1、 第二章第二章 固液分离与细胞破碎固液分离与细胞破碎第一节第一节 细胞分离细胞分离一、重力沉降一、重力沉降 重力沉降是化工过程中常用的气固、液固重力沉降是化工过程中常用的气固、液固和液液分离手段，在生物分离过程亦有一和液液分离手段，在生物分离过程亦有一定程度应用。定程度应用。以液固沉降为例以液固沉降为例Fdd=2R球形颗粒沉降的受力情况球形颗粒沉降的受力情况 1 1、球形粒子的、球形粒子的StokesStokes沉降速度沉降速度LLgeeegLsLbsgdvRRRdvfgdfgdf1102442:61:61:42233阻力浮力重力LLsggdv182其中：Re为雷诺准数；为阻力系数；d为颗粒粒
2、径；L为液体粘度；Vg:重力沉降速度;s和 L分别表示颗粒密度和液体密度。2.对于非球形粒子，可用当量直径代入计对于非球形粒子，可用当量直径代入计算沉降速度。再根据颗粒的形状系数对算沉降速度。再根据颗粒的形状系数对计算值进行校正。计算值进行校正。颗粒形状系数定义为颗粒形状系数定义为与非球形颗粒体积相等圆球表面积A非球形颗粒的表面积Aps=AAp=二、离心沉降 离心沉降速度离心沉降速度scvgrNZrNrF222224:4:)(分离因数单位质量离心力LLsd182svrN224222292SrrNdvLLssZg其中：r为离心半径；为旋转角速度；N为离心机转数；S为沉降系数，是溶剂物性的函数。2
3、、离心分离法（1）差速离心分级（Differentialcentrifugation)生化工业中最常用的离心分离法，细生化工业中最常用的离心分离法，细胞的分离为一级分级分离。实际应用胞的分离为一级分级分离。实际应用中据实际物系的特点、分离目的和所中据实际物系的特点、分离目的和所需分离程度，选择适当的离心机转数需分离程度，选择适当的离心机转数和时间，可使料液中不同组分得到分和时间，可使料液中不同组分得到分级分离。级分离。低速离心低速离心 中速离心中速离心 高速离心高速离心 超高速离心超高速离心 细胞匀浆细胞匀浆细胞细胞核仁核仁细胞骨架细胞骨架大细胞器大细胞器小细胞器小细胞器核糖体核糖体大分子大分
4、子 （2 2）密度梯度（区带）离心）密度梯度（区带）离心差速区带离心：调配的密度梯度中的最差速区带离心：调配的密度梯度中的最大密度小于待分离的目标产物的密度。大密度小于待分离的目标产物的密度。离心操作中，料液中的各个组分在密度离心操作中，料液中的各个组分在密度梯度中以不同的速度沉降，根据各个组梯度中以不同的速度沉降，根据各个组分沉降系数不同的差别，形成各自的区分沉降系数不同的差别，形成各自的区带。带。平衡区带离心：调配的介质密度梯度比平衡区带离心：调配的介质密度梯度比差速区带离心的密度梯度大。差速区带离心的密度梯度大。离心操作结果使料液中的高分子溶质在离心操作结果使料液中的高分子溶质在与其自身
5、密度相等的溶剂密度处形成稳与其自身密度相等的溶剂密度处形成稳定的区带，区带中的溶质以该密度为中定的区带，区带中的溶质以该密度为中心，呈高斯分布。心，呈高斯分布。可用于调配密度梯度的物质除蔗糖、聚蔗可用于调配密度梯度的物质除蔗糖、聚蔗糖，还有糖，还有CsCl CsCl（核酸的分离）和（核酸的分离）和NaBr NaBr（脂蛋白的分离）（脂蛋白的分离）。聚蔗糖的商品名称为聚蔗糖的商品名称为FicollFicoll，是蔗糖和，是蔗糖和1-1-氯氯-2-2、3-3-环氧丙烷的高聚物，环氧丙烷的高聚物，Mr=400000Mr=400000，需要高密度和低渗透压梯度，需要高密度和低渗透压梯度时，可用时，可用
6、FicolFicol代替蔗糖。代替蔗糖。离心离心 样品样品蔗糖的稳定梯度蔗糖的稳定梯度慢速沉降成分慢速沉降成分快速沉降成分快速沉降成分分离分离样品样品蔗糖的不蔗糖的不连续梯度连续梯度低浮力密低浮力密度成分度成分高浮力密高浮力密度成分度成分CsCl密度密度梯度梯度离心离心蔗糖蔗糖密度密度梯度梯度离心离心（3）离心分离设备）离心分离设备 实验室主要使用离心管式转子离心机；实验室主要使用离心管式转子离心机；生化上需用冷冻离心机；工业上较常生化上需用冷冻离心机；工业上较常用的有用的有管式管式和和碟片式碟片式两大类。两大类。其中：称为离心沉降面积，是离心机结构和操作条件的函数；L为管长；r2为转筒内径。
7、ggvgLrvQ2222管式离心机的处理能力为：管式离心机的处理能力为：Tubular bowl三、过滤 定义：利用多孔介质（如滤布）截留固定义：利用多孔介质（如滤布）截留固体粒子，进行固液分离的方法。体粒子，进行固液分离的方法。cmLRRpAdtdQAWRc过滤速度其中：A为过滤面积；p为操作压力；Q为滤液体积；L为滤液粘度；Rm和Rc分别为介质和滤饼的阻力；为滤饼的平均比阻；W为滤饼干重。滤饼滤饼传统的过滤cakeConventional filtrationfilterfilterfilterfiltratesolids recovery upon backflushFigure2.1
8、Schematic respresentation od s filter pressConceptual representation of plate and frame filterFlowsheet for continuous rotary vacuum filtrationwash spraysAir connectioncakeContinuos rotary filter WashwaterpumpWashFiltratepumpMoisturetrap30AiroutDryvacuumpumpBarometricsealVacuumreceiversFigure 2.2 Fl
9、owsheet for continuous rotary vacuum filtration 过滤操作中，滤饼阻力是影响过滤速度过滤操作中，滤饼阻力是影响过滤速度的主要因素，因此一般在过滤前需对料的主要因素，因此一般在过滤前需对料液进行絮凝或凝聚等预处理，此外可添液进行絮凝或凝聚等预处理，此外可添加助滤剂加助滤剂(如硅藻土）提高过滤速度。如硅藻土）提高过滤速度。3、过滤设备、过滤设备 生化工业常用的过滤制备主要有：生化工业常用的过滤制备主要有：加压叶滤机加压叶滤机 板框过滤机板框过滤机 回转真空过滤机回转真空过滤机DryWashImmersionKnifeCakeFeedRotaryvacu
10、umfilter真空旋转过滤机第二节第二节 细胞破碎细胞破碎 许多生物产物在细胞培养过程中不能分许多生物产物在细胞培养过程中不能分泌到胞外，而保留在细胞内。泌到胞外，而保留在细胞内。如一些胞内酶、部分外源基因表达产物如一些胞内酶、部分外源基因表达产物和植物细胞产物等。这类生物产物在固和植物细胞产物等。这类生物产物在固液分离后，需对收集到的菌体或细胞进液分离后，需对收集到的菌体或细胞进行细胞破碎（行细胞破碎（Cell disruption)，使目标，使目标产物释放到液相中。产物释放到液相中。除去细胞碎片后，再进行后续分离纯化除去细胞碎片后，再进行后续分离纯化操作。操作。一、细胞的结构一、细胞的结
11、构 不同种类的细胞结构差别很大，破碎的不同种类的细胞结构差别很大，破碎的难易程度不同：难易程度不同：植物细胞真菌（如酵母菌）革兰氏植物细胞真菌（如酵母菌）革兰氏阳性细菌革兰氏阴性细菌动物细胞。阳性细菌革兰氏阴性细菌动物细胞。破碎细胞的目的就是使细胞壁和细胞膜破碎细胞的目的就是使细胞壁和细胞膜受到不同程度的破坏或破碎，释放其中受到不同程度的破坏或破碎，释放其中的目标产物。的目标产物。二、细胞破碎原理二、细胞破碎原理 机械破碎的原理是细胞在机械作用力下受到机械破碎的原理是细胞在机械作用力下受到压缩和剪切而破碎。细胞越小，所需压缩或压缩和剪切而破碎。细胞越小，所需压缩或剪切力越大，越难破碎。剪切力越
12、大，越难破碎。化学破碎又称化学渗透，其原理是利用化学化学破碎又称化学渗透，其原理是利用化学或生化试剂（酶）改变细胞壁或细胞膜结构，或生化试剂（酶）改变细胞壁或细胞膜结构，增大胞内物质的溶出速率；或者完全溶解细增大胞内物质的溶出速率；或者完全溶解细胞壁，形成原生质体后，在渗透压作用下使胞壁，形成原生质体后，在渗透压作用下使细胞膜破裂而释放胞内物质。细胞膜破裂而释放胞内物质。三、细胞破碎法三、细胞破碎法高 压 匀 浆珠 磨 破 碎撞 击 破 碎超 声 破 碎机 械 破 碎 法化 学 试 剂 处 理酶 溶化 学 破 碎 法渗 透 压 冲 击 法冻 结 融 化 法物 理 破 碎 法细 胞 破 碎 法
13、1、机械破碎法、机械破碎法（1）高压匀浆）高压匀浆 破碎原理：主要利用细胞悬液在高压作用破碎原理：主要利用细胞悬液在高压作用下液相剪切力以及细胞与固定表面的撞击下液相剪切力以及细胞与固定表面的撞击力而使之破碎。力而使之破碎。baNkpS11ln其中：S为细胞破碎率；p为操作压力；N为循环操作次数；k为破碎速率常数，与细胞种类和操作温度有关。特点：适用于酵母和大多数细菌细胞的破碎，特点：适用于酵母和大多数细菌细胞的破碎，不宜用于团状或丝状菌的破碎；由于操作中温不宜用于团状或丝状菌的破碎；由于操作中温度会升高，需对料液作冷却处理，保护目的产度会升高，需对料液作冷却处理，保护目的产物活性。物活性。影
14、响因素：主要有压力、循环操作次数和温度等。影响因素：主要有压力、循环操作次数和温度等。（2）珠磨破碎 破碎原理：利用在高速搅拌作用下，细胞和微球相互磨擦碰撞而破碎。影响因素：主要有搅拌速度、细胞浓度、影响因素：主要有搅拌速度、细胞浓度、微球粒径、密度、填充率和接触时间等。微球粒径、密度、填充率和接触时间等。ktS11ln其中：S 为细胞破碎率；k 为破碎速率常数，与微球粒径、密度、填充 率以及细胞浓度、搅拌速度和搅拌桨形状等有关；t 在间歇操作时为破碎操作时间，连续操作时 t=V/Q 为破碎室内平均停留时间 (V为 破碎室有效体积；Q为细胞悬浮液的流量）。特点：特点：适用范围较广；但有效能量利
15、用率很低，适用范围较广；但有效能量利用率很低，应充分考虑冷却系统的热交换能力；应充分考虑冷却系统的热交换能力；影响破碎率的操作参数较多，过程优化影响破碎率的操作参数较多，过程优化设计较复杂。设计较复杂。珠粒径合适为好。破碎率与微珠直径的珠粒径合适为好。破碎率与微珠直径的关系：微珠粒径关系：微珠粒径/菌体菌体=30100间较合适。间较合适。（3）撞击破碎）撞击破碎 破碎原理：细胞冷冻后成为易于破碎的刚破碎原理：细胞冷冻后成为易于破碎的刚性球体，高速撞击固定的撞击板使其破碎。性球体，高速撞击固定的撞击板使其破碎。特点：特点：细胞破碎均匀；可通过调节载气压细胞破碎均匀；可通过调节载气压力控制细胞破碎
16、程度；力控制细胞破碎程度；适用于细胞器（如线粒体、叶绿体）适用于细胞器（如线粒体、叶绿体）的回收。的回收。间歇、连续操作均可，适用于大多间歇、连续操作均可，适用于大多数微生物细胞和植物细胞破碎。数微生物细胞和植物细胞破碎。（4）超声波破碎 破碎原理：超声波作用下液体发生空化作破碎原理：超声波作用下液体发生空化作用，产生极大的冲击波和剪切力，使细胞用，产生极大的冲击波和剪切力，使细胞破碎。破碎。影响因素：细胞种类、浓度和超声波的能影响因素：细胞种类、浓度和超声波的能量等。量等。特点：它是很强烈的破碎方法；适用范围特点：它是很强烈的破碎方法；适用范围广；但有效能量利用率极低，对冷却的要广；但有效能
17、量利用率极低，对冷却的要求相当苛刻，故不易放大，多在实验室使求相当苛刻，故不易放大，多在实验室使用。用。2.Ultrasonication 超声波超声波超声波破碎仪 WSK卧式高效全能珠磨机3.Crushing in ball mill 珠磨法珠磨法 ZM系列系列卧式密闭珠卧式密闭珠(砂砂)磨机磨机JJ-2组织捣碎匀浆机 2、化学破碎法（1）化学试剂处理 破碎原理：用酸碱、表面活性剂、破碎原理：用酸碱、表面活性剂、螯合剂、有机溶剂或变性剂等处理螯合剂、有机溶剂或变性剂等处理细胞，增大细胞壁或细胞膜的通透细胞，增大细胞壁或细胞膜的通透性，或者降低胞内物质间相互作用，性，或者降低胞内物质间相互作用
18、，使目的产物易于释放。使目的产物易于释放。（2）酶溶）酶溶 破碎原理：利用溶解细胞壁的酶处破碎原理：利用溶解细胞壁的酶处理菌体细胞，增大胞内产物的通透理菌体细胞，增大胞内产物的通透性。性。特点：不同的菌体用不同的酶。特点：不同的菌体用不同的酶。如溶菌酶适用于细菌；而酵母细胞如溶菌酶适用于细菌；而酵母细胞的酶溶需用的酶溶需用Zymolyase、-1,6-葡聚葡聚糖酶或甘露糖酶；破坏植物细胞则糖酶或甘露糖酶；破坏植物细胞则用纤维素酶。用纤维素酶。自溶：是一种自溶：是一种诱使诱使细胞产生溶解自身细胞产生溶解自身的酶的的酶的特殊特殊的酶溶法。的酶溶法。微生物代谢过程中都能产生一种水解微生物代谢过程中都
19、能产生一种水解细胞壁上聚合结构的酶，以便使生长细胞壁上聚合结构的酶，以便使生长过程进行下去，改变微生物环境，可过程进行下去，改变微生物环境，可诱发诱发微生物产生过剩自溶酶或激发产微生物产生过剩自溶酶或激发产生其它自溶酶，以达到自溶的目的，生其它自溶酶，以达到自溶的目的，影响自溶的因素有温度、时间、影响自溶的因素有温度、时间、pH、缓冲液浓度、细胞代谢途径等。微生缓冲液浓度、细胞代谢途径等。微生物细胞自溶常采用物细胞自溶常采用加热法加热法或或干燥法干燥法。小结 机械破碎法机械破碎法优点：处理量大、优点：处理量大、破碎效率高、速度破碎效率高、速度快，适用于工业规快，适用于工业规模的细胞破碎。模的细
20、胞破碎。缺点：由于操作条缺点：由于操作条件比较剧烈，往往件比较剧烈，往往容易造成细胞的过容易造成细胞的过度破碎，不利于后度破碎，不利于后续处理。续处理。化学破碎法化学破碎法 优点：选择性高，胞内优点：选择性高，胞内产物的总释放率低，料产物的总释放率低，料液粘度小，有利于后处液粘度小，有利于后处理过程。理过程。缺点：适用范围小，通缺点：适用范围小，通用性差，破碎速度慢，用性差，破碎速度慢，处理时间长，破碎效率处理时间长，破碎效率低，不适于大规模细胞低，不适于大规模细胞破碎操作。多用于实验破碎操作。多用于实验室。室。两种方法各有利弊，把二者结合起来使用，两种方法各有利弊，把二者结合起来使用，则可起
21、到取长补短的作用，能够得到很好则可起到取长补短的作用，能够得到很好的破碎效果。的破碎效果。如面包酵母用如面包酵母用Zymolyase酶解，再高压匀浆酶解，再高压匀浆4 4次，破碎率次，破碎率100%100%，而单纯高压匀浆破碎率，而单纯高压匀浆破碎率为为32%32%。3、物理渗透法、物理渗透法（1）渗透压冲击法）渗透压冲击法 破碎原理：细胞在高渗透压介质中平破碎原理：细胞在高渗透压介质中平衡后，再突然将其转至低渗透压环境衡后，再突然将其转至低渗透压环境中（如高浓度甘油或蔗糖水或低渗透中（如高浓度甘油或蔗糖水或低渗透压缓冲液中），水大量进入细胞，使压缓冲液中），水大量进入细胞，使细胞壁或细胞膜胀
22、破。细胞壁或细胞膜胀破。特点：最温和的细胞破碎法；适用于特点：最温和的细胞破碎法；适用于易于破碎的细胞，如动物细胞和革兰易于破碎的细胞，如动物细胞和革兰氏阴性菌。氏阴性菌。（2）冻结融化法）冻结融化法 破碎原理：将细胞放在低温下突然冷冻和破碎原理：将细胞放在低温下突然冷冻和室温下融化，反复多次达到破壁作用室温下融化，反复多次达到破壁作用 由于冷冻，一方面使细胞膜的疏水键结构由于冷冻，一方面使细胞膜的疏水键结构破坏，另一方面胞内水结晶，使细胞内外破坏，另一方面胞内水结晶，使细胞内外溶液浓度变化，引起细胞突然膨胀而破裂溶液浓度变化，引起细胞突然膨胀而破裂 特点：适用于大肠杆菌和细胞壁较薄的细特点：
23、适用于大肠杆菌和细胞壁较薄的细胞，但通常破碎率很低（小于胞，但通常破碎率很低（小于 10%），还，还可能引起对冻融敏感的某些蛋白质的变性。可能引起对冻融敏感的某些蛋白质的变性。操作方便，但耗时、耗能，大规模应用困操作方便，但耗时、耗能，大规模应用困难。难。小结 细胞间及目标产物之间的性质差别大，实细胞间及目标产物之间的性质差别大，实际的破碎操作仍需通过实验来确定合适的破际的破碎操作仍需通过实验来确定合适的破碎方法（理论指导少），最好是实现目标产碎方法（理论指导少），最好是实现目标产物的选择性释放，在满足目标产物回收率的物的选择性释放，在满足目标产物回收率的前提下，尽量降低细胞的破碎程度，以利于
24、前提下，尽量降低细胞的破碎程度，以利于后续分离纯化操作。后续分离纯化操作。除研究破碎细胞的方法外，还应研究生除研究破碎细胞的方法外，还应研究生物合成过程中减低细胞牢固程度的方法。物合成过程中减低细胞牢固程度的方法。例：已发现发酵过程中改变温度、培养例：已发现发酵过程中改变温度、培养基或加入抗生素等，使某些细菌减少合基或加入抗生素等，使某些细菌减少合成细胞壁的某种组分，便于细胞的破碎。成细胞壁的某种组分，便于细胞的破碎。思考题 1、33页页 习题习题5 2、细胞破碎的主要方法有哪些？其适用、细胞破碎的主要方法有哪些？其适用范围、优缺点是什么？范围、优缺点是什么？3、区带离心法分为、区带离心法分为_ 离心离心、_ 离心。区带离心法可用于离心。区带离心法可用于_ 、_等生物大分子的分离等生物大分子的分离纯化，但处理量小，一般仅限于实验室纯化，但处理量小，一般仅限于实验室水平。水平。本章内容到此结束本章内容到此结束同学们辛苦了同学们辛苦了
