATP结合位点（具ATP酶活性）和肌动蛋白结合位点。装配成骨骼肌的粗丝。肌动蛋白：球状单体，组成骨骼肌的细丝三维结构辅基血红素（与氧结合部位）氨基酸残基数与氧结合构象改变与氧亲和力与 氧结合曲线肌红肌红蛋白蛋白一条多肽链1个153Fe(II)原子以第六个配价键与氧进行可逆氧合作用铁卟啉位移呈圆顶状平面状大血红血红蛋白蛋白4个多肽亚基4个2(141)2(146)Fe(
3、II)原子以第六个配价键与氧进行可逆氧合作用去氧血红蛋白（T态）和氧合血红蛋白（R态）小K K蛋白质的性质和分离、纯化1、蛋白质的酸碱性质、蛋白质的酸碱性质等电点等电点 与它所含的酸碱氨基酸数目比例有关与它所含的酸碱氨基酸数目比例有关等离子点等离子点 蛋白质的一个特征常数蛋白质的一个特征常数2蛋白质的胶体性质蛋白质的胶体性质维持蛋白质胶体性质稳定的因素（维持蛋白质胶体性质稳定的因素（3点）点）3蛋白质沉淀的方法蛋白质沉淀的方法 等电点沉淀法等电点沉淀法（可逆、不变性可逆、不变性)盐析法盐析法（可逆、不变性可逆、不变性）有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法（可逆或不可逆可逆或不可逆）重金属盐沉淀法重金属
4、盐沉淀法 （变性变性）生物碱试剂生物碱试剂（变性变性）加热沉淀法加热沉淀法 （变性变性）强酸碱沉淀（不可逆）强酸碱沉淀（不可逆）4蛋白质的变性与复性（蛋白质的变性与复性（温和条件、变性因素、常用变性剂温和条件、变性因素、常用变性剂）5蛋白质的颜色反应6、蛋白质相对分子质量的测定a.根据化学组成测定最低相对分子质量b.渗透压法测定相对分子质量c.沉降分析法（超速离心法）d.凝胶过滤法测定相对分子质量（分子筛层析）此法比较简单，不要求复杂的仪器，就能精确地测出Mre.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定相对分子质量 根据分子大小不同的方法根据分子大小不同的方法透析和超过滤透析和超过滤 利用溶解度差别的纯
5、化方法（利用溶解度差别的纯化方法（实践最常用的方法实践最常用的方法a盐析盐析b有机溶有机溶剂分级分离剂分级分离）根据电荷不同的纯化方法根据电荷不同的纯化方法 （PAGE、醋酸纤维素薄膜电泳、醋酸纤维素薄膜电泳、离子交换层析）离子交换层析）利用选择性吸附的纯化方法利用选择性吸附的纯化方法 利用对配体的特异生物学亲和层析利用对配体的特异生物学亲和层析:一步处理即一步处理即 亲和力的纯亲和力的纯化方法可分离所需蛋白质，纯度很高化方法可分离所需蛋白质，纯度很高7蛋分离纯化白质的（一）蛋白质的含量测定一）蛋白质的含量测定凯氏定氮法凯氏定氮法双缩尿法双缩尿法 Folin-酚试剂法酚试剂法紫外吸收法紫外吸收
6、法考马斯亮蓝结合法考马斯亮蓝结合法 灵敏度高，重复好灵敏度高，重复好胶体金测定法胶体金测定法灵敏度最高灵敏度最高（二）蛋白质的纯度测定（二）蛋白质的纯度测定 电泳、沉降、电泳、沉降、HPLCHPLC和溶解度分析等和溶解度分析等。8蛋白质的含量测定和纯度鉴定蛋白质实验部分 氨基酸纸层析氨基酸纸层析 考马斯亮蓝结合法测定蛋白质浓度考马斯亮蓝结合法测定蛋白质浓度 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质相聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质相对分子质量对分子质量氨基酸纸层析氨基酸纸层析 重重 点点：氨基酸纸上层析法的操作技术 难难 点点：纸层析法的基本原理溶剂前溶剂前层析点层析点原原点点溶剂前沿溶剂前沿亮亮
7、苯丙苯丙缬缬脯脯赖赖相对迁移率 Rf=X/Y考马斯亮蓝结合法测定蛋白质浓考马斯亮蓝结合法测定蛋白质浓度度 重重 点点：考马斯亮蓝法定量测定蛋白质含量的原理和方法实验原理实验原理 考马斯亮蓝能与蛋白质的疏水微区相结合，这种结合具有高敏感性。考马斯亮蓝G250的磷酸溶液呈棕红色，最大吸收峰在465nm。当它与蛋白质结合形成复合物时呈蓝色，其最大吸收峰改变为595nm，考马斯亮蓝G250蛋白质复合物的高消光效应导致了蛋白质定量测定的高敏度。在一定范围内，考马斯亮蓝G250蛋白质复合物呈色后，在595nm下，吸光度与蛋白质含量呈线性关系，其颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比，而与蛋白质的分子量及氨基酸成分
8、无关，因此被广泛地应用。Coomassie brilliant blue G-250 在一定的实验条件下，未知样品的溶液与标准蛋白质溶液同时反应，并于595nm下比色，可以通过标准蛋白质的标准曲线求出未知样品的蛋白质浓度。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质相对分子质量白质相对分子质量 重点掌握：重点掌握：实验原理、整个实验过程的设计与操作，如标准蛋白质的选择、分离胶与浓缩胶浓度的确定与制备、灌胶、样品的处理、上样量及方法的选择。电泳过程中有3种物理效应：样品的浓度效应；对被分离分子的筛选效应；电荷效应。迁移率大小：分子大小分子形状净电荷（荷质比）测定方法用几种标准蛋白质相对分子质量的对数值对它们的迁移率作图。测出待测样品的迁移率。从标准曲线上查出样品的相对分子质量。测定方法
