1、1第十六章第十六章肝胆疾病肝胆疾病的生物化学检验的生物化学检验 基础医学与医学技术学院基础医学与医学技术学院姜旭淦姜旭淦2第一节第一节 肝胆的结构及功能概述肝胆的结构及功能概述一、一、肝脏的结构与血液供应特点肝脏的结构与血液供应特点二、肝脏的主要功能二、肝脏的主要功能 （一）物质代谢功能（一）物质代谢功能 （二）肝脏的生物转化功能（二）肝脏的生物转化功能 （三）分泌与排泄功能（三）分泌与排泄功能3一、一、肝脏的结构与血液供应特点肝脏的结构与血液供应特点有丰富的血管网，接受门静脉和肝动脉的双重血液供应，有丰富的血管网，接受门静脉和肝动脉的双重血液供应，有肝静脉和胆道系统出肝。有肝静脉和胆道系统出
2、肝。细胞表面大量的微绒毛，增大了与血窦的接触面，有利细胞表面大量的微绒毛，增大了与血窦的接触面，有利于物质的转运。于物质的转运。细胞内含丰富的线粒体、内质网、高尔基复合体等亚细细胞内含丰富的线粒体、内质网、高尔基复合体等亚细胞结构，是肝细胞进行物质代谢的场所。胞结构，是肝细胞进行物质代谢的场所。众多的酶系是肝细胞进行物质代谢与加工的物质条件。众多的酶系是肝细胞进行物质代谢与加工的物质条件。4二、肝脏的主要功能二、肝脏的主要功能（一）（一）物质代谢功能物质代谢功能 分分 类类肝脏正常物质代谢功能肝脏正常物质代谢功能 糖代谢糖代谢 糖原合成糖原合成 糖原分解糖原分解 糖异生作用糖异生作用脂类代谢脂
3、类代谢 促进脂类的消化与吸收。促进脂类的消化与吸收。合成甘油三酯、磷脂、胆固醇及脂蛋白合成甘油三酯、磷脂、胆固醇及脂蛋白 甘油三酯、磷脂、胆固醇及脂蛋白的代谢场所甘油三酯、磷脂、胆固醇及脂蛋白的代谢场所 产生酮体产生酮体 蛋白质代谢蛋白质代谢 合成与分泌血浆蛋白质（除合成与分泌血浆蛋白质（除-球蛋白）。球蛋白）。清除血浆蛋白（除清蛋白）。清除血浆蛋白（除清蛋白）。分解苯丙氨酸、酪氨酸及色氨酸等芳香族氨基酸分解苯丙氨酸、酪氨酸及色氨酸等芳香族氨基酸 合成尿素合成尿素 激素代谢激素代谢 在肝脏中灭活在肝脏中灭活 维生素代谢维生素代谢 维生素维生素A,E,K和和B12的主要储存场所的主要储存场所 维
4、生素维生素K参与肝细胞内凝血酶原及凝血因子的合成。参与肝细胞内凝血酶原及凝血因子的合成。将维生素将维生素D转化为转化为25-羟维生素羟维生素D 5（二）（二）肝脏的生物转化功能肝脏的生物转化功能 肝脏通过生物转化作用对非营养物质进行改造，可增肝脏通过生物转化作用对非营养物质进行改造，可增加其溶解度，降低毒性，有利于排出体外。生物转化作加其溶解度，降低毒性，有利于排出体外。生物转化作用具有解毒与致毒双重性。用具有解毒与致毒双重性。（三）分泌与排泄功能（三）分泌与排泄功能 胆汁胆汁6胆胆 汁汁胆汁胆汁肝细胞分泌的一种液体，通过胆管系统进肝细胞分泌的一种液体，通过胆管系统进入十二指肠。入十二指肠。肝
5、胆汁：从肝脏初分泌的胆汁。肝胆汁：从肝脏初分泌的胆汁。胆囊胆汁：肝胆汁进入胆囊后，胆囊壁吸收肝胆胆囊胆汁：肝胆汁进入胆囊后，胆囊壁吸收肝胆汁中的水、盐及其它一些成分，同时也分泌粘液渗汁中的水、盐及其它一些成分，同时也分泌粘液渗入胆汁，使胆汁浓缩。入胆汁，使胆汁浓缩。胆汁的成分胆汁的成分胆汁酸盐、胆色素胆汁酸盐、胆色素 酶类酶类脂肪酶、磷脂酶、淀粉酶、磷酸酶脂肪酶、磷脂酶、淀粉酶、磷酸酶7 正常人胆汁的性状和组成百分比正常人胆汁的性状和组成百分比 肝胆汁肝胆汁 胆囊胆汁胆囊胆汁比重比重 1.0091.013 1.0261.032pH 7.18.5 5.57.7固体成分固体成分 34 1420无机
6、盐无机盐 0.20.9 0.51.1粘蛋白粘蛋白 0.10.9 14胆汁酸盐胆汁酸盐 0.22 1.510胆色素胆色素 0.050.17 0.21.5总酯类总酯类 0.10.5 1.84.7胆固醇胆固醇 0.050.17 0.20.9磷脂磷脂 0.050.08 0.20.58三、肝功能异常与物质代谢三、肝功能异常与物质代谢v蛋白质代谢变化蛋白质代谢变化v糖代谢的变化糖代谢的变化v脂类代谢变化脂类代谢变化9合成与分泌合成与分泌90以上的血浆蛋白质以上的血浆蛋白质转化和分解氨基酸转化和分解氨基酸合成尿素合成尿素（一）蛋白质代谢变化肝脏在蛋白质代谢中的作用主要包括：肝脏在蛋白质代谢中的作用主要包括：
7、10v急性肝损害时，血浆急性肝损害时，血浆总蛋白与清蛋白总蛋白与清蛋白浓度浓度变化不大，而半衰期短的蛋白质下降明显，变化不大，而半衰期短的蛋白质下降明显，如前清蛋白如前清蛋白。v慢性肝病时慢性肝病时，清蛋白与球蛋白（，清蛋白与球蛋白（A/G）的）的比值降低，甚至倒置。比值降低，甚至倒置。1、血浆总蛋白与清蛋白112、前清蛋白(Prealbumin)M=55.0KD，t1/2=1.9d，是甲状腺素结合蛋白，转运，是甲状腺素结合蛋白，转运1520%T4，同时协助转运视黄醇结合蛋白（，同时协助转运视黄醇结合蛋白（Rbp）。）。临床意义：临床意义：v早期肝损伤的灵敏指标早期肝损伤的灵敏指标v消化道恶性
8、肿瘤及肺癌时降低消化道恶性肿瘤及肺癌时降低v可作营养学指标（与可作营养学指标（与Rbp、Trf、Alb同时检测）同时检测）12v 急性时反应蛋白：急性时反应蛋白：CER、AAT等在慢性炎症等在慢性炎症性疾病中的变化性疾病中的变化v凝血因子：凝血因子：肝损害时，凝血因子肝损害时，凝血因子II、VII、IX、X 等生成减少，血液凝固性降低，患者呈现出等生成减少，血液凝固性降低，患者呈现出血倾向血倾向3、其他蛋白的变化13轻度肝脏损害很少出现糖平衡紊乱轻度肝脏损害很少出现糖平衡紊乱 严重肝损害时，血糖难以维持正常水平，严重肝损害时，血糖难以维持正常水平，空腹易出现低血糖，进食后易出现血糖升空腹易出现
9、低血糖，进食后易出现血糖升高并可持续较长时间高并可持续较长时间 （二）糖代谢的变化14（三）脂类代谢变化严重肝损害时严重肝损害时HDL、LCAT与与 LPL合成减少合成减少血浆胆固醇酯含量减少血浆胆固醇酯含量减少慢性肝内外胆汁淤积者可出现异常的脂蛋白慢性肝内外胆汁淤积者可出现异常的脂蛋白-X（Lipoprotein-X，LP-X）酒精性肝损伤时酒精性肝损伤时apoA-I的表达增加，的表达增加，HDL特特别是别是HDL3可能升高可能升高 15第二节第二节 胆红素代谢与黄疸胆红素代谢与黄疸v胆色素（胆色素（bile pigment）胆红素（胆红素（bilirubin）胆绿素（胆绿素（bilverd
10、in）胆素原（胆素原（bilinogen）胆素（胆素（bilin）v胆红素代谢是胆色素代谢的中心。胆红素代谢是胆色素代谢的中心。v肝脏是胆红素代谢的重要器官。肝脏是胆红素代谢的重要器官。16一、胆红素的来源一、胆红素的来源 v1衰老红细胞破坏，释放出的血红蛋白，衰老红细胞破坏，释放出的血红蛋白，分解生成，占分解生成，占7080 。v2非血红蛋白的血红素，占非血红蛋白的血红素，占1020。v3骨髓无效造血产生的血红素。骨髓无效造血产生的血红素。17胆红素的生成胆红素的生成部位部位：肝、脾、骨髓等网状内皮系统：肝、脾、骨髓等网状内皮系统参加反应的酶参加反应的酶：加单氧酶、：加单氧酶、NADPH、N
11、ADPH-细胞色素细胞色素P450还原酶、胆绿素还原酶还原酶、胆绿素还原酶18二、胆红素代谢二、胆红素代谢19（一）胆红素分子的空间构象（一）胆红素分子的空间构象 20（二）未结合胆红素在血液中的运输（二）未结合胆红素在血液中的运输 1.血浆清蛋白是胆红素的主要运输载体血浆清蛋白是胆红素的主要运输载体v清蛋白分子上有二类胆红素结合位点清蛋白分子上有二类胆红素结合位点高亲和力位点高亲和力位点和低亲和力位点。高亲和力位点可结合和低亲和力位点。高亲和力位点可结合2025mg胆红胆红素素/dl血液。血浆胆红素浓度大大超过血液。血浆胆红素浓度大大超过25mgdl时，低时，低亲和力位点才发挥作用。亲和力位
12、点才发挥作用。v生理意义：改变了胆红素的脂溶性，加强了血液对胆红生理意义：改变了胆红素的脂溶性，加强了血液对胆红素的运输能力；限制了胆红素自由穿透各种生物膜，进素的运输能力；限制了胆红素自由穿透各种生物膜，进入细胞，避免了胆红素对组织细胞的毒害作用。入细胞，避免了胆红素对组织细胞的毒害作用。212.影响胆红素影响胆红素-清蛋白结合的因素清蛋白结合的因素v（1）某些阴离子某些阴离子与胆红素竞争清蛋白与胆红素竞争清蛋白的结合位点。的结合位点。v（2）药物药物磺胺药、抗生素、水杨酸等，磺胺药、抗生素、水杨酸等，可将胆红素从复合物中置换出来。可将胆红素从复合物中置换出来。22（三）胆红素在肝脏中的转变
13、（三）胆红素在肝脏中的转变 1.肝细胞对胆红素的摄取和转运肝细胞对胆红素的摄取和转运v当胆红素清蛋白复合体运至肝窦时，胆红素与肝细当胆红素清蛋白复合体运至肝窦时，胆红素与肝细胞膜上受体结合，清蛋白从复合体上脱离，胆红素被胞膜上受体结合，清蛋白从复合体上脱离，胆红素被转移至肝细胞膜内表面，与胞液中转移至肝细胞膜内表面，与胞液中Y蛋白和蛋白和Z蛋蛋白结合，转运至内质网。白结合，转运至内质网。vY蛋白：碱性蛋白，分子量蛋白：碱性蛋白，分子量4446kD，为配基结合蛋，为配基结合蛋白白(ligadin)。新生儿出生。新生儿出生7周后，才达到与成人相近周后，才达到与成人相近的水平。的水平。临床常见临床常
14、见新生儿溶血性黄疸新生儿溶血性黄疸。苯巴比妥苯巴比妥可诱导可诱导Y蛋白的合成，用此药治疗新生儿黄疸蛋白的合成，用此药治疗新生儿黄疸。vZ蛋白：酸性蛋白质，分子量蛋白：酸性蛋白质，分子量1214kD。Z蛋白对长蛋白对长链脂肪酸的亲和力极大，又称脂肪酸结合蛋白。链脂肪酸的亲和力极大，又称脂肪酸结合蛋白。232.肝细胞对胆红素的转化作用肝细胞对胆红素的转化作用24（四）胆色素的排泄（四）胆色素的排泄及胆素原的肠肝循环及胆素原的肠肝循环 1.胆红素在肠道中的转变胆红素在肠道中的转变 结合胆红素随胆汁排出后，进结合胆红素随胆汁排出后，进入十二指肠，在肠道细菌的作用下，入十二指肠，在肠道细菌的作用下，先先
15、脱去葡萄糖醛酸脱去葡萄糖醛酸，再逐步被还原，再逐步被还原成成无色无色的的胆素原族化合物胆素原族化合物中胆素原中胆素原(mesobilirubinogen)粪胆素原粪胆素原(stercobilinogen)尿胆素原尿胆素原(urobilinogen)）252.2.胆素原的肠肝循环胆素原的肠肝循环 v约约8090的胆素原随粪便排出，与空气接触后，的胆素原随粪便排出，与空气接触后，氧化为胆素（氧化为胆素（L尿胆素、尿胆素、D尿胆素、粪胆尿胆素、粪胆素）。素）。v1020胆素原，被肠道粘膜重吸收，经门静脉胆素原，被肠道粘膜重吸收，经门静脉进入肝脏，其中大部分由肝细胞摄取后，再随胆进入肝脏，其中大部分由
16、肝细胞摄取后，再随胆汁分泌入胆道排入肠腔汁分泌入胆道排入肠腔“胆素原的肠肝循胆素原的肠肝循环环”(entero-hepatic bilinogen cycle)。少部分。少部分随血液进入体循环，通过肾脏，从尿中排出。随血液进入体循环，通过肾脏，从尿中排出。26胆素原的肠肝循环胆素原的肠肝循环（bilinogen enterohepatic circulation）27三、黄疸及其类型三、黄疸及其类型（一）黄疸定义（一）黄疸定义 凡能引起胆红素生成过多、或肝细胞对凡能引起胆红素生成过多、或肝细胞对胆红素的摄取、结合和排泄过程发生障碍胆红素的摄取、结合和排泄过程发生障碍等因素均可使血中胆红素增高，
17、而出现高等因素均可使血中胆红素增高，而出现高胆红素血症胆红素血症(hyperbilirubinemia)。胆红素是金黄色色素，当血清中浓度高胆红素是金黄色色素，当血清中浓度高时，则可扩散入组织，组织被染黄，称为时，则可扩散入组织，组织被染黄，称为黄疸（黄疸（jaundice）。）。28黄疸的发生机制 v胆红素形成过多胆红素形成过多v肝细胞处理胆红素的能力下降肝细胞处理胆红素的能力下降 v胆红素在肝外的排泄障碍胆红素在肝外的排泄障碍 29（二）黄疸的类型（二）黄疸的类型v根据肉眼可否见到黄染现象：显性黄疸和隐性根据肉眼可否见到黄染现象：显性黄疸和隐性黄疸。黄疸。v根据发病原因：溶血性、肝细胞性和
18、梗阻性黄根据发病原因：溶血性、肝细胞性和梗阻性黄疸。疸。v根据病变部位：肝前性、肝性和肝后性黄疸。根据病变部位：肝前性、肝性和肝后性黄疸。v根据血中升高的胆红素的类型：高未结合胆红根据血中升高的胆红素的类型：高未结合胆红素性黄疸及高结合胆红素性黄疸。素性黄疸及高结合胆红素性黄疸。301.溶血性黄疸溶血性黄疸 胆红素代谢特点胆红素代谢特点 v血中未结合胆红素含量增高；总胆红素升高，血中未结合胆红素含量增高；总胆红素升高，结合胆红素仅为总胆红素的结合胆红素仅为总胆红素的20%。v未结合胆红素不能由肾小球滤过，故尿中无胆未结合胆红素不能由肾小球滤过，故尿中无胆红素排出。红素排出。v肝最大限度地处理和
19、排泄胆红素，因而肠道中肝最大限度地处理和排泄胆红素，因而肠道中形成的胆素原增多，粪便排出的胆素原也增多，形成的胆素原增多，粪便排出的胆素原也增多，粪便颜色加深。粪便颜色加深。v尿中排出的胆素原也相应增加，胆红素阴性。尿中排出的胆素原也相应增加，胆红素阴性。312.肝细胞性黄疸肝细胞性黄疸 胆红素代谢特点胆红素代谢特点 v血中两种胆红素含量都增高。总胆红素升高，结血中两种胆红素含量都增高。总胆红素升高，结合胆红素占总胆红素的合胆红素占总胆红素的35%以上。以上。v结合胆红素可由肾小球滤过，尿中出现胆红素。结合胆红素可由肾小球滤过，尿中出现胆红素。v结合胆红素在肝内生成减少，粪便颜色变浅。结合胆红
20、素在肝内生成减少，粪便颜色变浅。v尿中胆素原含量变化不定。一方面是从肠吸收的尿中胆素原含量变化不定。一方面是从肠吸收的胆素原不能有效地随胆汁排出，使血中胆素原增胆素原不能有效地随胆汁排出，使血中胆素原增加，尿中胆素原增加；另一方面是肝实质性损伤加，尿中胆素原增加；另一方面是肝实质性损伤及炎症、肿胀等造成肝、胆管阻塞，结合胆红素及炎症、肿胀等造成肝、胆管阻塞，结合胆红素不能排入肠道，尿中胆素原减少。不能排入肠道，尿中胆素原减少。323.梗阻性黄疸梗阻性黄疸 胆红素代谢特点胆红素代谢特点 v血中结合胆红素含量增高，总胆红素升高，结合血中结合胆红素含量增高，总胆红素升高，结合胆红素占总胆红素的胆红素
21、占总胆红素的50%以上。以上。v结合胆红素能被肾小球滤过，尿中出现胆红素。结合胆红素能被肾小球滤过，尿中出现胆红素。v胆红素不易或不能随胆汁排入肠道，因而肠腔胆胆红素不易或不能随胆汁排入肠道，因而肠腔胆素原很少或缺失，粪便颜色变浅或呈灰白色。素原很少或缺失，粪便颜色变浅或呈灰白色。v尿中排出的胆素原也相应变少，胆红素阳性。尿中排出的胆素原也相应变少，胆红素阳性。33（三）三种类型黄疸的实验室鉴别诊断（三）三种类型黄疸的实验室鉴别诊断类类 型型 血血 液液 尿尿 液液 未结合胆红素未结合胆红素 结合胆红素结合胆红素 胆红素胆红素 胆素原胆素原正正 常常 有有 无或极微无或极微 阴性阴性 阳性阳性
22、 棕黄色棕黄色溶血性黄疸溶血性黄疸 高度增加高度增加 正常或微增正常或微增 阴性阴性 显著增加显著增加 加深加深肝细胞性黄疸肝细胞性黄疸 增加增加 增加增加 阳性阳性 不定不定 变浅变浅梗阻性黄疸梗阻性黄疸 不变或微增不变或微增 高度增加高度增加 强阳性强阳性 减少或消失减少或消失 变浅或陶土色变浅或陶土色 粪便颜色粪便颜色34 项项 目目 肝细胞性黄疸肝细胞性黄疸 梗阻性黄疸梗阻性黄疸血清蛋白电泳图谱血清蛋白电泳图谱 Alb减少，减少，球蛋白球蛋白 球蛋白明显球蛋白明显脂蛋白脂蛋白X 多为阴性多为阴性 明显明显血清酶学血清酶学 ALT 肝炎急性期肝炎急性期 正常或增高正常或增高 ALP 正常
23、或轻度增高正常或轻度增高 明显升高明显升高 LAP 可增高可增高 明显升高明显升高 -GT 可增高可增高 明显升高明显升高其他方面其他方面 凝血酶原时间凝血酶原时间 延长，延长，VitK不能纠正不能纠正 延长，延长，VitK可以纠正可以纠正 胆固醇胆固醇 降低，尤其降低，尤其CHE明显降低明显降低 增高增高 CA/CDCA 1 1 肝细胞性黄疸和梗阻性黄疸的实验室鉴别诊断肝细胞性黄疸和梗阻性黄疸的实验室鉴别诊断35总胆红素：总胆红素：5.119.0mol/L。结合胆红素：结合胆红素：1.76.8mol/L。未结合胆红素：未结合胆红素：1.710.2mol/L。结合胆红素结合胆红素/未结合胆红素
24、：未结合胆红素：0.20.40。1判断有无黄疸及黄疸的程度判断有无黄疸及黄疸的程度 2协助鉴别黄疸类型协助鉴别黄疸类型 3反映肝细胞损害程度和判断预后反映肝细胞损害程度和判断预后 36D D-胆红素（胆红素（d d）v在血液循环中结合胆红素和清蛋白形成的。在血液循环中结合胆红素和清蛋白形成的。v清蛋白藉缓慢的非酶作用置换了原葡萄糖醛酸酯。清蛋白藉缓慢的非酶作用置换了原葡萄糖醛酸酯。类似于糖化血红蛋白。类似于糖化血红蛋白。v在长期的高结合胆红素血症患者的血液内，才能被在长期的高结合胆红素血症患者的血液内，才能被检测出来。检测出来。v在血液循环中的清除缓慢。半衰期和清蛋白一样，在血液循环中的清除缓
25、慢。半衰期和清蛋白一样，2 23 3周。周。v因为因为D D-胆红素不存在氢键的影响，所以胆红素不存在氢键的影响，所以D D胆红素完胆红素完全参与重氮直接胆红素反应。全参与重氮直接胆红素反应。与清蛋白共价结合胆红素与清蛋白共价结合胆红素Bd d37胆红素测定胆红素测定 v临床主要方法：改良临床主要方法：改良JG法、胆红素氧化酶法、胆红素氧化酶法、钒酸氧化法。法、钒酸氧化法。v目前我国推荐的临床实验室测定血清胆红素目前我国推荐的临床实验室测定血清胆红素的主要方法是改良的主要方法是改良Jendrassile和和Grof方法方法（改良（改良JG法）和胆红素氧化酶法。法）和胆红素氧化酶法。38（一）改
26、良（一）改良J-GJ-G（Jendrassik and GrofJendrassik and Grof）法）法（重氮试剂法）（重氮试剂法）v原理原理：血清中结合胆红素可直接与重氮试剂反应产生偶氮：血清中结合胆红素可直接与重氮试剂反应产生偶氮双吡咯胆红素；未结合胆红素须用双吡咯胆红素；未结合胆红素须用加速剂加速剂咖啡因咖啡因-苯甲酸苯甲酸钠破坏其分子内氢键后才能与重氮试剂反应，也产生偶氮钠破坏其分子内氢键后才能与重氮试剂反应，也产生偶氮双吡咯胆红素。双吡咯胆红素。重氮反应时重氮反应时pH6.5pH6.5，反应后加入碱性酒石酸钠使紫色偶，反应后加入碱性酒石酸钠使紫色偶氮胆红素转变成蓝色偶氮胆红素，
27、在氮胆红素转变成蓝色偶氮胆红素，在600nm600nm波长比色。波长比色。391咖啡因咖啡因-苯甲酸钠试剂苯甲酸钠试剂 2碱性酒石酸钠溶液碱性酒石酸钠溶液 35g/L亚硝酸钠溶液亚硝酸钠溶液 45g/L对氨基苯磺酸溶液对氨基苯磺酸溶液 5重氮试剂重氮试剂 65.0g/L叠氮钠溶液叠氮钠溶液 7胆红素标准液胆红素标准液8.分光光度计分光光度计试剂与器材试剂与器材 40加入物（加入物（mlml）血清血清 咖啡因苯甲酸钠试剂咖啡因苯甲酸钠试剂对氨基苯磺酸溶液对氨基苯磺酸溶液 重氮试剂重氮试剂 每加一种试剂后立即混匀，加重氮试剂后室温放置每加一种试剂后立即混匀，加重氮试剂后室温放置10min 叠氮钠溶
28、液叠氮钠溶液 咖啡因苯甲酸钠试剂咖啡因苯甲酸钠试剂 碱性酒石酸钠溶液碱性酒石酸钠溶液 总胆红素管总胆红素管 0.21.60.4-1.2结合胆红素管结合胆红素管 0.2-0.40.051.551.2对照管对照管 0.21.60.4-1.2 混匀后，波长混匀后，波长600nm，对照管调零，读取吸光度，在标准，对照管调零，读取吸光度，在标准曲线上查出相应的胆红素浓度。曲线上查出相应的胆红素浓度。操作步骤操作步骤 41改良J-G法测定原理v重氮试剂：重氮试剂：亚硝酸钠亚硝酸钠+对氨基苯磺酸对氨基苯磺酸v加速剂（咖啡因加速剂（咖啡因+苯甲酸钠）：苯甲酸钠）：破坏破坏游离胆红素游离胆红素分子内分子内氢键，
29、使之与重氮试剂反应生成偶氮胆氢键，使之与重氮试剂反应生成偶氮胆红素红素 v碱性酒石酸钠：碱性酒石酸钠：使吸光度由使吸光度由530nm 598nmv叠氮钠（或抗坏血酸）：叠氮钠（或抗坏血酸）：中止反应，防止游离中止反应，防止游离胆红素缓慢反应胆红素缓慢反应42优点：优点：v灵敏度高灵敏度高v精密度、准确度好精密度、准确度好 v误差因素少误差因素少 v1037不受温度变化影响，呈色反应在不受温度变化影响，呈色反应在2h内非内非常稳定常稳定缺点：缺点：不适用于自动化分析，严重溶血可使结果偏低不适用于自动化分析，严重溶血可使结果偏低，易受脂血干扰易受脂血干扰 改良J-G法的优缺点43正确认识正确认识结
30、合胆红素的结合胆红素的重氮反应重氮反应与与重氮直接胆红素重氮直接胆红素44结合胆红素结合胆红素 结合胆红素参与反应非常快，整个反应只要结合胆红素参与反应非常快，整个反应只要1 1分钟，被称为分钟，被称为“1 1分钟胆红素分钟胆红素”或直接胆红或直接胆红素素。结合胆红素参与反应的影响因素很多。结合胆红素参与反应的影响因素很多。例如：反应时使用的重氮试剂的浓度、例如：反应时使用的重氮试剂的浓度、pHpH、反应时间等。结合胆红素在重氮反应的初期反应时间等。结合胆红素在重氮反应的初期确实很快，但是，要使所有结合胆红素完全确实很快，但是，要使所有结合胆红素完全参与反应，需要参与反应，需要3030分钟以上
31、。分钟以上。目前推荐目前推荐1010分钟的方法。分钟的方法。任何一个在自动分析仪上的结合胆红素任何一个在自动分析仪上的结合胆红素测定都是不完全的（反应时间太短）测定都是不完全的（反应时间太短）。45结合结合胆红素参与反应和时间的关系胆红素参与反应和时间的关系 测定结合胆红素（测定结合胆红素（DBILDBIL）的推荐方法用）的推荐方法用10 min10 min，并不是说反应完全了，只是：，并不是说反应完全了，只是：10 min10 min的反应将是的反应将是30 min30 min反应的反应的95%95%以上以上。v 1 min1 min为：为：308 308 m mmol/Lmol/L（180
32、 mg/L180 mg/L）；）；v10 min10 min为：为：450 450 m mmol/Lmol/L（263 mg/L263 mg/L）；）；v20 min20 min为：为：462 462 m mmol/Lmol/L（270 mg/L270 mg/L）；）；v30 min30 min为：为：479 479 m mmol/Lmol/L（280 mg/L280 mg/L）。）。46少量少量未结合未结合胆红素胆红素也参与直接反应也参与直接反应 血清中的少量未结合胆红素也会参与直接血清中的少量未结合胆红素也会参与直接反应，因为血清中有尿素、尿酸等。这些反应，因为血清中有尿素、尿酸等。这些物
33、质的存在，具有促使未结合胆红素打开物质的存在，具有促使未结合胆红素打开氢键、参与直接反应的可能。氢键、参与直接反应的可能。按照胆红素的代谢途径，在健康人的血清按照胆红素的代谢途径，在健康人的血清中，只有由清蛋白携带的游离胆红素；被中，只有由清蛋白携带的游离胆红素；被肝脏处理过的结合胆红素经胆管进入肠道，肝脏处理过的结合胆红素经胆管进入肠道，不会进入血液。所以健康人的血清内不应不会进入血液。所以健康人的血清内不应该有结合胆红素。可是，健康人的结合胆该有结合胆红素。可是，健康人的结合胆红素不是红素不是0 0。47结合结合胆红素推荐方法的要求胆红素推荐方法的要求 减少未减少未结合结合胆红素参与直接反
34、应的措施胆红素参与直接反应的措施DoumasDoumas的改良的改良J-GJ-G结合胆红素测定方法要求很高。结合胆红素测定方法要求很高。v首先必须对样品用盐酸酸化，并且要平衡一段时间（首先必须对样品用盐酸酸化，并且要平衡一段时间（5 5 minmin）；）；v重氮反应时间至少重氮反应时间至少10 min10 min（将是（将是30 min30 min反应的反应的9595）；）；v必须作自身空白；必须作自身空白；v及时破坏重氮试剂，避免过多游离胆红素参与重氮反应；及时破坏重氮试剂，避免过多游离胆红素参与重氮反应；v使重氮胆红素在碱性条件下呈蓝色，避免如血红蛋白色素使重氮胆红素在碱性条件下呈蓝色，
35、避免如血红蛋白色素的影响等。的影响等。48重氮直接胆红素的问题小结重氮直接胆红素的问题小结v直接反应胆红素只是结合胆红素的一部分，直接反应胆红素只是结合胆红素的一部分，并且有可能包含了少量的游离胆红素。不同并且有可能包含了少量的游离胆红素。不同检测系统间的结果难以比较。检测系统间的结果难以比较。v所有提供重氮试剂方法的厂商都宣称它们的所有提供重氮试剂方法的厂商都宣称它们的直接反应胆红素都可以和直接反应胆红素都可以和Doumas推荐的直推荐的直接胆红素方法具有良好的可比性。接胆红素方法具有良好的可比性。均属均属虚假。虚假。49结合胆红素和未结合胆红素结合胆红素和未结合胆红素的其他表示方法的其他表
36、示方法v结合胆红素（结合胆红素（conjugated bilirubin，CB、Bc）直接胆红素（直接胆红素（direct bilirubin，DB）、一分钟胆红素）、一分钟胆红素 结合胆红素结合胆红素=dBc+mBcv未结合胆红素（未结合胆红素（unconjugated bilirubin，UB、Bu）间接胆红素（间接胆红素（indirect bilirubin，IB）、非）、非结合结合胆红素、胆红素、游离胆红素游离胆红素vD D-胆红素胆红素（delta bilirubin，d d-Bil、D-Bil、Bd）v总胆红素（总胆红素（total bilirubin，TB、T-Bil）总胆红素总
37、胆红素=Bc+Bu+Bdv新生儿胆红素（新生儿胆红素（neonatal bilirubin，N-Bil）新生儿胆红素新生儿胆红素=Bc+Bu50（二）胆红素氧化酶（二）胆红素氧化酶（BOD）法）法v原理原理：胆红素的最大吸收峰在：胆红素的最大吸收峰在450nm450nm。胆红素氧化酶催化胆。胆红素氧化酶催化胆红素氧化生成胆绿素，使红素氧化生成胆绿素，使450nm450nm吸光度下降，下降程度与胆吸光度下降，下降程度与胆红素浓度成正比。在红素浓度成正比。在pH8.0pH8.0条件下条件下,未结合胆红素及结合胆未结合胆红素及结合胆红素均被氧化，用于测定总胆红素；在红素均被氧化，用于测定总胆红素；在
38、pH=4.5pH=4.5的酸性条件的酸性条件下，下，BODBOD仅能催化结合胆红素和大部分仅能催化结合胆红素和大部分胆红素，而未结合胆红素，而未结合胆红素不被氧化，测定其含量代表结合胆红素。胆红素不被氧化，测定其含量代表结合胆红素。vBODBOD的最适的最适pHpH：在：在pH7.3pH7.39.09.0之间酶活性的之间酶活性的pHpH曲线变化幅度曲线变化幅度不大，但最适不大，但最适pHpH为为8.08.08.28.2。但在测定结合胆红素时，为。但在测定结合胆红素时，为防止防止BuBu反应，选择反应，选择pHpH为为4.54.5，这时样本中，这时样本中mBcmBc、dBcdBc及大部分及大部分
39、胆红素被氧化；胆红素被氧化；pHpH低于低于4.04.0时，血清样本易发生混浊，严时，血清样本易发生混浊，严重干扰测定结果。重干扰测定结果。51优点：优点：v特异性好特异性好v灵敏度高灵敏度高v重复性好，精密度较重氮反应法高重复性好，精密度较重氮反应法高v抗干扰能力优于重氮法抗干扰能力优于重氮法v溶血干扰小溶血干扰小缺点：缺点：试剂较为昂贵试剂较为昂贵 胆红素氧化酶法的优缺点52（三）化学氧化法v钒酸盐胆红素氧化法钒酸盐胆红素氧化法v亚硝酸盐氧化法亚硝酸盐氧化法v综合氧化剂法综合氧化剂法 53钒酸氧化法钒酸氧化法v19931993年由年由KojimaKojima提出，提出，19981998年试
40、剂盒进入我国。年试剂盒进入我国。v在在pH3.0pH3.0时钒酸可将胆红素氧化成胆绿素，其在时钒酸可将胆红素氧化成胆绿素，其在450nm450nm的吸收下降，其下降程度与胆红素的量相关。的吸收下降，其下降程度与胆红素的量相关。v当试剂中表面活性剂改变时可选择地将不同种类的胆当试剂中表面活性剂改变时可选择地将不同种类的胆红素氧化，从而分别测出总胆红素和结合胆红素。红素氧化，从而分别测出总胆红素和结合胆红素。54（四）胆红素反相（四）胆红素反相HPLC(A436 nm)分离法分离法时间时间(min):Bu:mBc:dBc:Bd55（五）（五）BuBcBuBc干片技术原理干片技术原理v实线为实线为B
41、u,Bu,虚线为虚线为Bc.Bc.v反射最大峰反射最大峰:Bu 460,:Bu 460,Bc 420 nm.Bc 420 nm.v在在 400(400(二者反射强二者反射强度相同度相同)和和 460 nm 460 nm(最大反射差最大反射差)阅读。阅读。From Wu T-W,Dappen GM,Spayd RW et al,Clinical Chemistry 1984;30.8:1304-9.56干片技术测定总胆红素干片技术测定总胆红素v测定方式：比色法（双波长）测定方式：比色法（双波长）v波长：波长：54onm 和和 460 v测试时间和温度：测试时间和温度：37 约约 5 分钟分钟v反
42、应过程：反应过程：总胆红素（总胆红素（Bu,Bc,Bd）重氮胆红素色基重氮胆红素色基干片成分干片成分 反应成份：底菲林、重氮盐。反应成份：底菲林、重氮盐。其它成份：染色剂、粘合剂、缓冲剂、表面活性剂、其它成份：染色剂、粘合剂、缓冲剂、表面活性剂、稳定剂和媒染剂。稳定剂和媒染剂。57（六）（六）D D-胆红素测定胆红素测定58不同方法对胆红素的分类不同方法对胆红素的分类HPLC分类分类 a b g d胆红素类型胆红素类型 未结合未结合 单结合单结合 双结合双结合和清蛋白结合和清蛋白结合 传统传统 方法方法 总胆红素总胆红素未结合胆红素未结合胆红素(总结合总结合)结合胆红素结合胆红素 Vitros
43、 方法方法 总胆红素总胆红素Bu（未结合未结合）Bc（结合）（结合）新生儿溶血症（新生儿溶血症（BuBc）D(T-B(T-Bu+Bc)u+Bc)真正真正结合结合胆红素（胆红素（T TBuBu）59（七）胆红素标准液（七）胆红素标准液1.非结合胆红素标准液非结合胆红素标准液 （1）非结合胆红素配制标准液，须用含清蛋白的溶剂配制，常用人混合血清，非结合胆红素配制标准液，须用含清蛋白的溶剂配制，常用人混合血清，对血清的要求如下：对血清的要求如下：收集无溶血、无黄疽、无脂浊的新鲜血清，混合，必要时可用滤菌器过滤。收集无溶血、无黄疽、无脂浊的新鲜血清，混合，必要时可用滤菌器过滤。取过滤后的血清取过滤后的
44、血清1ml，加入新鲜，加入新鲜0.154mmol/L NaCl溶液溶液24ml，混合。在，混合。在414nm波长，波长，1cm光径，以光径，以0.154mmol/L NaCl溶液调零点，其吸光度应小于溶液调零点，其吸光度应小于0.100；在在460nm的吸光度应小于的吸光度应小于0.04。（2）配制标准液的胆红素须符合下列标准：纯胆红素的氯仿溶液，在）配制标准液的胆红素须符合下列标准：纯胆红素的氯仿溶液，在25条件条件下，光径下，光径1.0000.001cm，波长，波长453nm，摩尔吸光系数应在，摩尔吸光系数应在60 7001 600范范围内；改良围内；改良J-G法偶氮胆红素的摩尔吸光系数应
45、在法偶氮胆红素的摩尔吸光系数应在74 380866。3）胆红素标准贮存液（）胆红素标准贮存液（171mol/L）准确称取符合要求的胆红素准确称取符合要求的胆红素10mg，加入，加入二甲亚砜二甲亚砜1ml，用玻璃棒搅拌，使成混悬液。加入，用玻璃棒搅拌，使成混悬液。加入0.05mol/L碳酸钠溶液碳酸钠溶液2ml，使胆红素完全溶解后，移入使胆红素完全溶解后，移入100ml容量瓶中，以稀释用血清洗涤数次并入容量瓶容量瓶中，以稀释用血清洗涤数次并入容量瓶中，缓慢加入中，缓慢加入0.1mol/L盐酸盐酸2ml，边加边摇（勿用力摇动，以免产生气泡）。最，边加边摇（勿用力摇动，以免产生气泡）。最后以稀释用血
46、清定容。配制过程中应尽量避光，贮存容器用黑纸包裹，置后以稀释用血清定容。配制过程中应尽量避光，贮存容器用黑纸包裹，置4冰冰箱箱3d内有效，但要求配后尽快作标准曲线。内有效，但要求配后尽快作标准曲线。602.结合胆红素标准品结合胆红素标准品v合成的二牛磺酸胆红素（合成的二牛磺酸胆红素（DTB）为水溶性化合物，）为水溶性化合物，可与重氮化氨基苯磺酸直接反应，产生吸收光谱可与重氮化氨基苯磺酸直接反应，产生吸收光谱与偶氮胆红素相似的偶氮色素。与偶氮胆红素相似的偶氮色素。v用用J-G法测得的摩尔吸光系数与法测得的摩尔吸光系数与Bu相同。相同。20世纪世纪80年代后期以来，国外结合胆红素测定大多用年代后期
47、以来，国外结合胆红素测定大多用DTB作标准品。作标准品。61第三节第三节 胆汁酸的代谢与检测胆汁酸的代谢与检测 肝细胞将胆固醇转化成胆汁酸肝细胞将胆固醇转化成胆汁酸(Total bile acids,TBA)，随胆汁分泌进入肠道，协助脂类物质随胆汁分泌进入肠道，协助脂类物质的消化与吸收。肠道中约的消化与吸收。肠道中约95%经肠肝循环被重吸收经肠肝循环被重吸收入肝。入肝。血清血清TBA水平水平可反映肝细胞合成、摄取、分泌可反映肝细胞合成、摄取、分泌及胆道排泄功能，是一项敏感的肝功能试验。及胆道排泄功能，是一项敏感的肝功能试验。62一、胆汁酸的分类一、胆汁酸的分类按结构分按结构分：结合胆汁酸结合胆
48、汁酸：游离胆酸与甘氨酸和硫磺酸结合的产物：游离胆酸与甘氨酸和硫磺酸结合的产物按来源分按来源分：初级胆汁酸初级胆汁酸：在肝细胞合成的胆汁酸在肝细胞合成的胆汁酸次级胆汁酸次级胆汁酸：初级胆汁酸在肠管中受细菌作用生成的脱：初级胆汁酸在肠管中受细菌作用生成的脱氧胆酸和石胆酸及其在肝中生成的结合产物氧胆酸和石胆酸及其在肝中生成的结合产物 胆酸（胆酸（cholic acid）脱氧胆酸（脱氧胆酸（deoxycholic acid）鹅脱氧胆酸（鹅脱氧胆酸（chenodeoxy cholic acid）少量的石胆酸（少量的石胆酸（lithocholic acid）；）；游离型胆汁酸游离型胆汁酸63COOHHOO
49、HOHCOOHCOOHOHOH1712241371237胆烷酸胆酸鹅-12-脱氧胆酸19181711941HO2021222324252627567814151623ABCDCONHCH2COOHHOOHOHCONHCH2SO3HHOOH7HOOHCONHCH2COOHCONHCH2SO3HHOOHOH7甘氨胆酸甘氨鹅脱氧胆酸牛磺鹅脱氧胆酸牛磺胆酸64二、胆汁酸代谢二、胆汁酸代谢651.初级胆汁酸的生成初级胆汁酸的生成 胆固醇胆固醇 7羟胆固醇羟胆固醇 初级游离胆汁酸初级游离胆汁酸（胆酸、鹅脱氧胆酸）（胆酸、鹅脱氧胆酸）初级结合型胆汁酸初级结合型胆汁酸（甘氨胆酸、牛磺胆酸、甘氨鹅脱氧胆酸、牛磺
50、鹅脱氧胆酸）（甘氨胆酸、牛磺胆酸、甘氨鹅脱氧胆酸、牛磺鹅脱氧胆酸）7羟化酶羟化酶加氢，羟化，加氢，羟化，侧链氧化，侧链氧化，断链断链 牛磺酸牛磺酸甘氨酸结合甘氨酸结合 662、次级胆汁酸的生成与肠肝循环、次级胆汁酸的生成与肠肝循环初级胆汁酸初级胆汁酸肠道细菌肠道细菌结合胆汁酸结合胆汁酸游离胆汁酸游离胆汁酸7-位脱羟基位脱羟基次级胆汁酸次级胆汁酸 胆酸胆酸脱氧胆酸脱氧胆酸鹅脱氧胆酸鹅脱氧胆酸石胆酸石胆酸67牛磺胆酸转变为脱氧胆酸，甘氨鹅脱氧胆酸转变为石胆酸牛磺胆酸转变为脱氧胆酸，甘氨鹅脱氧胆酸转变为石胆酸68胆汁酸的肠肝循环胆汁酸的肠肝循环 由肠重吸收的胆汁由肠重吸收的胆汁酸（包括初级的和次级酸
