1、Optical innovations in surgery第1页，共26页。背景背景 在外科肿瘤学中，根治性手术的特点是没有切缘阳性，这是改善预后的关键因素。过去十年中，光学的临床转化有了主要的推进，特别是外科手术的荧光成像。荧光成像为外科医生提供可靠的、实时的术中反馈，以确定手术靶点，包括阳性肿瘤边缘。它还可以使术中辅助治疗的决策成为可能，如近距离放射治疗，化疗或新出现的有针对性的光动力疗法（光免疫疗法）。结果结果 图像引导将会是肿瘤外科手术中一个强有力的指导工具。光免疫疗法强调了图像引导手术和疾病后遗症术中治疗的有效结合。多谱的光声断层摄影术，对光学图像引导手术的补充，目前正进行人体试验
2、，预计在外科围手术期和术后的应用具有很大的潜能。结论结论 在术中肿瘤检测和切缘评估的实时光学成像策略方面已经取得了显著进展。光学成像有望实现最高比例的手术切缘阴性，未来十年用于微小转移性疾病的早期检测。第2页，共26页。引言引言图1，临床光学成像的发展。（1940-1950第一次使用造影剂）1947年使用钠荧光素和紫外灯；1958年ICG第一次用于肝脏灌注研究；1994蓝色染料用于乳腺癌前哨淋巴结定位；2019年5-ALA用于恶性神经胶质瘤，以及智能可激活探针的引入；2019年叶酸-FITC用于卵巢癌研究。第3页，共26页。图2，从1990到2019年有关光学成像的出版物，基于搜索词条：术中，
3、光学或者荧光成像，英文。在过去的十年中，手术室里光学成像技术临床应用的研究日益剧增。术中光学成像领域出版物的容量比过去20年的科学文献已翻了一番，特别是在过去的10年里。引言引言第4页，共26页。手术切除结果的直接标准是病理报告。这通常需要4至7天来获得，而病人正在恢复手术。在不完全切除的情况下，对再次手术来说，这不是一个理想的时间。理想情况是外科医生需要在操作过程中直接反馈，这样仍有调整程序的可能来改善预后。一些临床研究已经在外科手术的程序中使用光学造影剂（非靶向性和靶向性）。非靶向性，临床可用染料吲哚菁绿（ICG）已用于淋巴结检测，术中血管造影术，术中胆管造影术和肝转移的可视化。该造影剂的
4、功效基于灌注或增强渗透性和滞留效应，对于特异性肿瘤的勾画是不理想的。最近，基于现有靶向治疗的靶向光学探针已被介绍。引言引言第5页，共26页。超声，MRI，PET/CT，在术前分期和治疗决策制定方面有很大的影响，已显著影响患者的肿瘤治疗和监控，但这些方式不容易在手术室使用。第一部分：外科手术中的光学成像第一部分：外科手术中的光学成像超声1、分辨率小于30m，渗透深度达几厘米；2、视野小，需要与组织接触；3、用于肝外科手术，最近已成功地用于乳腺的保守治疗，降低切缘阳性率。CT1、实现了全身高分辨率显像；2、分辨率（毫米）低于人的视力（约50m）；3、不能检测手术视野中的小病灶。PET1、分辨率不能
5、与人的眼睛或光学方法相比；2、探测器穿透深度更高；3、使用电离同位素需严格操作，防止过度照射，参与者有潜在的危险。光学成像优点：1、可检测比10m更小的病灶；2、提供直接反馈，与传统外科手术视野相关联；3、成本相对较低，具有灵活性，高灵敏度（浅表活性探测，如去除卵巢癌或结直肠癌腹膜转移）；4、非电离，开放的系统；缺点：光子的散射和吸收，NIR穿透深度为1-2cm 光学影像学非常适合手术室使用（图光学影像学非常适合手术室使用（图3；视频视频S1）第6页，共26页。图3，目前以及未来的图像引导手术。在外科手术中，微创（腹腔镜检查，内窥镜检查）和创伤性（开放手术，术中光声成像）光学成像可对医生的检测
6、目的做出指导，如切除后的前哨淋巴结，肿瘤组织和残留病灶，或通过测量灌注和氧合状态对组织的生存力提供信息。第7页，共26页。第二部分：术中光学成像原理第二部分：术中光学成像原理图4，电磁波谱的光学成像。可见光谱（400-750nm）不能穿透组织；近红外光谱（750-1000nm）可穿透组织2cm。近红外是人眼睛不可见的，只有通过具有敏感电荷耦合器件的相机才可以检测到。人可以在视觉光谱（400-750nm）中探测到约50um高分辨率的光。虽然人眼不能区分光谱与波长之间小的间隔，人类可以看到深处，因此能够重建形态和结构特征。但由于它们几乎是相同的颜色，这意味着很难区分不同的对象。就像自然界章鱼保护色
7、作用（视频S2）。因此，用眼睛在切除面检验微观残留病症是不可能的。第8页，共26页。图5，a a 光依赖组织的散射和吸收性能。组织中的光吸收系数依赖于波长以及吸收剂的结果，如血红蛋白，脂类和水。本图的计算是，假设正常含氧组织（饱和70%），血红蛋白浓度为50mmol/L，50%的水和15%的脂质组成。显示了几种常用的荧光染剂和荧光素酶用于成像发光的范围.红光相比于绿光，能穿透更深的组织。b b 实验性小鼠图像，在532和670nm通过一只裸鼠的身体测量光子的数量。与绿光照明相比，近红外范围的信号要更强约四个数量级，说明近红外光子成像的优点。a 吸收波谱 b 小鼠影像 第9页，共26页。a 手术
8、室摄像机b 摄像机原理图图6，图像-引导手术系统临床原型。a 手术室的多光谱荧光相机系统。b 能同时实时捕获三个成像通道的多光谱荧光相机系统的示意图：颜色反射，荧光和内在激发。卤素光源用于白光照明和二极管激光用于荧光的激发。CCD，电荷耦合器件。外科手术中使用的近红外成像过程：视野范围被两种不同的光源照亮。首先，白光光源用于组织的色彩指示，二极管或激光发射光激发荧光光学造影剂，其次，滤过的白光光源和荧光激发光在一定波长下结合，从视野范围发出的光被引导通过光学装置且分到不同的探测器。计算机软件可以重建荧光信号，主要是在彩色图像上覆盖虚拟色彩（图6）。这种装置可适用于近红外腹腔镜或内镜下对食管，胃
9、，小肠远端和结肠的评估。第10页，共26页。敏感的相机系统，荧光染料，或造影剂（探针）是最重要的。不同类型光学造影剂的应用。例如，在视网膜上，荧光素可作为一种血造影术的血池显像剂。ICG用于淋巴结检测或不同器官的灌注，如重建手术中肝，或皮肤/肌肉移植瓣。ICG相比于荧光素的优势与近红外光谱的吸收和散射特性相关。欧洲药品管理局（EMA）和美国食品药品管理局（FDA）批准了ICG和荧光素的临床应用。最近，肿瘤学中特异性肿瘤光学造影剂的发展戏剧性地改变了这个领域。这些探最近，肿瘤学中特异性肿瘤光学造影剂的发展戏剧性地改变了这个领域。这些探针使生物过程可视化，通过靶向重要的肿瘤标记物（图针使生物过程可
10、视化，通过靶向重要的肿瘤标记物（图7），炎症，神经退行性疾病），炎症，神经退行性疾病，传染病和心血管疾病。，传染病和心血管疾病。图7，肿瘤的标志及其光学成像的靶标。EGF，表皮生长因子；NIRF，近红外荧光；PEG，聚乙二醇；cRGD，精氨酸-甘氨酸天冬氨酸循环；VEGF，血管内皮生长因子。IRDye 800cw；AngioSense，IntegriSense，MMPSense和ProSense第11页，共26页。可利用靶标选择标准（TASC）来选择外科肿瘤学的成像剂（图8，表1）。根据它们的特征和评分，针对不同类型的恶性肿瘤选择最合适的生物标记物。总分为18分，表明该生物标记物可能适合靶向的
11、肿瘤成像。以结直肠癌为例，根据TASC系统选定生物标记物：VEGF，癌胚抗原，EGFR，MMPs，上皮细胞粘附分子，粘蛋白1和趋化因子受体4。选定生物标记物后，最好是现有的药物与荧光染料结合。这需要在无任何毒性的前提下，达到最佳的药代动力学和生物分布，导致高信噪比和肿瘤内的均匀分布。成功的临床实例是叶酸异硫氰酸荧光素（FITC）靶向叶酸受体5，贝伐单抗IRDye800cw和西妥昔单抗IRDye800cw。表1，靶标选择标准评分系统一种生物标记物授予7个因素点。最高总成绩是22分。总分为18或更高表明该生物标记物可能适用于肿瘤靶向成像。第12页，共26页。图8，在所示的例子中生物标记物的特征用条
12、纹表示；蓝色旗子代表感兴趣的生物标记物。a 细胞外定位的生物标志物，细胞膜结合或接近肿瘤细胞（评分3-5）。b 靶标通过肿瘤组织的弥漫性上调（评分4）；红十字表示没有生物标记物。c 肿瘤与正常比例大于10的，肿瘤细胞用蓝色，正常细胞用绿色（评分3）。d 大多数患者的生物标记物表达上调（评分0-6）。e先前已成功地应用于体内影像学研究的生物标记物（评分2）。f 酶活性促进激活探针的使用。裂解酶激活成像因子，显示为黄色（评分1）。g 因为成像剂蓄积的探针内化（评分1）。第13页，共26页。第三部分：从实验室到临床的成像研究第三部分：从实验室到临床的成像研究 光学成像对浅表肿瘤很容易可视化，而对更深
13、层的肿瘤，由于脂肪，肌肉或腺体组织的显著重叠则更具挑战性。因为临床级别光学造影剂的开发，价格昂贵和考虑短时风险调控方面，财政和行政规程，光学成像向临床的进展目前已被限制。但临床前动物模型的实验数据证实，在多种肿瘤中，利用荧光标记的肿瘤靶向造影剂可以提高切缘控制和存活；也有人类早期的临床数据（图9）。图9，乳腺癌移植瘤小鼠模型中残留病灶的光学成像。人乳腺癌肿瘤细胞株（MDA-MB-231-luc-D3H2LN）注射到裸鼠乳腺脂肪垫。a 去除皮肤后的彩色图像。b相对应的荧光图像。c 肿瘤切除90%后的HE病理染色（放大10倍）。d 计划的残留肿瘤组织的彩色图像（约10%）。e 相对应的电子荧光图像
14、显示近10%一个额外的点，这是故意留下的，这个点在彩色图像上不可见且为个别地取样。f HE病理染色显示在胸肌顶端一个肿瘤组织小的轮缘（放大5倍）。视频S3,S4。第14页，共26页。因此，建议使用探针靶向体内肿瘤细胞，该探针可分为三大类：非靶向的荧光探针，靶向的荧光探针和靶向的激活探针（图10）。目前这些已经被广泛地用于体内研究，一些探针最近已经开始在手术室使用。图10荧光探针的作用机制。a 造影剂：探针是荧光本身（光照后），根据注射位点，与结构形成对比。例如，当注入循环系统，在血管生成区域它会产生荧光造影。b 靶向探头：探针是荧光本身（光照后），将附着于感兴趣的细胞表面受体。例如，叶酸受体结
15、合异硫氰酸荧光素。c 靶向激活探针：探针本身不发荧光，被酶裂解后发荧光（光照后）。这种类型的探针需要静脉注射。当探针穿过感兴趣的区域时，它就会被酶切割而发荧光。例如市售MMPSense探针，它通过基质金属蛋白酶激活。第15页，共26页。非靶向荧光探针非靶向荧光探针 目前可用于研究和临床应用的有荧光素，ICG，烯酯，甲苯胺蓝和卢戈碘。ICG具有对近红外成像有利的光学性质（805 nm激发，835nm发射），因为它主要通过血红蛋白和脂质吸收，这在近红外区很少发生。目前已在血管生成成像，前哨淋巴结定位成像（图11）中报道，用于各器官血液灌注的研究。图11，乳腺肿瘤周围注射吲哚菁绿后，腋窝前哨淋巴结检
16、测的光学成像。a 荧光信号。b a的虚拟颜色图像。c 相对应的彩色图像。d 彩色图像覆盖的虚拟颜色图像。第16页，共26页。靶向荧光探针靶向荧光探针 肿瘤细胞与正常相邻细胞的显著差异是由于某些基因失调，最终提高了生长信号受体的表达率（图7）。大量的临床前研究已经证实，用荧光标记的抗体，纳米抗体，人工结合抗体或小肽（如精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸，RGD）靶向作用特异性肿瘤受体很可能使肿瘤实时可视化。分别使用荧光基团如FITC和IRDye800CW，被标记的抗体荧光基团可在可见光谱或近红外光谱范围内被可视化。图12，人体卵巢癌的首次成像，全身注射叶酸-FITC靶向叶酸受体。a 彩色图像显示有小肿瘤沉
17、着物的腹膜；有些斑点肉眼几乎不可见。b 同一区域的荧光图像，大多数的肿瘤斑点被照亮。c 彩色图像上叠加荧光图像。d 四个切除样本的彩色图像，包含肿瘤组织和健康组织。e四个切除样本的荧光图像。f 彩色图像上叠加荧光图像。g 与荧光成像相比，肉眼检测出的斑点数目的定量表示。根据三种不同的彩色图像和他们的相应的荧光图，由五位外科医生独立评分。误差线表示2倍标准差。*P0.001（视频S5）第17页，共26页。另一种方法是使用一种治疗性抗体如贝伐单抗，与可溶性配体VEGF-A共同参与诱导肿瘤血管生成。为了实现临床前和临床试验成像，贝伐单抗已被连接单光子发射CT和PET 同位素。目前已实现近红外荧光染料
18、IRDye 800CW与贝伐单抗的结合，这种结合使对体内肿瘤病变的检测具有较高的特异性和灵敏性。头颈癌几个关键的临床前研究结果（如使用西妥昔单抗IRDye800CW和帕尼单抗IRDye800CW靶向表皮生长因子受体）和乳腺癌（如使用曲妥珠单抗IRDye800CW靶向Her2/neu，和贝伐单抗IRDye800CW靶向VEGF-A）使从临床前动物研究向人体应用迅速发展。目前正对乳腺癌，大肠癌（NCT01508572），结直肠癌（NCT01972373，NTR4632）和头颈癌（NCT01987375）患者的可行性进行首次临床评估研究。第18页，共26页。靶向可激活探针靶向可激活探针 寻找可靶向所
19、有肿瘤的通用型受体的机会很小，而且是不切实际的。除了生长信号受体的表达率增加，某些蛋白水解酶的上调是另一个肿瘤侵袭潜在的标志（图7）。通常在灭活状态下被注入，经蛋白酶如组织蛋白酶和基质金属蛋白酶裂解而活化，由此产生的荧光可以测量。Mahmood等人已经开发了很多这样的可激活的近红外探针。该机制主要是大分子装载多重荧光染料并呈现自我猝灭。最近江等人介绍了另一种淬灭机制，基于激活的细胞穿透肽作用机制（CCPs）。在连接肽后，激活的CCPs能够帮助细胞摄取，如荧光剂和治疗剂。当抑制结构域由带负电荷的残基融合CCPs组成时，CCPs的摄取实际上被抑制。将阴离子残基与CCPs（与近红外探针连接）融合借助
20、光解酶底物使恶性组织中丰富的蛋白水解酶可视化，从而增加了术中肿瘤实时检测的肿瘤-背景对比敏感性。第二代这种可激活的CPPs被称为参比可激活的CPPs，其肿瘤-背景信号明显提高，但目前还没有临床原型相机系统可用于临床转化。第19页，共26页。由于切缘阳性率高，因此在根治性切除术后常引起局部复发。为降低切缘阳性，对实时图像-引导手术来说，荧光光学成像似乎是最有前景。光学成像的有效性很大程度上是基于光子的检测。由于组织所成图像的复杂几何形状和密度，荧光图像显示出不同的强度。因为光线穿过组织时会受到各种吸收和散射，在一个受非均匀光吸收支配的环境中，荧光信号的检测是有挑战性的。在这些情况下，涉及光动力疗
21、法（PDT）的光免疫疗法（PIT）是一种很有前景的方法，即光免疫探测与PDT结合就可以实现。十多年来传统的PDT已成为一种治疗方案。在PDT中，光敏剂应用于诊断和治疗。静脉给药后，它在代谢活跃的组织选择性蓄积。接触到适当波长的光时，光敏剂被激发可用于荧光成像，但也产生细胞毒性单重态氧分子，直接杀死周围细胞。该研究被限制主要是因为光敏剂在周围组织摄取的脱靶，对正常组织造成明显的损害。此外，确定治疗深度并实现肿瘤的成功清除可能是非常困难的。因此，这不被认为是一种合适的治疗方式，且目前仅用于肿瘤的姑息治疗，经不起治愈性治疗的考验。第四部分：未来方向第四部分：未来方向 光免疫疗法光免疫疗法第20页，共
22、26页。图13，术中光免疫疗法。a 光免疫疗法提供的肿瘤术中光免疫探测。b 在手术中通过光疗法可以治疗视觉不能探察的或显微的肿瘤丝条。PIT用光敏剂耦联单克隆抗体直接靶向肿瘤特异性抗原。与传统的PDT相比，通过利用单克隆抗体作为光敏剂递送的赋形剂可能会更有效，且对周围正常组织产生更小的损伤。由于传统PDT的局限性，一般不考虑其单一治疗的有效性，但在切除术后阳性切缘的检测与治疗中，它作为一种辅助的术中创面处理可能是非常有效的。在未来近红外荧光引导手术中，PIT可能是一个非常有前景的治疗方法。实现手术室集成化的实时成像与对肿瘤细胞的选择性杀害，使肿瘤边界可视化，同时用辅助的PIT治疗残余浸润性疾病
23、（图13）。第21页，共26页。光声成像光声成像 近红外光学成像受到光在生物组织中强烈散射的限制，这严重降低立体分辨率。光声成像技术可在高达几厘米的深处进行高分辨率光学成像。由于热膨胀，其对光吸收的检测借助于超声的发射。特别是使用多个光波和光谱混合像元分解算法，称为多光谱光声层析成像（MSOT），提供识别特异性吸收剂的能力，包括内源性组织发色团（如血红蛋白、黑色素、脂类）、有机染料同样用于荧光成像（ICG，IRDye 800CW），以及一系列新型的光吸收纳米颗粒（金纳米棒，碳纳米管）。第22页，共26页。光声成像光声成像图14，多光谱光声层析成像（MSOT）。a 无创成像的实时MSOT系统手持
24、式成像探针。b 光声成像原理。一个短脉冲的光（纳秒范围内）被组织内部吸收并产生超声波层，在无创的前提下被检测到。c 在小鼠肿瘤模型上，血红蛋白成像使肿瘤血管可视化。红色表示含氧血红蛋白和蓝色表示去氧血红蛋白。d小鼠肾脏覆盖 的 绿 色 显 示 近 红 外 染 料 成 像（IRDye800CW羧化物）；灰度背景基于血红蛋白的对比。为使光声成像系统适合于临床应用，实时掌上操作的发展，已使该系统在形式和操作上类似于临床超声技术系统（图14a）。该系统可在手术室快速成像，并以直播图像的形式提供即时反馈。此外，多波长光源能够快速调谐到若干个不同的波长，使组织吸收剂或外源性成像剂的光谱分辨率都被检测到。小
25、型化的系统使其在动物研究中胃肠道内镜成像中使用，并预期在不久的将来实现在人体的研究。第23页，共26页。不同来源的光声图像的对比有望带来一系列的临床应用。血红蛋白对比可用于评估肿瘤脉管系统（图14c）以及组织或器官灌流。黑色素对比可用于淋巴结黑色素瘤转移的检测和测量原发性黑色素瘤深度。脂质的检测提供了潜在的动脉粥样硬化斑块的鉴定而且改善了风险级别。比如乳腺癌，因为乳腺组织相对容易渗透近红外光线，且不依赖于乳腺密度。肿瘤可以通过血红蛋白对比使它们血管密度增加，从而被检测到。对致密乳房患者，与早期胸部肿瘤X射线透视法相比，光声成像有可能提高敏感性；与超声检查相比，光声成像有可能提高特异性。MSOT
26、外源性的造影剂包括对荧光成像的研究（图14 d）。ICG和亚甲蓝检测已经在许多不同的方案中得以描述。MSOT使用近红外染料结合靶向配体的分子成像，已经在动物模型上证实。因此，不久的将来有可能通过光声成像对药物进行临床试验研究。广泛的新型的纳米颗粒也被认为是光声成像。由于每种形式的纳米粒子剂的安全不得不在复杂的调控过程中评估，在短期内看到这些药物用于人类是不可能的。第24页，共26页。讨论讨论 影像学对手术的实施非常重要。如超声检查，CT，MRI和PET都有缺点。它们不适合肿瘤沉着物（转移）检测的实时反馈，这是它们在术中使用的主要弊端。实现实时的术中肿瘤可视化可以提高患者的预后和生存，通过辅助治
27、疗协助完成更全面的肿瘤切除术。因此，为实现术中肿瘤评估的另一种新型光学成像方法正在被研究。靶向研究可以通过靶向各种肿瘤标记物来检测肿瘤；非靶向研究通过利用增强的渗透性和滞留效应使肿瘤可视化。总之，大多数的研究集中于利用肿瘤本身所固有的特性，在正常和癌变组织之间提高视觉分界。浸润性肿瘤边界可用近红外荧光剂成像，通过蛋白水解酶激活来参与细胞外基质的降解，这是肿瘤浸润的先决条件。肿瘤细胞各自的生长因子受体表达率不同，可以靶向肿瘤特异性受体产生高信噪比。第25页，共26页。光学成像向临床转化的第一步正在欧洲和北美进行。在外科肿瘤学中，图像引导肿瘤手术有可能在患者护理的指导方面成为一个非常强大的工具。然而，在实施过程中必须关注它的有效性，精确度以及成像系统和探针的标准化，根据临床级GMP生产，质量控制以及与稳定性相关的标准操作规程。组织复杂的几何形状和可变的密度可能会损害荧光信号的检测。PIT，特别是光声成像，这些可能是有前景的创新成像技术会避免该问题的发生。PIT提供了光免疫探针和光疗法不能探察的荧光；光声成像基于组织内部光的吸收，从而产生可以被检测到的超声波层，促使高分辨率的光学评估。预计未来5年，将出现许多图像-引导手术领域中针对各类肿瘤的临床研究，使在某些常规程序中的使用增加，如前哨淋巴结检测。第26页，共26页。
